Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных

¦ные после   ¦           ¦       ¦      ¦        ¦      ¦      ¦        ¦
¦нарезки     ¦           ¦       ¦      ¦        ¦      ¦      ¦        ¦
¦            ¦           ¦       ¦      ¦        ¦      ¦      ¦        ¦
¦Масло сливо-¦     -     ¦   -   ¦  -   ¦  0,01  ¦  -   ¦   -  ¦   25   ¦
¦чное        ¦           ¦       ¦      ¦        ¦      ¦      ¦        ¦
¦            ¦           ¦       ¦      ¦        ¦      ¦      ¦        ¦
¦Масло       ¦     -     ¦   -   ¦  -   ¦   -    ¦5 куб.¦   -  ¦    -   ¦
¦растительное¦           ¦       ¦      ¦        ¦  см  ¦      ¦        ¦
-------------+-----------+-------+------+--------+------+------+---------

При высокой обсемененности овощей их обжаривают. При повышенной обсемененности овощного сырья усиливают его термическую обработку, т.е. направляют на изготовление соусов. Проверяют также режим хранения овощей. Овощное сырье с измененными органолептическими свойствами, имеющее затхлый запах, а также следы плесневения, для производства не допускается.

При обнаружении золотистых стафилококков в растительном масле его подвергают прогреванию при 120 град. C в течение 30 мин. Одновременно проводят тщательную санитарную обработку маслопроводов. Для снижения обсемененности сушеных овощей, крупы, желатина, агара их тщательно промывают, дают воде стечь, подсушивают, а крупу после промывки варят. Муку пассируют. Такую муку можно использовать для панировки при обжарке рыбы и для выпечки кулинарных изделий. При высокой обсемененности соли ее прокаливают при температуре 150 град. C 15 мин. или при 100 град. C 30 мин.

Яйца перед употреблением моют сначала теплой водой с добавлением 1 - 2-процентной кальцинированной соды, затем 0,5-процентным раствором хлорамина и ополаскивают теплой водой. Мойка яиц производится в специально выделенном месте в сырьевом отделении.

12. ОТБОР ПРОБ И ПОДГОТОВКА ИХ К АНАЛИЗАМ

Отбор проб производят согласно ГОСТ 26668-85 "Пищевые и вкусовые продукты". В случае отсутствия норм отбора проб на какой-то конкретный вид продукции, объем, массу пробы берут в соответствии с нормативно-технической документацией на этот продукт и настоящей Инструкцией.

Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб для физико-химических и органолептических анализов.

Количество единиц упаковки, подлежащих вскрытию, устанавливается действующими стандартами, ОСТами, ТУ и т.п. на соответствующие продукты. Если на продукты отсутствуют стандарты или ТУ, вскрывают 5% единиц упаковки от общего их количества в партии, но не менее 5 единиц.

Перед отбором пробы готовой продукции необходимо осмотреть всю партию, затем вскрыть отдельные единицы упаковки и, дав органолептическую оценку (внешний вид, цвет, запах, консистенция, вкус), отобрать пробу.

Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом: ножом, ложкой, щупом, пинцетом, пробоотборником в стерильную посуду, закрытую двумя слоями бумаги и обвязанную бечевой, или упаковывают в стерильную бумагу.

От продукции в потребительской таре в мелкой расфасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской упаковки.

От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

От жидкой, пастообразной продукции после перемешивания отбирают часть пробы в стерильную емкость пробоотборником или ковшом с длинной ручкой.

От сыпучих продуктов отбор производят после перемешивания их из различных точек. От сыпучих материалов, упакованных в мешки, пробы отбирают стерильным щупом, стараясь охватить все слои.

От продуктов смешанной консистенции пробы отбирают так, чтобы в них входили все компоненты в том соотношении, в котором они находятся в продукте.

Если пробы предусмотрено исследовать за пределами лаборатории предприятия, составляется акт отбора проб по установленной форме, в котором указывают наименование продукта, номер партии, номер образца и дату отбора.

Для скоропортящихся продуктов интервал во времени между отбором образцов и анализом должен быть сокращен до минимума. Такие образцы можно хранить при температуре от 0 до 4 град. C не более 6 ч. В случае отбора проб в ходе технологического процесса интервал во времени между отбором проб и исследованием также должен быть максимально сокращен.

Подготовку проб, разведения продуктов готовят согласно ГОСТ 26669-85 "Пищевые и вкусовые продукты". Перед анализом из всей отобранной пробы подготавливают однородную массу путем измельчения, перемешивания, растирания. Образцы измельчают ножницами, скальпелем в электрических гомогенизаторах (микроизмельчителях), в ступках. Выбор способа измельчения зависит от вида продукта, его консистенции. Растирание продуктов твердой консистенции успешно производится с помощью стерильного кварцевого песка.

Продукты, содержащие жиры, нагревают на водяной бане, в термостате или в сушильном шкафу до температуры 40 - 45 град. C и перемешивают.

Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри тела рыбы или куска до 0 град. - 1 град. C.

    Навеску отбирают    в   количестве   10   г   из   усредненной
подготовленной пробы и добавляют  к  ней  постепенно  90  куб.  см
жидкости   для   разведения,   получая,  таким  образом,  исходное
              -1
разведение (10  ).  Полученную  взвесь  хорошо  перемешивают   или
взбалтывают  и  оставляют  при комнатной температуре на 3 - 5 мин.
Исследуют надосадочную жидкость.  При необходимости приготавливают
последующие  разведения,  при  этом  используют  каждый  раз новую
пипетку.  Для пищевых продуктов жидкой и полужидкой консистенции 1
куб.  см  исследуемого  продукта  вносят  в  9 куб.  см стерильной
                                                         -1
жидкости для разведения, получая исходное  разведение (10  ).  Для
исследования  на  сальмонеллы  и парагемолитические вибрионы пробы
сырья и продукции из гидробионтов отбирают с  частью  кишечника  и
жабер. Из усредненной пробы отбирают навеску в 25 г.
    В основном    продукты   разводят   в   пептонно-солевом   или
физиологическом растворе (изотоническом растворе хлорида  натрия),
если  продукты  содержат  более 6%  соли - в 0,1-процентном водном
растворе пептона (пептонной воды).  Разведение мясных  и  молочных
продуктов готовят на физиологическом растворе.
    Массу пробы можно определять и  объемным  методом.  Для  этого
берут   специально   подготовленные  стаканы,  на  стенки  которых
наносится нарезка - черта на уровне 100 куб. см. В стакан наливают
90  куб.  см  стерильной  жидкости  для разведения.  Среднюю пробу
размельченного   продукта   вносят   в   стаканы   в   количестве,
обеспечивающем  подъем  жидкости  до  уровня  нанесенной  черты по
                                      -1
нижнему мениску, получая разведение 10  .

12.1. Отбор образцов и подготовка к анализу сырья (свежей, охлажденной и мороженой рыбы, морских беспозвоночных, молок, икры) и полуфабрикатов

Мелкие рыбу, нерыбные объекты морского промысла, ястыки, молоки и т.д. отбирают в количестве 3 - 10 шт. из разных мест исследуемой партии во взвешенную стерильную колбу, вновь взвешивают и по разности весов устанавливают массу отобранной пробы. Затем наливают стерильную жидкость в таком количестве, чтобы получить разведение 1:10. Если это не удается, учитывают в дальнейшем расход смывной жидкости.

