Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109

О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации

Индивидуальная защита органов дыхания. Защитные персональные маски типа матерчатых или бумажных хирургических предотвращают распространение микроорганизмов, захватывая крупные жидкие частицы около рта или носа, но не обеспечивают защиту от вдыхания подсохших капельных ядер аэрозолей.

Респираторы - это специальные виды масок безопасности. Они плотно прилегают к лицу, предотвращая просачивание воздуха через боковые отверстия. Медицинским работникам противотуберкулезных учреждений и лабораторий рекомендуется использовать респираторы, обеспечивающие 95%-ную задержку аэрозольных частиц диаметром 0,3 мкм. Эффективность респираторов снижается при увлажнении и загрязнении, поэтому их хранят завернутыми в чистую ткань, а не в сохраняющих влагу пластиковых пакетах.

2.4.2. Правила приема диагностического материала

Поступающие для исследования пробы материала принимают на отдельном столе, соблюдая следующие правила:

- прием поступающих проб и их осмотр следует, по возможности, проводить в одноразовых перчатках и масках;

- перед тем как открыть транспортировочный контейнер, необходимо протереть его наружную поверхность тампоном, смоченным соответствующим дезинфицирующим средством (например, 5% раствором хлорамина или гипохлорита);

- аккуратно открыть крышку контейнера и проверить, нет ли следов протечки материала на поверхности флаконов. Ни в коем случае не использовать поврежденные флаконы (разбитые или с трещинами) - уничтожить их (автоклавирование или кипячение) и запросить новый образец, отметив в сопроводительном бланке;

- проверить наличие идентификационных номеров на флаконах с материалом и сверить их с номерами в сопроводительных документах;

- продезинфицировать внутреннюю поверхность транспортировочного контейнера;

- после работы с флаконами уничтожить одноразовые перчатки и вымыть руки с мылом;

- выдать водителю обменную стерильную посуду;

- подписать сопроводительные документы;

- занести в регистрационный лабораторный журнал сведения о каждом пациенте и полученном от него материале.

Бланки направлений следует подвергнуть стерилизации в сухожаровом шкафу в течение 30 минут при 85 °C.

2.4.3. Оценка качества и количества мокроты

При исследовании мокроты пациентов с подозрением на туберкулез понятие "качественная мокрота" имеет конкретное определение. Качественной является свежевыделенная мокрота из глубоких отделов дыхательных путей с минимальными примесями слюны или носоглоточной слизи. Наилучшим для исследования считают образец мокроты, в котором имеются слизистые или слизисто-гнойные комочки, белесоватые включения. Сероватый, желтоватый или бурый цвет мокроты также может характеризовать качественный материал. Для исследования достаточно 3 - 5 мл мокроты, но хорошие результаты могут быть получены и при исследовании меньших объемов мокроты.

Индуцированная, т.е. полученная при аэрозольных ингаляциях или других манипуляциях, мокрота напоминает по внешнему виду и консистенции слюну. Важно, чтобы этот материал по ошибке не был удален как непригодный для исследования. Поэтому в сопроводительном документе необходимо отмечать, каким образом получен материал для анализа.

2.4.4. Техника безопасности при работе с диагностическим материалом

При работе с заразным материалом необходимо иметь в виду, что работа с диагностическим материалом является одним из самых опасных этапов микробиологического исследования. Туберкулез распространяется воздушно-капельным путем через содержащие возбудитель мельчайшие аэрозольные частицы, диаметр которых составляет 1 - 5 мкм. Именно эти мельчайшие частицы составляют ту фазу аэрозоля, которая способна при дыхании проникать в легочные альвеолы и оседать в них, формируя начало инфекционного процесса. В лабораторной работе усилия должны быть направлены на то, чтобы избежать или свести к минимуму опасность заражения во время тех манипуляций, при выполнении которых наблюдается наибольшая вероятность образования и рассеивания потенциально опасных инфекционных аэрозолей.

В ЛАБОРАТОРИЯХ ОСНОВНЫМИ ИСТОЧНИКАМИ ОБРАЗОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ АЭРОЗОЛЕЙ ЯВЛЯЮТСЯ МАНИПУЛЯЦИИ, СВЯЗАННЫЕ С ОБРАБОТКОЙ ЗАРАЖЕННОГО МАТЕРИАЛА.