Крупную рыбу и крупные экземпляры нерыбных объектов морского промысла отбирают в количестве не более 3 шт. От каждого экземпляра из нескольких мест вырезают кусочки с кожей и мышцами, не затрагивая кишечник (за исключением отбора проб на определение парагемолитических вибрионов), площадью около 4 кв. см, толщиной 4 - 5 мм и помещают в колбу. Далее поступают так, как при исследовании мелких объектов. Допускается с крупных экземпляров рыб, молок и ястыков для определения общего микробного числа делать смывы тампоном, смоченным стерильной жидкостью, с разных мест поверхности общей площадью 100 кв. см. Затем тампон погружают в емкость, содержащую 100 куб. см стерильной жидкости, встряхивают 2 - 3 мин. и приступают к анализу.

Отбор средней пробы икры-сырца в ходе технологического процесса производится из трех мест обследуемой партии общей массой около 100 г.

Разрезанные и посоленные ястыки исследуют путем отбора 2 - 3 кусочков из разных мест общей массой 100 г.

Рыбу, объекты морского промысла после разделки и мойки отбирают небольшими кусками или вырезают небольшие кусочки от больших кусков массой не более 300 г (молоки - не более 100 г).

Пробы от мороженой рыбы в целом виде или от замороженных сырых полуфабрикатов, в т.ч. молоки и икру, отбирают от 3-х блоков (мест) по 2 - 3 кусочка (икру и молоки около 100 г). Отобранную пробу дефростируют перед приготовлением навески при температуре 2 - 5 град. C. Навеску отбирают сразу после размораживания, но не позднее, чем через 18 ч от начала дефростации. Продукты однородной консистенции допускается размораживать при температуре 18 - 20 град. C в течение 1 ч или в термостате при температуре 35 град. C не более 15 мин.

Образцы мороженых фаршевых изделий (мороженый фарш, паста "Океан" и др.) отбирают из трех брикетов (мест) по 2 - 3 кусочка из поверхностных слоев и внутренней части массой около 200 г в банку. Пробы перед анализом полностью размораживают при температуре 2 - 5 град. C в той емкости, в которой были доставлены в лабораторию. Пасту "Океан" допускается размораживать в термостате при 35 град. C.

Пробы рыбного фарша, приготовленного на производстве, отбирают из разных мест общей массой около 200 г.

Икра до пастеризации отбирается в количестве около 100 г.

12.2. Отбор проб и подготовка к анализу рыбной кулинарии

Общая масса отобранной пробы должна составлять около 300 г. Если масса продукта в потребительской таре находится в этих пределах, то берут одну единицу упаковки из попавших в выборку и используют ее содержимое для анализа. Если масса продукта в потребительской таре больше массы пробы (т.е. > 300 г), берут часть содержимого упаковки из разных мест.

Пробы гомогенизируют или растирают и отвешивают навеску 10 г для получения десятикратных разведений.

При исследовании пастообразных продуктов, содержащих жир, используемую для приготовления гомогената и разведений жидкость необходимо прогреть до 40 град. C. Отобранную пробу тщательно перемешивают, отбирают 10 г в 90 куб. см стерильной жидкости для приготовления последовательных разведений.

Колбасные изделия отбирают в количестве 1 - 3 экземпляров в зависимости от размеров в стерильную бумагу. Перед анализом поверхность изделий в оболочке протирают и фламбируют спиртом. Из 3 шт. мелких колбасных изделий или одного крупного батона берут пробу без оболочки в количестве не менее 300 г. Для этого вскрывают оболочку, продольно разрезают батон на две половины и, отступая от края примерно 5 см, из боковых и центральных частей половины батона вырезают куски.

Для приготовления кулинарных изделий к исследованию можно пользоваться также объемным методом.

12.3. Отбор проб и подготовка к анализу копченой рыбы и продуктов копчения

Пробы готовой продукции (рыба целиком неразделанная, разделанная, куски, тушка, балычок и т.д.) отбираются после упаковки в тару из трех единиц транспортных упаковок (ящиков) общей массой не более 500 г. Если продукция находится в потребительской таре весом менее 500 г (полиэтиленовых мешках, коробочках, металлических или полимерных банках), то для анализа отбирается 1 - 2 - 3 ед. упаковки без нарушения ее целостности так, чтобы масса пробы не превышала 300 г. Перед анализом банку необходимо вымыть, просушить, металлическую - обжечь спиртом, полимерную - обтереть спиртом, полностью вскрыть, все содержимое измельчить.

Из крупной рыбы (1 - 3 шт.), рулетов, теши, боковника и т.д. вырезают поперечные куски массой не более 300 г. Для анализа продукцию горячего копчения измельчают вместе с кожей, а холодного - без кожи, в том и другом случаях не затрагивая кишечник. Перед снятием кожи с рыбы необходимо поверхность объекта протереть спиртом. Берут навеску 10 г и вносят в 90 куб. см жидкости для разведений.

12.4. Отбор проб и подготовка к анализу пресервов

Пробы пресервов отбирают через 2 ч после закатки банок. Для анализа берут 2 банки. Каждая банка анализируется в отдельности.

При анализе пресервов пряного или специального посола пробу отбирают из тузлука. Предварительно пресервы тщательно встряхивают. Из пресервов в масле, соусах, где, как правило, небольшое количество жидкой фазы, содержимое банки смешивают с равным количеством 0,1-процентного раствора пептонной воды, которую учитывают при анализе, перемешивают, затем готовят десятикратные разведения. Из пастообразных пресервов отбирают навески по 10 г, которые вносят в 90 куб. см жидкости для приготовления разведений.

12.5. Отбор проб и подготовка к анализу соленой, пряной, маринованной рыбы (бочковой)

Мелкая рыба отбирается в количестве 3 - 10 экземпляров, измельчается целиком, растирается. От крупных экземпляров (2 - 3 шт.) с двух сторон вырезаются мышцы вместе с кожей вдоль позвоночника, не затрагивая кишечник. Достаточно при анализе крупных экземпляров рыб производить отбор по одной половине каждого экземпляра.

12.6. Отбор проб и подготовка к анализу вяленой рыбы

Мелкую рыбу отбирают (3 - 10 шт.) из разных мест обследуемой партии. Пробу составляют из целых экземпляров рыб, предварительно сняв с них кожу в стерильных условиях. От 3 - 4-х экземпляров крупной рыбы после снятия кожи вырезают 6 - 8 поперечных кусочков толщиной 1,0 - 1,5 см от приголовной, средней и хвостовой частей (не затрагивая кишечник). Пробу измельчают, гомогенизируют, отвешивают навеску 10 г и помещают в 90 куб. см жидкости для приготовления разведений.

12.7. Отбор проб и подготовка к анализу икорной продукции

Отбор проб икры, расфасованной в бочки, проводят щупом из верхнего, среднего и нижнего слоев. Для анализа отбирают до 3% единиц расфасовки, но не менее трех бочек. Общая масса среднего образца должна быть около 100 г.

Для выборки икры, расфасованной в металлические банки с надвигающимися крышками вместимостью от 500 куб. см и более, отбирают по ассортименту (осетр, белуга, севрюга) по 3 банки разных переделов и составляют среднюю пробу массой 50 г.

Отбор зернистой и паюсной икры, идущей на экспорт, производят из трех банок одного передела выборочно по виду обработки, расфасовки, консерванту от каждых пяти дат выработки общей массой 50 г. От навески 50 г передается 25 г для исследования на сальмонеллы.

При расфасовке икры в металлическую, стеклянную или другую тару вместимостью до 300 куб. см отбирают по 1 ед. расфасовки.

Пастеризованная икра берется на анализ по каждому виду тары и по ассортименту в количестве около 100 г (3 одноунцовые банки, 2 двухунцовые и 1 трехунцовая) <*>. При этом как из трех банок, так и из двух составляются средние пробы.

--------------------------------

<*> Одноунцовая банка 26 г, двухунцовая - 56 г, трехунцовая - 112 г.

Ястычную икру (соленую, вяленую, копченую) в потребительской таре, полиэтиленовых мешках или картонных коробках отбирают, вырезая несколько кусочков из разных мест общей массой 100 г.

При определении сальмонелл в икре дополнительно берется навеска около 100 г.

Белковая икра отбирается в количестве 1 банки по каждому виду тары и по ассортименту.

    Отобранную среднюю  пробу тщательно перемешивают (икра - зерно
целое),  растирают (паюсная,  белковая икра), измельчают (ястычная
икра) и отбирают в стерильную емкость навески икры массой 10 г.  К
навеске добавляют 0,1-процентный раствор  пептонной  воды  до  100
                                             -1
куб. см.  Это будет исходное  разведение  (10  )  для  определения
общей  бактериальной обсемененности.  Подготовленный неразведенный
продукт можно высевать непосредственно в питательные среды.

Жестяные или стеклянные банки с икрой, герметически укупоренные под вакуумом, перед анализом тщательно моют в теплой воде, высушивают и определяют герметичность по ГОСТ 8756.18-70 (аппаратом Бомбаго).

При исследовании туб с завинчивающимися пластмассовыми бушонами, банок из полимерных материалов герметичность определяют визуально.

12.8. Отбор проб и подготовка к анализу водорослей и их продуктов

Водоросли сушеные, агар пищевой, альгинат натрия отбирают из разных мест каждой вскрытой упаковки (вскрывают 5% от партии) с поверхностных и глубинных слоев массой не более 200 г.

    Из подготовленной пробы отвешивают по 1 г в стерильные емкости
(250 куб.  см) и  заливают  стерильной  жидкостью  (99  куб.  см),
                           -2
получая сразу разведение 10   и оставляют на 10 мин. (водоросли) и
на 30 мин.  (агар,  альгинат натрия).  Берется небольшая  исходная
навеска  вследствие  того,  что  в  воде  эти  продукты набухают и
увеличиваются  в  объеме.  Такие  продукты  можно   суспензировать
вначале  в стерильном пищевом масле в соотношении 1:10,  затем 1,0
куб.  см полученной суспензии перенести в жидкость для  разведения
                                                 -2
при постоянном помешивании, получая разведение 10  .

Оборотную воду (для промывки студня) отбирают в количестве 10 куб. см и вносят в 50 куб. см питательной среды.

12.9. Отбор проб и подготовка к анализу вспомогательных материалов

Сыпучие материалы. Пробу соли, сахара, пряностей, сушеных овощей, муки, крупы и других сыпучих материалов, хранящихся в мешках, кулях, ящиках, пакетах, составляют из отдельных выемок, взятых от 5% упаковок, но не менее чем из пяти единиц. Пробу соли, хранящейся навалом, составляют из отдельных выемок, взятых щупом в 6 различных местах бурта. Отобранные выемки тщательно вмешивают и квартованием выделяют среднюю пробу. Общая масса средней пробы составляет не более 300 г, исключение составляют пряности и сушеные овощи, масса проб которых 50 и 100 г соответственно. В отличие от других материалов при анализе сушеных овощей для получения исходного разведения отвешивают 1 г, заливают 99 куб. см пептонной воды или физиологического раствора. Для определения микробиологических показателей в сахаре и соли используют 10-процентный раствор сахара и 1-процентный раствор соли.

Пробу желатина, казеина пищевого и сухого цельного молока отбирают из 10% упаковок обследуемой партии, но не менее чем из трех единиц расфасовки в количестве 50 г. Желатин после измельчения отвешивают в количестве 10 г, заливают 90 куб. см 0,1-процентного водного раствора пептона. После набухания в течение 1 - 1,5 ч при температуре 5 - 10 град. C желатин расплавляют на водяной бане (при температуре 40 град. C), постоянно взбалтывая до его полного растворения, и приступают к анализу.

Пробу казеина пищевого заливают 90 куб. см 2-процентного стерильного раствора двухзамещенного фосфорнокислого калия (K2HPO4), имеющего pH 8,4 и подогретого до 37 град. C. Колбу помещают в водяную баню с температурой 37 град. C на 20 - 25 мин., постоянно помешивая, затем приступают к анализу. Для первого разведения казеина используется 2-процентный раствор фосфорнокислого калия с pH 8,4, а для всех последующих разведений - с pH 7,4.

Томат-пасту отбирают в емкости из 5% упаковок обследуемой партии, но не менее чем из 5 ед.

Отварные овощи и вареные яйца отбирают в количестве 100 - 150 г.

Меланж. При исследовании партии меланжа отбирают 1% банок (но не менее шести). После мойки банки фламбируют, вскрывают и отбирают из всех банок не менее 50 г продукта в емкость, в которой дефростируют. Пробу размораживают на водяной бане (при температуре 48 - 50 град. C) при частом встряхивании и сразу исследуют.

Яйца куриные (сырые). При исследовании партии яиц отбирают 1% от партии (но не менее шести штук). Яйца обмывают теплой водой щеткой с мылом, дают воде стечь и погружают в этиловый спирт на 10 мин. После испарения спирта обжигают пламенем. На остром конце яйца делают стерильным скальпелем отверстие диаметром около 1 см и тоже обжигают. Содержимое яйца выливают в широкогорлую колбу и перемешивают с помощью стеклянных бус палочкой или пипеткой. Для определения сальмонелл берут 25 г (куб. см) гомогенизированной пробы.

Масло сливочное. Пробы отбирают из трех упаковок по 2 противоположных по диагонали куска массой каждый около 20 г (на расстоянии 3 - 5 см от края). Масло перед исследованием расплавляют в стеклянном стерильном сосуде на водяной бане при температуре 40 - 45 град. C, перемешивая до получения однородной консистенции. Жидкость для разведения также подогревается.

Пробы растительного масла отбирают стерильным черпаком из 10% упаковочных единиц (контейнеры, бочки и т.п.), но не менее чем из четырех общим объемом 200 куб. см. При наличии в партии менее четырех единиц упаковки пробу отбирают от каждой упаковки. При отборе проб из резервуара, оснащенного краном, кран сначала промывают, фламбируют смоченной в спирте и зажженной ватой, спускают часть масла и отбирают пробу.

Жидкие материалы - ланспиг, соус, заливку, тузлук и пастообразные отбирают в количестве около 100 куб. см (г).

13. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ

Микробиологические исследования включают определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (колиформные бактерии), золотистых стафилококков, плесневых грибов и дрожжей, сульфитредуцирующих клостридий, сальмонелл, парагемолитических вибрионов, бактерий рода протеев, спор мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (термостабильных бацилл мезофилов).

13.1. Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ)

Метод микробиологического анализа по определению количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов основан на подсчете колоний, выросших на питательных средах при термостатировании посевов при температуре 30 град. C с образованием колоний в течение 72 ч, видимых при увеличении в 2 раза.

Подготовленную пробу тщательно перемешивают. Взвесь отстаивают в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для приготовления последующих разведений.