Аэрозоли могут образовываться при выполнении следующих манипуляций:

- открывание флаконов с материалом; эта манипуляция особенно опасна, если между наружной стенкой горлышка флакона и внутренней поверхностью крышки находятся частицы высохшей мокроты или если непосредственно перед открыванием флакон подвергался встряхиванию во время транспортировки;

- приготовление мазков путем нанесения материала на предметное стекло и распределение его по поверхности стекла;

- прожигание над пламенем горелки не очищенных от остатков материала бактериологических петель;

- попытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала;

- работа с жидкими культурами или с надосадочной жидкостью;

- забор в пипетку суспензии микроорганизмов, особенно при использовании автоматических пипеток с фиксированным объемом жидкости;

- использование высокоскоростных встряхивателей и центрифуг;

- энергичная инокуляция микробных суспензий в пробирки или флаконы;

- повреждение пробирок при центрифугировании;

- использование ступок при растирании инфицированного материала;

- приготовление суспензий микобактерий для инокулирования (особенно опасно использование ступок для растирания культуры).

При выполнении всех этих манипуляций следует соблюдать особую осторожность, а некоторые желательно исключить из лабораторных технологий.

Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения необходимо свести к минимуму возможность образования аэрозолей. Для защиты лабораторных работников от инфекционных частиц необходимо проводить работу при включенной локальной вытяжной вентиляции (там, где это достаточно) или в специально оборудованных боксах или ламинарных шкафах.

III. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ

Присутствие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом материале может быть установлено при микроскопическом и/или культуральном исследовании. Однако необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных ("атипичных") микобактерий - возбудителей микобактериозов.

НА ОСНОВАНИИ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗМОЖНО СДЕЛАТЬ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ТОЛЬКО О НАЛИЧИИ ИЛИ ОТСУТСТВИИ В ПРЕПАРАТЕ КИСЛОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ.

Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.

Несмотря на указанные недостатки, бактериоскопия остается одним из основных методов микробиологических исследований. Ее преимущество заключается в быстроте получения результата и относительной простоте исследования. Метод позволяет в короткие сроки (от одного часа) обнаружить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом и микобактериозами, выделяющих большие количества микобактерий, и остается актуальным микробиологическим методом при выявлении больных туберкулезом и микобактериозами на первичных этапах обследования больных, а также при динамическом наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе лечения. Кроме того, микроскопическое подтверждение тинкториальных свойств культуры остается обязательным исследованием при ее диагностике.

3.1. Подготовка материала для микроскопического исследования на кислотоустойчивые микобактерии

Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза методами микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не менее 10000 микробных клеток. В мокроте больных с туберкулезом органов дыхания (особенно при наличии у них полостей распада легочной ткани) обычно содержится значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет выявить их при микроскопическом исследовании. Однако бактериовыделение не является регулярным процессом, и это требует определенной тактики сбора материала. Чувствительность этого метода можно повысить, если ввести кратность обследования пациента. Установлено, что при последовательных исследованиях результативность микроскопической диагностики туберкулеза органов дыхания повышается следующим образом: при однократном исследовании - 80 - 83%, двукратном - на 10 - 14% больше и при исследовании трех проб мокроты - еще на 5 - 8% больше. Таким образом, при подозрении на туберкулез органов дыхания рекомендуется исследовать не менее трех проб мокроты.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НЕ ИСКЛЮЧАЕТ ДИАГНОЗ ТУБЕРКУЛЕЗА, ТАК КАК В МОКРОТЕ ПАЦИЕНТА МОЖЕТ СОДЕРЖАТЬСЯ МЕНЬШЕ МИКОБАКТЕРИЙ, ЧЕМ МОЖЕТ ВЫЯВИТЬ МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Эффективность бактериоскопии существенно возрастает, если контролируется качество собираемого материала. Нарушение технологий подготовки мазков может быть причиной отрицательного результата микроскопического исследования.

3.2. Приготовление мазков для микроскопических исследований

По способу подготовки материала методы микроскопического исследования условно делят на два вида:

- метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливается непосредственно из нативного необработанного диагностического материала или осадка (при исследовании жидкого материала);

- метод микроскопии мазка из осадка материала, подготовленного для культурального исследования путем обработки гомогенизирующими и обеззараживающими средствами и последующего центрифугирования.

При соблюдении условий методик второй метод более информативен, примерно на 20 - 30%, чем прямая микроскопия, так как при подготовке осадка происходит освобождение микробов из окружающей их слизи и обогащение диагностической квоты материала при центрифугировании.

В тех случаях, когда мазок подвергается окраске флюорохромными красителями и исследуется в люминесцентном микроскопе, необходимо иметь в виду, что качественная и эффективная окраска флюорохромными красителями требует обязательного соблюдения кислотности (pH) мазка, а также освобождения микобактерий от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению красителя в микробную клетку. Несоблюдение этих условий приводит к снижению эффективности люминесцентной микроскопии.