                                                   -1
    1 куб. см материала из исходного разведения (10  ) переносят в
пробирку  с  9  куб.  см  стерильного раствора для разведений,  не
прикасаясь к поверхности жидкости в  этой  пробирке,  перемешивают
новой  стерильной  пипеткой  и  содержимое в количестве 1 куб.  см
переносят в следующую пробирку и  т.д.  В  результате  исследуемый
продукт  оказывается  разведенным в 10,  100 и более раз.  Степень
разведения навески для высева на плотные среды выбирают так, чтобы
общее количество колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах
от 30 до 300.  В чашку Петри вносят  по  1  куб.  см  разведенного
продукта  или  смыва,  заливают  расплавленным  и остуженным до 45
град.  агаром (15 - 20 куб.  см);  размешивают.  После  застывания
агара  чашки переворачивают и помещают в термостат при температуре
30 град.  C на 72 ч. При необходимости допускается предварительный
учет  колоний  через  48  ч  с  последующим  подсчетом через 72 ч.
Обработку  результатов  культивирования  проводят  согласно   ГОСТ
26670-85.  Количество микроорганизмов в 1 г (1 куб.  см,  кв.  см)
рассчитывают по формуле:

                                 AB
                             K = --,
                                 C

где: K - количество микроорганизмов в 1 г (куб. см, кв. см), КОЕ;

A - среднее арифметическое число колоний в чашке;

B - разведение;

C - масса, объем, поверхность (г, куб. см, кв. см).

Для вычисления среднего арифметического нельзя использовать посевы, где количество выросших колоний на чашках менее 30. Если при посевах оказалось, что во всех разведениях на засеянных чашках менее 30 колоний, в результатах анализа рекомендуется написать: "Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)". При отсутствии роста колоний результаты выражают таким образом: "Количество микроорганизмов менее 1". Если на чашках, более чем на 1/2 их площади, имеется рост спорообразующих микроорганизмов или за счет споровых микроорганизмов подсчет изолированных колоний невозможен, в результате анализа следует написать: "Рост спорообразующих микроорганизмов". Результаты выражают в колониеобразующих единицах - КОЕ (г, кв. см, куб. см). Методика определения количества бактерий в воздухе производится в разделе 1.

13.2. Определение плесневых грибов и дрожжей

Метод основан на способности плесневых грибов и дрожжей расти на селективных средах в аэробных условиях при термостатировании посевов при температуре 25 град. C.

По 1 куб. см исходного разведения, полученного при определении общей бактериальной обсемененности, высевают в чашки Петри и заливают по 15 - 20 куб. см одной из питательных сред: сусло-агаром, Сабуро, синтетической с антибиотиками. Чашки вверх крышками ставят в термостат при температуре 25 град. C. Через 5 суток просматривают посевы.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Рост дрожжей сопровождается образованием выпуклых, блестящих, серовато-белых, кремовых колоний с ровным краем.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопирование. Результаты микроскопирования оценивают по ГОСТ 10444.12-88.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При определении в некоторых продуктах наличия или отсутствия плесневых грибов высевают непосредственно продукт и его разведения в 5 - 7 куб. см питательной среды Сабуро. Посевы термостатируют при температуре 25 град. C в течение 5 сут.

13.3. Определение бактерий рода протеев

Метод основан на способности бактерий рода протеев расти на питательных средах в виде ползучего вуалеобразного опалесцирующего налета с образованием гнилостного запаха. 1 г (1 куб. см) продукта высевают в рыбопептонный бульон. Посев помещают в термостат при температуре 37 град. C. Через 20 - 24 ч для определения бактерий рода протеев 2 капли из рыбопептонного бульона вносят в конденсационную воду свежескошенного рыбо- или мясопептонного агара, не касаясь поверхности среды. Засеянные пробирки (вертикально) помещают в термостат с температурой 37 град. C. Через 18 - 24 ч посевы просматривают, обращая внимание на образование ползущего вверх вуалеобразного налета с голубоватым оттенком. При проходящем свете заметно роение колонии, культура опалесцирует и издает неприятный гнилостный запах.

13.4. Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек сбраживать в среде Кесслер лактозу с образованием кислоты и газа. В этой группе определяются 5 родов энтеробактерий (E. coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Seratia).

Бактерии группы кишечных палочек (БКГП) - это аэробные и факультативно-анаэробные грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 град. C в течение 24 ч (бродильная проба), не обладающие оксидазной активностью.

Для определения БКГП 10 г продукта и 10 куб. см (1 г) исходного разведения продукта засевают во флаконы со 100 и 40 - 50 куб. см питательной среды соответственно. 1 куб. см и 0,1 куб. см и т.д. исходного разведения продукта засевают в пробирки с 5 куб. см питательной среды. Засевается то количество продукта, в котором нормируется отсутствие бактерий группы кишечных палочек. Допускается засевать 1 г продукта в 8 - 10 куб. см питательной среды.

Для определения БКГП в смывной жидкости с оборудования и рук тампоны или марлевые салфетки опускают в пробирки с 5 куб. см среды Кесслер. Посевы инкубируют при температуре 37 град. C. Через 18 - 24 ч из газ-положительных пробирок и колб со среды Кесслер проводят посев на плотную дифференциальную среду Эндо и инкубируют при температуре 37 град. C в течение 24 ч.

При наличии на среде Эндо колоний (красных с металлическим блеском и без него, розовых), характерных для группы кишечных палочек, производят их изучение. Из изолированных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных без спор палочек делают заключение о присутствии БКГП. Желательно при обнаружении грамотрицательных, не образующих спор палочек выполнить также оксидазный тест. Для этого колонии со среды Эндо наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин., если бактерии имеют оксидазу.

При обнаружении бесцветных (лактозоотрицательных) колоний на чашках с агаром Эндо во избежание пропуска патогенных бактерий семейства кишечных палочек указанные чашки должны передаваться в лаборатории санитарно-эпидемиологических станций для дальнейшего изучения.

13.5. Определение золотистых стафилококков

Метод основан на выявлении характерного роста бактерий на элективных средах, изучении морфологических свойств, постановке теста плазмокоагуляции.

    В пробирку с 6 - 7 см солевого  рыбопептонного  бульона  (6,5%

                                                         -1
NaCl)  вносят  1 г продукта или 1 куб.  см разведения (10  ).  При
исследовании продуктов,  содержащих большое количество соли (свыше
5%),  дополнительно  производят  посев  в  1-процентный  глюкозный
рыбопептонный бульон.  Посевы помещают в термостат при температуре
37 град.  C на 18 - 24 ч. Из сред обогащения (солевого, глюкозного
бульонов) производят посев  на  элективные  среды:  желточно-  или
молочно-солевой агар или среду Байрд-Паркер <*>. Посевы инкубируют
при 37 град. C в течение 24 ч.

--------------------------------

<*> Среда Байрд-Паркер в модификации института питания АМН.

Подозрительные на стафилококки колонии (непрозрачные, золотистые, кремовые, эмалевые, лимонно-желтые, имеющие форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре, слегка выпуклые на молочно- и желточно-солевом агаре с радужным венчиком вокруг колоний, черные, блестящие с узким белым краем, окруженные прозрачной зоной - на среде Байрд-Паркер) микроскопируют с окраской по Граму по ГОСТ 18963-73, отсевают на скошенный агар и инкубируют при температуре 37 град. C 18 - 24 ч. Число колоний, взятых для идентификации, не должно быть менее пяти. Стафилококки положительно окрашиваются по Граму, имеют шарообразную форму с диаметром 0,6 - 1 мк и располагаются часто в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. С односуточной культурой ставят реакцию плазмокоагуляции.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 куб. см плазмы (лучше кроличьей), разведенной изотоническим раствором хлорида натрия (физиологическим раствором) в пропорции 1:5 (1 куб. см плазмы + 4 куб. см физиологического раствора), вносят петлю суточной культуры стафилококка. Для контроля одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 град. C. Учет результатов плазмокоагуляции проводят через 2 ч. Реакция считается положительной, если сгусток образовался в течение 24 ч.

Существуют дополнительные тесты идентификации золотистых стафилококков, которые используются, когда требуется подтверждение неясных результатов при наличии санитарно-эпидемиологического неблагополучия.

Дополнительные тесты включают: постановку реакций на термостабильную ДНКазу, лецитовителлазу, разложение маннита в анаэробных условиях, определение активности кислой фосфатазы (Методические указания по санитарно-биологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами, 1984 г.).

В случае необходимости для определения количественного содержания коагулазоположительных стафилококков в 1 г продукта к 10 г подготовленной пробы прибавляют 90 куб. см стерильной жидкости, тщательно перемешивают, оставляют на 3 - 5 мин. Из надосадочной жидкости готовят разведения 1:100, 1:1000. По 0,2 куб. см исследуемого материала не менее чем из трех последовательных разведений высевают на поверхность подсушенных (в термостате) элективных сред и растирают шпателем (по 5 чашек Петри на одно разведение). Посевы термостатируют при температуре 37 град. C в течение 24 - 48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и отбирают чашки, в которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для стафилококков. Отмечают типичные колонии и посевы вновь помещают в термостат на сутки. Через 48 ч из 3 - 5 типичных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии подсчитывают. Находят общее арифметическое число колоний на пяти чашках одного разведения, умножают на 5 и степень разведения продукта (10, 100 и т.д.).

13.6. Определение сульфитредуцирующих клостридий (сульфитвосстановителей)

Метод основан на способности клостридий вызывать почернение питательной среды определенного состава в результате образования сернистого железа.

Навеску продукта массой 1 г или его разведений 1:10 (0,1 г), 1:100 (0,01 г) вносят в пробирку с 10 - 13 куб. см питательной среды: сульфитполимиксиновой или Вильсон-Блера, предварительно расправленной и остуженной до 45 град. C, или Китт-Тароцци.

Инкубацию проводят при температуре 37 град. C 20 - 24 ч. При наличии роста клостридий в средах Вильсон-Блера, сульфитполимиксиновой образуется почернение. Из среды Китт-Тароцци, где наблюдается рост, пастеровской пипеткой производят пересев на дно стерильной пробирки и заливают расплавленной средой Вильсон-Блера высоким столбиком. При росте сульфитредуцирующих клостридий в результате восстановления сернистокислого натрия происходит взаимодействие его с хлористым железом, среда чернеет за счет образования сернистого железа. Изготавливают мазки-препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно в виде цепочек или скоплений параллельных клеток (забором). При спорообразовании споры овальные или сферические, центральные, субтерминальные или терминальные. Сульфитредуцирующие клостридии каталазы не образуют, являются строгими анаэробами.

Каталазная реакция: к части культуральной жидкости добавляют 10-процентный раствор едкой щелочи или 10-процентный раствор соляной кислоты в таком количестве, чтобы питательная среда приобрела нейтральную реакцию (по индикаторной бумажке). Затем обезжиренной пипеткой 0,5 куб. см жидкости переносят на профламбированное, обезжиренное и охлажденное до комнатной температуры предметное стекло, а затем другой пипеткой добавляют каплю 3-процентного раствора перекиси водорода. Если в течение 3 мин. пузырьки газа не появились, считается, что микроорганизмы каталазы не образуют.

Отрицательная проба на каталазу свидетельствует о присутствии в среде облигатных анаэробных микроорганизмов.

13.7. Определение бактерий рода сальмонелл

Метод основан на способности бактерий рода сальмонелл на дифференциально-диагностических средах образовывать специфические колонии и давать реакцию агглютинации с сальмонеллезными сыворотками.

К бактериям рода сальмонелл относятся грамотрицательные палочки с закругленными концами, длина варьирует от 1 до 3 мк, ширина от 0,5 до 0,6 мк. Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Оптимальная температура роста 37 град. C, реакция среды слабощелочная (pH 7,2 - 7,4). Сальмонеллы подвижны.

Навеску продукта в количестве 25 г засевают в 100 куб. см среды обогащения (магниевую или селенитовый бульон).

Посевы помещают на 18 - 20 ч в термостат при температуре 37 град C.

На второй день из сред обогащения делают высев в чашки Петри на плотные дифференциально-диагностические среды: Висмут-сульфит агар (BCA), среду Плоскирева, Левина или Эндо. Перед посевом среду необходимо подсушить в термостате. Чашки термостатируют при температуре 37 град. C в течение 15 - 18 ч со средами Эндо и Плоскирева и 48 ч со средой BCA.

На BCA сальмонеллы образуют черные (или коричневые) с металлическим блеском колонии, цвет среды под колониями черный. Исключение составляют S. paratyphi, S. cholerae suis и ряд других, растущих в виде мелких серовато-зеленых колоний с черным центром и без него. Кишечная палочка образует бесцветные, зеленоватые или серые колонии или не дает роста.

На среде Эндо колонии сальмонеллы бесцветные, слабо-розовые, выпуклые, блестящие. На средах Плоскирева и Левина колонии прозрачные, голубоватые, бледные или нежно-розовые.

С дифференциально-диагностических сред отсевают несколько колоний на трехсахарный агар с мочевиной или среду Клиглера с мочевиной. Посевы делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом (два раза) в глубину столбика. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 град. C 24 ч. Учитывают способность культуры ферментировать глюкозу, лактозу и мочевину. Для сальмонелл характерно разложение глюкозы с образованием газа. Лактозу и мочевину не разлагают. Готовая среда - трехсахарный агар с мочевиной имеет розовато-малиновый цвет. Отсутствие изменения цвета скошенной поверхности указывает на то, что лактоза и сахароза не разлагаются исследуемой культурой. Желтое окрашивание столбика, образование газа (разрывы) и сероводорода (почернение) указывает на рост бактерий из рода сальмонелл.

Желательно со среды Клиглера или с трехсахарного агара отсевать на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар, и среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой, рыбо- или мясопептонным бульоном для определения индола и сероводорода. Под пробку с бульоном помещают бумажки, смоченные уксуснокислым свинцом для определения сероводорода и раствором щавелевой кислоты для определения образования индола. Посевы термостатируют при температуре 37 град. C в течение 24 ч.

Таким образом, к сальмонеллам относятся бактерии, не разлагавшие лактозу, сахарозу и мочевину, ферментирующие глюкозу, маннит и мальтозу с образованием газа, продуцирующие сероводород и не образующие индол. Для окончательного заключения у выделенных культур должны быть изучены серологические свойства.

Сальмонеллы обладают двумя основными антигенными комплексами. Различают жгутиковые (H) антигены и соматические (O). Антигенная структура сальмонелл расшифровывается с помощью монорецепторных H- и O-сывороток.

Серологические свойства изучают путем постановки реакции агглютинации на стекле односуточной культуры, выделенной с трехсахарного агара, с поливалентной агглютинирующей адсорбированной сальмонеллезной O-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с этой сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих адсорбированных O-сывороток. При помощи поливалентной сальмонеллезной O-сыворотки устанавливается принадлежность исследуемой культуры к одной из серологических групп сальмонелл. Для определения серологического типа культур используют H-монорецепторные сыворотки первой и второй фаз.

Для реакции агглютинации с O-сыворотками берут односуточную культуру с верхней части, с H-сыворотками - с нижней части скошенного питательного агара.

В случае положительной реакции агглютинации с монорецепторными O-, H-сыворотками делают окончательный вывод о присутствии в исследуемом образце сальмонелл.