ПРИ КУЛЬТУРАЛЬНОМ ИССЛЕДОВАНИИ МАЗОК И ПОСЕВ ПРОИЗВОДЯТСЯ ОБЯЗАТЕЛЬНО ИЗ ОДНОЙ И ТОЙ ЖЕ ПОРЦИИ МАТЕРИАЛА. ЭТО ОСНОВНОЕ ТРЕБОВАНИЕ ПРАВИЛЬНОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1. Оборудование и реактивы для приготовления диагностических мазков

Перед началом работы оборудование, реактивы и материалы необходимо разместить так, чтобы было удобно работать и в дальнейшем стараться соблюдать этот привычный порядок.

Все манипуляции по приготовлению мазков из диагностического материала должны быть стандартизованными, а для максимальной безопасности все материалы и реагенты всегда должны находиться на одних и тех же постоянных местах и располагаться в одном и том же порядке.

Для приготовления мазков необходимы:

- флаконы с поступившим в лабораторию исследуемым материалом;

- деревянные палочки (аппликаторы) или бактериологические петли диаметром 3 мм для забора сгустков мокроты и распределения их на стекле;

- одноразовые предметные стекла (обезжиренные, без царапин и сколов), ГОСТ 9284-75;

- не смываемый при окраске маркировочный карандаш для нанесения идентификационного номера на стекло (алмазный карандаш);

- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- емкость (колба, эксикатор, стеклянная банка и т.д.) с отмытым речным песком, залитым техническим спиртом (70°), для очистки бактериологической петли от остатков материала перед очередной стерилизацией ее в пламени горелки;

- спиртовка или газовая горелка Бунзена для прокаливания петли;

- одноразовые или стерильные стеклянные чашки Петри для отбора гнойных комочков материала;

- стерильные мерные пипетки на 10 мл и 5 мл для переноса мокроты в чашки Петри;

- лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, для просушивания приготовленных мазков;

- контейнеры для сбора и последующего автоклавирования инфицированного материала и загрязненной посуды;

- емкость с дезинфицирующим раствором для обработки поверхности стола или других объектов по окончании работы и при случайном попадании на них диагностического материала;

- ватные шарики для обработки загрязненных поверхностей дезинфицирующим раствором.

3.2.2. Подготовка предметных стекол

Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96° этиловый спирт + диэтиловый эфир в соотношении 1:1) стекла без царапин и сколов. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения или обусловливают образование артефактов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов.

СТЕКЛА, НА КОТОРЫХ ПРИ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ БЫЛИ ОБНАРУЖЕНЫ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫЕ МИКОБАКТЕРИИ, СОХРАНЯЮТСЯ В ЛАБОРАТОРИИ В ТЕЧЕНИЕ 1 ГОДА, А ЗАТЕМ ПОДЛЕЖАТ ОБЯЗАТЕЛЬНОМУ УНИЧТОЖЕНИЮ И НЕ ДОЛЖНЫ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ ПОВТОРНО.

Новые предметные стекла кипятят в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем в проточной воде. Протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96° этиловым спиртом. Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее суток. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.

3.2.3. Приготовление мазков из нативного материала и необработанного осадка жидких материалов

Если мазок будет окрашиваться по методу Ziehl-Neelsen и исследоваться в световом микроскопе, pH мазка не корригируется.

В случае окраски флюорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе перед нанесением материала на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения pH (6,8 - 7,0). Уровень pH осадка определяют с помощью бумажной индикаторной полоски.

Перед приготовлением мазка на один конец стекла (или его матовую часть) наносят полный номер пробы исследуемого материала, под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале при приеме материала. Номер наносят с помощью алмазного карандаша или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в процессе окраски этот номер сохранился.

НЕ СЛЕДУЕТ КАСАТЬСЯ ЧИСТОЙ ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛА РУКАМИ ИЛИ ПЕРЧАТКАМИ!

Приготовление мазков для прямой микроскопии из нативной мокроты.

Если материал поступил в емкости, в которой невозможно обнаружить и выбрать частицы для приготовления мазка, его переносят в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага. При этом проявляют известную осторожность, чтобы избежать образования аэрозолей.

Так как в необработанной нативной мокроте микобактерии наиболее часто располагаются в плотных комочках распада тканей, следует иметь в виду, что результат микроскопического исследования в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных комочков.

При приготовлении мазков наиболее удобно пользоваться деревянной палочкой, которую перед работой разламывают пополам. Затем из разных участков образца мокроты выбирают 2 - 3 наиболее плотных гнойных небольших комочка, переносят их на стекло, при необходимости разминают и равномерно распределяют тонким слоем в центре стекла на поверхности приблизительно размером 1 x 2 см в виде овала. Забор комочков производят с помощью сломанных концов палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность предметного стекла и приготовление мазка посредством растирания. На одно предметное стекло следует наносить только один мазок.