13.8. Определение спор мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (термостабильных бацилл мезофилов)

Метод микробиологического анализа заключается в подсчете колоний путем высева в чашки Петри прогретого материала или учете роста при высеве определенного его количества в жидкие питательные среды и термостатировании посевов в аэробных условиях при температуре 30 град. C.

Подготовленную пробу кипятят в течение 5 мин.

Во время прогревания уровень воды в бане должен быть выше уровня питательной среды. После окончания прогрева пробу охлаждают до 40 град. C, делают ряд разведений и высевают в чашки Петри.

Пробу прогретой оборотной воды после промывки студня при производстве пищевого агара непосредственно вносят в рыбопептонный бульон. Посевы термостатируют при температуре 30 град. C 72 ч.

13.9. Определение парагемолитических вибрионов

Метод основан на выявлении типичных колоний на дифференциально-диагностических средах определенного состава и установлении принадлежности бактерий к парагемолитическим вибрионам по морфологическим и биохимическим свойствам.

Для определения количества парагемолитических вибрионов в 1 г продукта делают высев из разведений.

    Для приготовления  разведений  из  усредненной  пробы отбирают
навеску массой 25 г и дополнительно растирают с кварцевым песком в
стерильной  ступке  или  гомогенизируют  в  размельчителе  тканей.
Добавляют 225 куб. см  0,1-процентной пептонной воды с 3%  хлорида
                     -1
натрия (разведение 10  ), размешивают,  отстаивают  в   течение  5
мин., из надосадочной жидкости готовят последующие разведения.
    Чтобы получить  высев,  0,1  г продукта засевают из разведения
  -1
10   по 0,2 куб.  см надосадочной жидкости на 5  чашек  с  плотной
                                                                -2
дифференциально-диагностической  средой (ДДА).  Из разведения 10
высевают  по  0,1  куб.  см  на  две   параллельные   чашки,   что
соответствует  посеву  по  0,001  г  продукта на одной чашке.  При
необходимости засевают последующие разведения.  Посевы  инкубируют
при  температуре  37  град. C  в течение 24 ч.  Производят подсчет
типичных  колоний.  На  ДДА  вибрионы   образуют   плоско-выпуклые
полупрозрачные  колонии  круглой формы с ровными краями,  влажной,
гладкой блестящей поверхностью голубовато-зеленого цвета от 1 до 5
мм  в  диаметре.  Результаты  роста  на  ДДА  оценивают  следующим
образом.
    Отсутствие роста  парагемолитических  вибрионов  на  всех пяти
                              -1
чашках посева из разведения 10    означает,  что  в  одном  грамме
парагемолитические   вибрионы   отсутствуют   или   содержатся   в
количестве менее 10 клеток.
    Обнаружение роста 10 - 50  типичных  колоний  на  5  чашках  с
                        -1
посевом из разведения 10   при  отсутствии  роста на двух чашках с
                                 -2
посевом    при    разведении   10   указывает,  что в 1 г продукта
содержится  от 100 до 500 жизнеспособных клеток парагемолитических
вибрионов.

Для выявления присутствия парагемолитических вибрионов в 25 г продукта подготовленную пробу в количестве 25 г переносят в 100 куб. см жидкой среды обогащения. Посевы помещают в термостат при 37 град. C. Через 18 - 24 ч производят пересев на плотную дифференциально-диагностическую среду. Чашки инкубируют при 37 град. C в течение 24 ч. Выявляют типичные колонии парагемолитических вибрионов.

Для подтверждения принадлежности выделенных на дифференциально-диагностических средах микроорганизмов к парагемолитическим вибрионам проводят изучение морфологических свойств и ставят биохимические тесты.

Парагемолитические вибрионы - мезофильные грамотрицательные палочки, прямые или слегка изогнутые, не образующие спор, активно подвижны, содержат цитохромоксидазу, не расщепляют лактозу и сахарозу, растут на питательных средах с содержанием хлорида натрия от 3 до 8%, декарбоксилируют лизин, образуют индол, ферментируют (без газообразования) арабинозу, глюкозу, мальтозу, не образуют ацетилметилкарбинол.

Для идентификации бактерий делают пересев с ДДА в 1-процентную пептонную воду с 3% хлорида натрия (рост на пептонной воде: помутнение с образованием нежной голубой пленки) и на ДДА.

Готовят мазки, окрашивают по Граму (ГОСТ 18963-73, в модификации Хукера - ГОСТ 10444.1-84) и изучают морфологию клеток.

Подвижность определяют при микроскопировании фазовоконтрастным методом в раздавленной капле или при посеве уколом в полужидкий агар (0,25% агара), содержащий 3% хлорида натрия. Засевают односуточную бульонную культуру и инкубируют при температуре 37 град. C в течение 24 ч. Подвижные формы образуют диффузное помутнение, слабоподвижные вырастают по ходу укола.

Декарбоксилазную активность устанавливают в среде ДАГВ с лизином. Для этого делают посев в пробирки с этой средой по 0,1 - 0,2 куб. см односуточной культуры или по 2 петли агаровой культуры (1-я пробирка с аминокислотой-лизином и 2-я - контрольная). После посева в каждую пробирку добавляют по 0,5 куб. см стерильного вазелинового масла, помещают в термостат при температуре 37 град. C и наблюдают. Обычно реакция проходит через 24 ч. При отрицательной реакции происходит только окисление глюкозы. Среда становится желтой. Если микроорганизмы вырабатывают декарбоксилазу к аминокислоте, то после окисления глюкозы происходит подщелачивание среды и она становится темно-фиолетовой. Парагемолитические вибрионы дают в тесте на лизин декарбоксилазную положительную реакцию.

Образование декарбоксилазы к лизину является отличительным признаком от образующих газ представителей рода Aeromonas, среди которых есть галофильные вибрионы.

Образование индола определяют путем посева односуточной культуры в 5 куб. см среды (1-процентная пептонная вода с 3% хлорида натрия) в пробирках. Под пробкой помещают специально приготовленные бумажки на индол. Инкубируют при температуре 37 град. C в течение 24 ч. При росте парагемолитических вибрионов образуется индол, бумажки изменяют цвет.

Для определения цитохромоксидазы односуточную культуру засевают на поверхность щелочного агара (pH 8), содержащего 3% хлорида натрия. Термостатируют при температуре 37 град. C в течение 18 ч. Затем наносят на выросшую культуру в чашке 1 каплю реактива для определения цитохромоксидазы или делают штрих из колонии на фильтровальной бумаге, смоченной этим реактивом. Если оксидазный тест положительный, через 1 - 3 мин. наблюдается окрашивание в ярко-синий цвет. Наличие цитохромоксидазы является отличительным признаком от семейства кишечных палочек, которые не обладают оксидазной активностью.

Отношение к лактозе и сахарозе определяют путем засева штрихом культуры по скошенной поверхности и уколом в столбик среды, содержащей 3% хлорида натрия, лактозу, сахарозу и индикатор. Инкубируют при температуре 37 град. C в течение 18 ч. Парагемолитические вибрионы цвет среды не изменяют, газ не образуют (не расщепляют лактозу и сахарозу). Можно использовать среды Клиглера, Ресселя.

Для определения галофильных свойств исследуемую культуру засевают в 5 куб. см 1-процентной пептонной воды (pH 7,8) без содержания и с содержанием 3%, 8%, 10% хлорида натрия. Термостатируют посевы при температуре 37 град. C в течение 24 ч. Парагемолитические вибрионы активно развиваются в средах, содержащих 3%, 8% хлорида натрия, и не дают роста в средах, не содержащих хлорида натрия и содержащих 10% соли и более.

Способность образования ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра) определяют следующим способом. Исследуемую культуру засевают в глюкозофосфатный бульон Кларка с 3% хлорида натрия, термостатируют при температуре 37 град. C в течение 24 ч. Затем к 1 куб. см посева добавляют 0,6 куб. см альфа-нафтола (6-процентный раствор в спирте) и 0,2 куб. см 40-процентного раствора едкого калия (KOH), пробирку хорошо встряхивают и вновь помещают в термостат на 1 ч. Так как парагемолитические вибрионы не образуют ацетилметилкарбинол, цвет среды не изменяется.

Для определения интенсивности кислотообразования (реакция Кларка) засевают исследуемую культуру в среду Кларка с 3% хлорида натрия, термостатируют при температуре 37 град. C в течение 24 - 48 ч. При наличии роста добавляют 2 - 3 капли 0,04-процентного раствора метилового красного (0,04 г метилового красного растворяют в 40 куб. см этилового спирта и 60 куб. см дистиллированной воды), встряхивают и помещают в термостат на 1 ч. При сильном кислотообразовании среда окрашивается в красный цвет, при слабом - в желтый. Парагемолитические вибрионы в 84% случаев дают положительную реакцию.

Для определения ферментативной активности односуточную культуру засевают на среды Гисса с 1% углеводов и с 3% NaCl (пестрый ряд), инкубируют при температуре 37 град. C 18 - 24 ч. При расщеплении углеводов с образованием кислых продуктов распада цвет среды изменяется, при образовании газа последний собирается в поплавке. Парагемолитические вибрионы ферментируют без образования газа глюкозу, мальтозу, арабинозу.

Для вибрионов характерно расщепление глюкозы с образованием кислоты без газа как в анаэробных (в высоком столбике), так и в аэробных условиях на среде Хью-Лейфсона в пробирках. Определение типа расщепления глюкозы позволяет отличать вибрионы от сходных с ними по морфологии представителей рода Pseudomonas и Lomonomonus.

Для идентификации вибрионов можно использовать системы индикаторные бумажные (СИБ).

14. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ

Питательные среды готовят в эмалированной или стеклянной посуде.

Если в технологии приготовления питательных сред не указаны условия растворения питательных сред или компонентов, то их растворяют при перемешивании в воде комнатной температуры до полного растворения не менее 15 мин. и затем при необходимости нагревают.

Необходимое значение pH питательных сред устанавливают в растворах комнатной температуры с помощью растворов с массовой концентрацией 10 г/куб. дм гидроокиси натрия или 20 г/куб. дм лимонной кислоты, или раствором соляной кислоты объемной концентрацией 25 куб. см/куб. дм, прибавляя при перемешивании по каплям реактив к среде и определяя значение pH в периодически отбираемой пробе потенциометрически или с помощью индикатора. При подщелачивании среды щелочью значение pH после кипячения и стерилизации снижается примерно на 0,2, а при приготовлении сред с настоем печени - на 0,3 - 0,4. Поэтому при приготовлении сред устанавливают pH на 0,2 - 0,4 ед. выше заданного, кипятят, пока pH не понизится на 0,2 - 0,3, снова проверяют pH и стерилизуют в автоклаве. Обязательно проверяют pH после стерилизации.

Готовые питательные среды хранят при комнатной температуре не более 3 суток и при температуре около 4 град. C не более одного месяца, если нет специальных указаний.

14.1. Растворы (жидкости) для приготовления разведений

Пептоная вода 0,1-процентная и 1-процентная

1 г или 10 г пептона растворяют при нагревании в 1 куб. дм дистиллированной воды, фильтруют, устанавливают pH 7,0 +/- 0,1. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Пептонно-солевой раствор

8,5 г хлорида натрия и 1 г пептона растворяют при нагревании в 1 куб. дм дистиллированной воды, фильтруют, устанавливают pH 7,0 +/- 0,1. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Физиологический раствор

8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 куб. дм дистиллированной воды, фильтруют. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

14.2. Питательные среды

14.2.1. Среды для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Рыбопептонный агар

15 - 20 г агара добавляют к 1 куб. дм рыбопептонного бульона и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Рыбопептонный бульон

10 г пептона и 5 г хлорида натрия добавляют к 1 куб. дм рыбной воды. Устанавливают pH 7,0 - 7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин. В случае выпадения осадка бульон вторично фильтруют с последующей стерилизацией.

Рыбная вода

Очищенное от костей и кожи мясо трески, судака, пикши, скумбрии, щуки пропускают через мясорубку, заливают холодной водой (водопроводной) из расчета 1 куб. дм воды на 500 г фарша. Смесь фарша с водой медленно нагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 ч. Для определения готовности рыбной воды фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр (если жидкость прозрачная, то вода считается готовой). Затем жидкость процеживают через полотно, сюда же отжимают весь сок из вареного фарша, доливают водой до первоначального объема, разливают в посуду и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Среды из сухого питательного агара:

    - сухой  питательный  агар  производства  Ставропольского  НИИ
вакцин и сывороток. Способ приготовления дается на этикетке.
    - сухой питательный агар (производства ДагНИИПС)   - 35,0 г
    Сухой экстракт кормовых дрожжей                    - 2,5 г
    Глюкоза                                            - 1,0 г

    Вода дистиллированная                              - 1 куб. дм

Готовят среду, устанавливают pH 7,0, фильтруют. Стерилизуют при (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

14.2.2. Среды для определения плесневых грибов и дрожжей

Сусловый агар

Неохмеленное солодовое сусло разбавляют примерно в 2 раза дистиллированной водой (плотностью в среднем 8 - 10 град. Blg). К 1 куб. дм разбавленного сусла прибавляют 20 г агара. Среду расплавляют на водяной бане и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по флаконам и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

После расплавления непосредственно перед посевом сусловый агар подкисляют 2 - 3 куб. см стерильного раствора 20-процентной лимонной кислоты (pH агара 4,5).

Среда Сабуро

В 1 куб. дм дистиллированной воды растворяют при нагревании 20 г агара, 10 г пептона и 40 г мальтозы или глюкозы, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин. Среду можно хранить в холодильнике до 7 дней.

Синтетические среды с антибиотиками

Готовят по ГОСТ 10444.12-88.

14.2.3. Среды для определения бактерий группы кишечных палочек (колиформных)

Среда Кесслер

К 1 куб. дм дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 куб. см бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20 - 30 мин., фильтруют через вату, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем дистиллированной воды до 1 куб. дм, устанавливают pH 7,4 - 7,6, добавляют 2 куб. см 1-процентного водного раствора генциан-виолета, разливают в пробирки с поплавками по 8 - 10 куб. см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 10 мин. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет. Медицинскую желчь, готовую к употреблению, можно приобрести в аптеке.

Среда Кесслер с лактозой (из сухого препарата)

Способ приготовления дается на этикетке.

Среда Эндо

Готовят из сухой питательной среды. Способ приготовления дается на этикетке.

14.2.4. Среды для определения золотистых стафилококков

Солевой бульон

В 1 куб. дм рыбо- или мясопептонного бульона растворяют 65 г хлорида натрия, фильтруют, устанавливают pH 7,0 - 7,2. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин. Количество хлорида натрия можно увеличить до 90 г.

Глюкозный бульон

В 1 куб. дм рыбо- или мясопептонного бульона растворяют 10 г глюкозы, фильтруют, устанавливают pH 7,0 - 7,2. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Желточно-солевой агар по Чистовичу

К 1 куб. дм стерильного расплавленного и охлажденного до 45 - 60 град. C рыбо- или мясопептонного агара, содержащего 100 г хлорида натрия (pH 7,2), асептически добавляют 200 куб. см стерильной желточной эмульсии. После тщательного перемешивания агар разливают в чашки Петри.