Использованные для приготовления мазка палочки удаляют в банку с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным заразным материалом. Для каждой порции мокроты используется новая чистая палочка!

Практикуется также приготовление мазков с помощью бактериологических петель или препаровальных игл. Удобно пользоваться двумя петлями или иглами. В случае, когда мазок готовят с помощью бактериологической петли, она может быть использована повторно после очистки от остатков мокроты путем 2 - 3-кратного погружения ее в банку с песком, залитым спиртом, и последующего прожигания в пламени горелки до появления красного цвета. После прокаливания петлю следует охладить, оставив ее на 1 - 2 минуты в штативе-петледержателе.

Песок для очистки петель может использоваться длительное время при условии периодического обновления раствора спирта с таким расчетом, чтобы его уровень превышал уровень песка не менее чем на 3 см.

Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала.

Такие мазки приготавливают из полученного после центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты). Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результаты. Особенностью существования М.tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000g (см. раздел по культуральным исследованиям данной Инструкции).

Для приготовления мазка надосадочную жидкость аккуратно удаляют, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью пипетки наносят на стекло 1 - 2 капли осадка, распределяя его тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1 см x 2 см.

Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидких материалов (моча, промывные воды бронхов, экссудаты и пр.) легко смываются в процессе окраски. Поэтому мазки из осадка жидких материалов желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

Для этого белок куриного яйца в течение 30 - 40 минут взбивают с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и оставляют на 1 - 1,5 часа при комнатной температуре. Затем жидкую часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят ее в другую посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят ее на чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по 2/3 их поверхности. 1/3 предметного стекла оставляется не обработанной белком для последующего нанесения на нее номера пробы. Обработанные белком стекла раскладывают на чистой фильтровальной бумаге и высушивают при комнатной температуре.

Другим способом закрепления осадка жидкого материала является использование сыворотки крови. На чистом стекле каплю сыворотки смешивают с 1 - 2 каплями осадка материала и распределяют смесь по стеклу.

3.2.4. Приготовление мазков из осадка диагностического материала, подготовленного для культурального исследования

Культуральное исследование любого диагностического материала обязательно включает параллельное микроскопическое исследование осадка этого материала, полученного после обработки детергентами с последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием.

ВСЕ МАЗКИ ИЗ ОСАДКА ПРИГОТАВЛИВАЮТ ПОСЛЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ ПОСЕВА!

При этом чаще всего используется та же пипетка, которой производился посев. С помощью этой пипетки на стекло наносят 1 - 2 капли осадка, который распределяют тонким слоем в центре стекла на площади 1 см x 2 см.

Процедура приготовления мазка из осадка обработанного материала:

1. Оставшийся после посева осадок встряхивают, забирают в пипетку.

2. 1 - 2 капли осадка наносят на предметное стекло, формируя мазок размером ~ 1 x 2 см.

3. Мазок из осадка жидких материалов (моча, промывные воды и др.) во избежание смывания материала при окраске желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

При приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат.

Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании.

Не рекомендуется готовить мазки способом "растяжки" материала между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.

ЧЕРЕЗ ПРАВИЛЬНО ПРИГОТОВЛЕННЫЙ МАЗОК МОЖНО ЧИТАТЬ ГАЗЕТНЫЙ ШРИФТ, РАСПОЛОЖЕННЫЙ ПОЗАДИ СТЕКЛА НА РАССТОЯНИИ 5 - 10 СМ.

Ограниченная площадь мазка (~ 1 см x 2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность манипуляции и последующей микроскопии, так как периферические части и ребра предметного стекла остаются не загрязненными инфекционным материалом.

3.2.5. Фиксация мазков

Приготовленные вышеуказанным способом мазки помещают на 15 - 30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при отсутствии такового - на столе, в специально отведенном месте.

Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки!

При окраске по Ziehl-Neelsen стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3 - 5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку ("рельсы") для окрашивания.

При окраске мазков флюорохромными красителями рекомендуется фиксация в сухожаровом шкафу при 85 °C в течение 45 минут. Однако при отсутствии такой возможности допускается фиксация над пламенем горелки.

В плане охраны труда оптимальным является метод, предложенный A. Hain. Этот метод фиксации мазков используется как при окраске по Ziehl-Neelsen, так и люминесцентными красителями. Согласно этому методу предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37 °C. Затем температуру повышают до 105 °C и, спустя 10 минут, шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105 °C, чтобы не изменить тинкториальные свойства микобактерий.

Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения.

Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.

3.3. Методы окраски диагностических мазков

Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии) и из осадка, обработанного для культурального исследования, используются методы, позволяющие выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы:

- окраска по методу Ziehl-Neelsen для исследования в световом микроскопе;

- окраска флюорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе.

Люминесцентную микроскопию рекомендуется использовать при большом количестве исследуемых ежедневно мазков (более 30 мазков в день).

3.3.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl-Neelsen

Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

- окраска фуксином (с подогреванием) - при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;

- обесцвечивание (3 мин.) - последующая обработка мазка 25% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;

- контрастирующая окраска (1 мин.) - обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату.

3.3.1.1. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl-Neelsen

Для окраски мазков по методу Ziehl-Neelsen необходимы:

- раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на предметных стеклах;

- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата (если мазки не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания его при окрашивании карболовым фуксином; или

- металлический стержень с ватным тампоном, который используется вместо горелки для подогревания препарата при окрашивании карболовым фуксином;

- фильтровальная бумага размером ~ 4 x 1,5 см для окраски мазков карболовым фуксином;

- раствор карболового фуксина;

- 25% раствор серной кислоты или

- 3% раствор солянокислого спирта;

- дистиллированная вода для промывания мазков;

- 0,3% раствор хлорида метиленового синего;

- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

Реактивы:

- спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;

- фенол кристаллический, ГОСТ 6417-72;

- фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;

- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

- глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;

- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

- растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 - 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96° этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):

- расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола - 41 °C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

- в 90 мл раствора 2 добавить 10 мл раствора 1.

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.

НИКОГДА НЕ ДОБАВЛЯЙТЕ ВОДУ В КИСЛОТУ!

б) Раствор солянокислого спирта

Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3% солянокислый спирт:

    Этиловый спирт 96°                                       97 мл
    Концентрированная соляная кислота                        3 мл.

К 97 мл спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты.

ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

- растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Хранение растворов. Вес приготовленные растворы должны быть профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста, готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре в темном месте.

Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более 2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в осадок, что изменяет заданные свойства раствора.

Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении. Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть уверенным в качестве используемых красителей.

3.3.1.2. Процедура окраски:

- убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и промаркированы;

- препараты помещают на подставку ("рельсы") так, чтобы они не касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные "рельсы" помещают не более 12 стекол;

- на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии;

- наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее;

- пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;

- осторожно (!) смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. При промывании мазков следует использовать холодную воду или воду комнатной температуры;

- перед тем как нанести на стекло следующий раствор, щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление следующего реактива;

- мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;

- мазок тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение до 1 минуты (не превышать экспозицию!) 0,3% раствором метиленового синего;

- вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода;

- высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

НЕ СЛЕДУЕТ ПРОМОКАТЬ ПРЕПАРАТ!

В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы - в голубой.

При использовании 0,3% раствора метиленового синего для окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот краситель может как бы "скрыть" кислотоустойчивые микобактерии.

Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным солянокислым спиртом.

Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.

3.3.2. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь поля зрения.

Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (бактериальные клетки), окрашенные специальными красителями (флюорохромами), под действием облучения их ультрафиолетом испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет, проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается молекулярными структурами объекта и остается невидимым или почти невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты света в длинноволновой области, иначе говоря - светиться. В этом случае клетка становится источником света определенного спектра и хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.

Источник света должен содержать в своем спектре длину волны, возбуждающую молекулы красителя, а светофильтры подбираются таким образом, чтобы добиться хорошего расхождения между длинами волн возбуждающего ультрафиолетового света и излучения, испускаемого возбужденными объектами.

При люминесцентной микроскопии используют специальный микроскоп. Источником света в нем служит кварц-галогеновая или ртутная лампа. Для красителей системы аурамин/родамин используют подборку из следующих фильтров (на примере микроскопа РПО8 ЛОМО):

- возбуждающий фильтр ФС 1-4,

- запирающий фильтр СЗС 21-2 и

- нейтральный фильтр БС 8-3.

Светофильтры возбуждения служат для выделения из потока излучения источника света тех лучей, которые обеспечивают возбуждение и свечение объекта; эти фильтры устанавливаются в ветви осветителя.

Запирающий светофильтр служит для ограничения (срезания) света возбуждения и пропускания только света люминесценции; этот фильтр устанавливается в наблюдательной ветви.

Наблюдательные (сменные) фильтры имеют разное назначение: фильтры для защиты глаз от попадания красных и инфракрасных лучей; теплозащитные фильтры и др. В отечественных микроскопах применяются фильтры из стекла БС8 для предохранения объектов микроскопии от выцветания.

Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С и др.) связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим светом они начинают светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или темно-зеленом фоне.

За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении 250x - 450x, тогда как окрашенные фуксином - при увеличении 800x - 1000x. Разница в увеличении позволяет микроскописту видеть одновременно в 4 - 10 раз большее поле зрения, что существенно сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если микроскопическое исследование необходимой площади мазка при окраске по Ziehl-Neelsen продолжается приблизительно 10 минут, то для исследования той же площади мазка методом люминесцентной микроскопии потребуется только 2 - 3 минуты.

Наряду с этим при люминесцентной микроскопии отмечается значительно большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает комфортность микроскопического исследования. Для глаза исследователя значительно легче обнаружить флюоресцирующие оранжевые или ярко-желтые микобактерии на темном (при гашении фона метиленовым синим или перманганатом калия) или темно-красном (при гашении фона акридиновым оранжевым) фоне, чем выявить красные микобактерии на голубом фоне клеточного детрита при окраске по Ziehl-Neelsen. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала.

Указанные преимущества наиболее выражены при использовании люминесцентной микроскопии в лабораториях, выполняющих ежедневно большое число исследований (порядка 30 и более).

Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить из осадка после обработки материала детергентом с последующим отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения pH (6,8 - 7,0). С этой целью осадок нейтрализуют несколькими каплями 6% раствора соляной кислоты или 6% едкого натра (в зависимости от метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью бумажной индикаторной полоски определяют уровень pH (оптимально 6,8) осадка.

Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для контроля следует использовать микроскопию мазка, повторно окрашенного по методу Ziehl-Neelsen.

3.3.2.1. Оборудование и реактивы для окраски флюорохромными красителями:

- раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на предметных стеклах;

- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу; или металлический стержень с ватным тампоном, используемого вместо горелки для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;

- раствор флюоресцентных красителей;

- раствор для обесцвечивания мазков;

- раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;

- емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;

- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

ПРИ ОКРАСКЕ ФЛЮОРОХРОМНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ НЕЛЬЗЯ ПОДОГРЕВАТЬ МАЗКИ И ПОЛЬЗОВАТЬСЯ НАКЛАДКАМИ ИЗ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ!

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

- избегать неполного обесцвечивания;

- не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

Мазки, которые использовались для флюоресцентной микроскопии, в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.

В нашей стране наибольшее распространение получили следующие методы окраски микобактерий люминесцентными красителями:

3.3.2.2. Метод окраски аурамином ОО и родамином С

Реактивы:

- спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

- аурамин ОО (аурамин О-Sigma);

- родамин С, ТУ 6-09-2463-77 (родамин В-Sigma);

- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Раствор аурамина - родамина:

    Аурамин ОО                                               1,0 г
    Родамин С                                                0,1 г
    Вода дистиллированная                                 1000 мл.

Каждый краситель растворяют отдельно в 150 - 200 мл дистиллированной воды и помещают в термостат при 37 °C на 18 - 24 часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем до 1000 мл.

Приготовленной раствор красителей хранят в емкости из темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.

АУРАМИН ОБЛАДАЕТ КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ПОЭТОМУ НЕ СЛЕДУЕТ ДОПУСКАТЬ ПОПАДАНИЯ НА КОЖУ ЕГО ПОРОШКА ИЛИ РАСТВОРА.

Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:

    Концентрированная соляная кислота                         3 мл
    Этиловый спирт 96°                                      97 мл.

Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл этилового спирта.

ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!

Раствор 3. Гаситель фона:

    Метиленовый синий хлорид                                 25 мг
    Вода дистиллированная                                  100 мл.

В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового синего хлорида.

Хранение растворов. Написать на этикетке название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Растворы желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед использованием растворов их просматривают для исключения преципитата. Если последний обнаружен, раствор можно профильтровать.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга.

2. Мазки заливают раствором 1 на 1 час.

НЕ НАГРЕВАТЬ МАЗКИ И НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ПОЛОСКИ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой.

4. Обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3 мин.

5. Промывают дистиллированной водой.

6. Гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 60 сек. Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой.

7. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

3.3.2.3. Метод окраски аурамином О

(Hagemann P.К., 1938; CDC 1985; WHO, 1998)

Реактивы:

- спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

- аурамин О-Sigma (2465-27-2);

- акридиновый оранжевый, С.I.46005; или

- перманганат калия, ГОСТ 10163-76;

- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

- безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:

    Аурамин                                                  0,1 г
    Этиловый спирт                                          10 мл.

Растворить аурамин в спирте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Раствор фенола:

    Фенол кристаллический                                    3,0 г
    Дистиллированная вода                                   87 мл.

Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 °C) и растворить в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.

Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:

    Концентрированная соляная кислота                       0,5 мл
    Технический 70° этиловый спирт                         100 мл.

Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к спирту.

ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!

Напишите на этикетке название раствора, его концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Растворы 4. Гасители фона:

Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.

а) Раствор перманганата калия:

    Перманганат калия (KMnO4)                                0,5 г
    Дистиллированная вода                                  100 мл.

Растворить перманганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок годности.

Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

б) Раствор акридинового оранжевого:

    Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4)         0,01 г
    Дистиллированная вода                                   100 мл
    Акридиновый оранжевый                                  0,01 г.

Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый.

Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга.

2. Мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут.

НЕ НАГРЕВАТЬ МАЗКИ И НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ПОЛОСКИ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой.

4. Обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут.

5. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются остатки краски.

6. Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут.

При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минуты. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться.

7. Мазки промывают дистиллированной водой.

8. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

3.3.2.4. Хранение приготовленных мазков

Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если больной находится это время в стационаре. Окрашенные флюоресцентными красителями мазки чувствительны к дневному и ультрафиолетовому свету. Во время процесса микроскопирования они способны обесцветиться за несколько секунд. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости сделать паузу перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к полному восстановлению препарата.

3.4. Техника микроскопического исследования препарата

3.4.1. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen

Для проведения микроскопического исследования при окраске по методу Ziehl-Neelsen необходимы:

- бинокулярный микроскоп;

- иммерсионное масло;

- капельница для нанесения масла на препарат;

- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны быть расположены в порядке номеров регистрации;

- емкость с ксилолом, спирто-эфирной смесью или 70° спиртом;

- фильтровальная бумага для удаления иммерсионного масла с поверхности просмотренного препарата;

- коробки для хранения просмотренных мазков;

- мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или марлевые тампоны для протирания линз микроскопа;

- бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования;

- емкость с дезинфицирующим средством.

Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl-Neelsen, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом 90x или 100x и окулярами 7x или 10x.

3.4.2. Настройка микроскопа для исследования в проходящем свете

Новое поколение отечественных и зарубежных микроскопов оснащено самоцентрирующимися галогенными лампами, и настройка (фокусировка) нити лампы в апертурной диафрагме конденсора производится на заводе-изготовителе. Это существенно облегчает настройку освещения микроскопа по Келеру, которая в этих марках микроскопов сводится к ряду приемов, позволяющих совместить оптическую ось изображения и ось подсветки.

Перед началом работы убедиться, что электрическое напряжение в лаборатории соответствует допустимому при работе с микроскопом. В случае необходимости воспользоваться стабилизатором напряжения.

Осмотреть, нет ли в микроскопе поврежденных или сломанных деталей.

Включить освещение микроскопа, отрегулировав его на малое напряжение, которое используется при работе с малым увеличением.

Проверить правильность регулировки и фокусировку (направленность) источника света.

Убедиться, что конденсор с открытой диафрагмой занимает верхнее положение, а матовое стекло отсутствует в тракте подсветки (под конденсором).

Настройку освещения микроскопов рекомендуется производить следующим образом.

Установить в ход лучей объектив 40x и сфокусировать его на резкое изображение поверхности препарата.

Установить препарат таким образом, чтобы в поле зрения микроскопа попал наиболее прозрачный участок.

Вращая кольцо полевой диафрагмы, расположенное на основании микроскопа, закрыть полевую диафрагму.

С помощью расположенной на конденсоре специальной рукоятки закрыть апертурную диафрагму.

Перемещая конденсор путем вращения винта вертикального перемещения конденсора, добиться резкого изображения краев прикрытой полевой диафрагмы в поле зрения микроскопа.

С помощью фронтально от конденсора расположенных центровочных винтов добиться перемещения изображения краев прикрытой диафрагмы в центр поля зрения.

Вращая кольцо полевой диафрагмы, раскрыть ее до размеров поля зрения.

С помощью рукоятки конденсора раскрыть апертурную диафрагму приблизительно на 1/3 хода, добиваясь четкого появления окраски объектов изображения в препарате и достаточной глубины резкости.

Заменить окуляр в правом окулярном тубусе на точечную диафрагму (из комплекта микроскопа) или на дополнительный микроскоп МИР-4, который предварительно настроить на изображение. В первом случае будет видна яркая нить накала лампы. Уменьшая силу света, необходимо добиться изображения нити. Она должна иметь сфокусированное изображение. В случае использования дополнительного окуляра при правильно настроенном микроскопе будет наблюдаться следующая картина: темный диск, заполняющий поле зрения, и тонкая полоска света по диаметру выходного зрачка микрообъектива (должно быть перекрыто ~ 9/10 диаметра выходного зрачка).

Заменить точечную диафрагму или дополнительный микроскоп на рабочий окуляр и приступить к наблюдению препарата в светлом поле. Для большего комфорта можно вставить матовое стекло в тракт прохождения света, добавив света реостатом лампы.

Этой манипуляцией завершается настройка микроскопа.

МНОГИЕ СОВРЕМЕННЫЕ МИКРОСКОПЫ ОСНАЩЕНЫ ЦЕНТРИРОВАННЫМИ И НЕПОДВИЖНЫМИ КОНДЕНСОРАМИ, ЧТО ОБЛЕГЧАЕТ ПРОЦЕДУРУ НАСТРОЙКИ. РЕГУЛИРОВКА ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ТОЛЬКО С ПОМОЩЬЮ ОТКРЫТИЯ АПЕРТУРЫ ИРИСОВОЙ ДИАФРАГМЫ ДО 70 - 80%, ЧТО ОБЕСПЕЧИВАЕТ РАВНОМЕРНОЕ ОСВЕЩЕНИЕ ПОЛЯ ЗРЕНИЯ.

3.4.3. Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Ziehl-Neelsen

Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза имеют в длину примерно 1 - 10 мкм, в ширину - 0,2 - 0,6 мкм. Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты.

При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся поодиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко в нативных препаратах бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры "V".

Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на "бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде "полос".

В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.

Клетки, выращенные на питательной среде, отличаются внешне от видимых в нативном препарате. Как правило, в первом случае микобактерии чуть толще и короче, окраска их ярче. Клетки могут быть агломерированы или сплетаться в колонии с образованием кос или сплетений.

Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к М.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания.

Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть Rhodococcux, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora.

Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски - при частичной потере кислотоустойчивой окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.

3.4.4. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных флюорохромными красителями

Для проведения микроскопического исследования при окраске флюорохромами необходимы:

- люминесцентный микроскоп;

- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны располагаться в порядке номеров регистрации;

- коробки для хранения просмотренных мазков;

- мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или тампоны для протирания линз микроскопа;

- бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования;

- емкость с дезинфицирующим средством.

Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором объективов и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта наблюдения в пределах 250x - 630x. Необходимо использовать объективы, предназначенные для люминесцентной микроскопии.

3.4.5. Осветительные системы и настройка люминесцентного микроскопа

Освещение объектов на предметном стекле осуществляется сверху через коллектор, систему светофильтров, светоделительную пластину и объектив микроскопа.

Подготовка к работе и настройка освещения (на примере РПО-8 ЛОМО)

1. Присоединить фонарь ртутной лампы к источнику питания.

2. Закрыть шторку микроскопа.

3. Включить источник питания и зажечь лампу, руководствуясь описанием источника питания, изложенным в паспорте микроскопа.

НЕЛЬЗЯ ВЫКЛЮЧАТЬ РТУТНУЮ ЛАМПУ РАНЕЕ ЧЕМ ЧЕРЕЗ 15 МИНУТ ПОСЛЕ ЕЕ ЗАЖИГАНИЯ. ПОВТОРНОЕ ВКЛЮЧЕНИЕ РТУТНОЙ ЛАМПЫ ДОПУСКАЕТСЯ ТОЛЬКО ЧЕРЕЗ 10 МИНУТ ПОСЛЕ ЕЕ ВЫКЛЮЧЕНИЯ (ПОСЛЕ ЕЕ ПОЛНОГО ОХЛАЖДЕНИЯ).

4. Дать прогреться фонарю не менее 10 минут после зажигания ртутной лампы.

5. Установить переключатель, расположенный слева на тубусе микроскопа, в положение СП, установить в тубус направляющую с пластиной СП.

6. Установить в гнездо тубуса теплозащитную кювету или теплозащитный светофильтр СЗС 24 в прямоугольной оправе.

7. Установить в гнездо тубуса нейтральный светофильтр НСЗ-2 в прямоугольной оправе.

8. Установить в правую окулярную трубку бинокулярной насадки точечную диафрагму.

9. Поворотом револьверной головки ввести в ход лучей свободное от объектива отверстие.

10. Открыть шторку (полевую диафрагму), расположенную в осветительной ветви осветителя.

11. Поместить на предметный столик лист белой бумаги.

12. Отцентрировать изображение светящейся дуги лампы относительно свободного отверстия, для чего с помощью центрировочных винтов при лампе переместить изображение нити лампы в центр светящегося круга от отверстия.

13. Прикрыть полевую диафрагму.

14. Добиться резкого изображения дуги на бумаге, для чего с помощью рукоятки переместить коллектор