Эмульсия яичного желтка

Яйцо с поверхности протирают 96-процентным этиловым спиртом, асептически извлекают желток и смешивают его с 200 куб. см стерильного физиологического раствора.

Молочно-солевой агар

К 1 куб. дм расплавленного и охлажденного до 45 - 60 град. C рыбо- или мясопептонного агара, содержащего 65 г хлорида натрия (pH 7,2 - 7,4), добавляют асептически 100 куб. см стерильного обезжиренного молока. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Молоко обезжиренное

Молоко доводят до кипения, оставляют на сутки в холодильнике, освобождают от сливок, вторично доводят до кипения. Вновь оставляют на 1 сут. в холодильнике и снимают верхний слой. Можно молоко обезжирить центрифугированием. Разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (116 +/- 1) град. C в течение 20 мин. Молоко не должно иметь коричневого оттенка.

Агар солевой (из сухого препарата)

К солевому агару добавляют эмульсию яичного желтка для получения желточно-солевого агара или молоко для получения молочно-солевого агара.

Агар типа Байрд-Паркер

В 1 куб. дм дистиллированной воды размешивают 30 г сухого питательного агара на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей (производства ДагНИИПС), добавляют 10 г пирувата натрия, 5 г хлористого лития. Нагревают при помешивании и кипятят в течение 1 мин. до полного растворения ингредиентов. Устанавливают pH 7,2. Стерилизуют при (121 +/- 1) град. C в течение 15 мин.

Перед употреблением в растопленную и охлажденную до 45 - 50 град. C среду асептически добавляют (из расчета на 100 куб. см среды) 0,5 куб. см 2-процентного раствора теллурита калия и 5 куб. см эмульсии яичного желтка.

Цитратная плазма кролика

Для реакции плазмокоагуляции препарат выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.

14.2.5. Среды для определения бактерий рода протеев

Рыбо- или мясопептонный агар

14.2.6. Среды для определения сульфитредуцирующих клостридий

Среда Вильсон-Блера

К 100 куб. см стерильного расплавленного и охлажденного до температуры 80 град. C рыбо- или мясопептонного агара, содержащего 1% глюкозы, добавляют 10 куб. см 20-процентного раствора сернистокислого натрия (Na2SO3) и 1 куб. см 5-процентного раствора железо-аммонийных квасцов (Fe(NH4) x (SO4) x 12H2O) (можно заменить 1 куб. см 8-процентного раствора железа сернистокислого (FeSO4) pH среды 7,5 - 7,8).

Растворы солей готовят непосредственно перед употреблением и стерилизуют текучим паром в течение 1 ч.

Сульфит-поликсиновая среда (СПН) Сидоренко-Пивоварова

В 1 куб. дм печеночного бульона или другого любого стерильного питательного жидкого субстрата (казеиново-грибная среда и др.) асептически вносят заготовленные стерильными 5 куб. см 10-процентного водного раствора сульфата железа закисного (FeSO4), 10 куб. см 10-процентного водного раствора сульфита натрия (Na2SO3), полимиксина М-200000 ЕД, сульфата неомицина В-50 мг. Разливают в стерильные пробирки по 9 куб. см.

Печеночный бульон

500 г мелко нарезанной говяжьей печени кипятят в 1 куб. дм дистиллированной воды в течение 1 ч. Устанавливают pH 7,0 и вновь кипятят в течение 10 мин. Затем процеживают через ткань, доводят объем до 1 куб. дм и добавляют 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Среда Китт-Тароцци

В пробирки, заполненные на 1,0 - 1,5 см кусочками вареной рыбы, вареного мяса или вареной печени, наливают высоким столбиком рыбо-, мясопептонный или печеночный бульон с 1% глюкозы. На поверхность среды в пробирки наслаивают 0,5 - 1,0 куб. см вазелинового масла. Можно готовить агаризованную среду, добавив 0,15% агара. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин. pH среды 7,1 +/- 0,1 (проверяют до и после стерилизации).

При приготовлении среды Китт-Тароцци без добавления вазелинового масла или агара после посева на поверхность среды наслаивают голодный агар.

При использовании среды в течение 3 сут. с момента приготовления добавлять вазелиновое масло, агар или голодный агар не обязательно.

Голодный агар

2 г агара растворяют при нагревании в 98 куб. см дистиллированной воды. Стерилизуют при (121 +/- 1) град. C в течение 20 мин.

Приготовление кусочков печени впрок

Печень режут на куски весом 30 - 40 г, заливают водопроводной водой из расчета 1 куб. дм воды на 500 г печени и кипятят в течение 15 - 20 мин. Затем воду сливают и печень разрезают на более мелкие кусочки по 1 - 3 г, заливают 5-процентной содовой водой и кипятят в течение 10 - 15 мин. Печень промывают под струей водопроводной воды в течение 1 ч, ополаскивают дистиллированной водой, раскладывают во флаконы, заливают дистиллированной водой и стерилизуют в течение 20 мин. при температуре (121 +/- 1) град. C. До стерилизации pH кусочков печени должен быть 7,0 - 7,2.

14.2.7. Среды для определения сальмонелл

Магниевая среда

Среда состоит из трех растворов

    I.   Пептон                                      - 4,2 г
         Натрия хлорид                               - 7,0 г
         Дрожжевой экстракт                          - 20 куб. см
         Калий фосфорнокислый однозамещенный
         (безводный) (KH2PO4)                        - 1,5 г
         Вода дистиллированная                       - 890 куб. см
    Растворяют при кипячении и прибавляют растворы II и III.
    II.  Хлористый или сернокислый магний
         кристаллический                             - 36,0 г
         Вода дистиллированная                       - 90 куб. см
    III. 0,1-процентный водный раствор
         бриллиантового зеленого                     - 5 куб. см

Смесь растворов соединяют, разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) град. C в течение 30 мин.

Дрожжевой экстракт

1 кг прессованных пекарских дрожжей размельчают в двух куб. дм дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 град. C в течение 30 мин. и оставляют в холодильнике при температуре 4 - 5 град. C в течение 4 - 5 сут. Надосадочную жидкость разливают во флаконы по 50 - 100 куб. см. На каждые 100 куб. см экстракта добавляют 1,25 куб. см 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают в автоклаве при 100 град. 30 мин. Экстракт можно готовить из сухих дрожжей. Методика приготовления так же (на 1 кг сухих дрожжей надо 6 куб. дм дистиллированной воды). Экстракт лучше хранить в холодильнике.

Селенитовая среда

Среда состоит из двух растворов

    I.  Натрий фосфорнокислый однозамещенный
        (безводный) (NaH2PO4)                        - 3,0 г
        Натрий фосфорнокислый двухзамещенный
        (безводный) (Na2HPO4)                        - 7,0 г
        Пептон (чешский, венгерский или немецкий)    - 5,0 г
        Лактоза                                      - 4,0 г
        Вода дистиллированная                        - 1 куб. дм
    pH раствора 6,8 - 7,1. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1)
град. С в течение 30 мин.
    II. Натрий селенистокислый кислый (NaHFeO3)
        (без примеси теллура)                        - 10,0 г
        Вода дистиллированная стерильная             - 100 куб. см

Стерилизация не требуется. Раствор может храниться в холодильнике в течение 1 - 2 мес.

Для получения рабочей среды непосредственно перед посевом к 100 куб. см раствора 1 добавляют 4 куб. см раствора II.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: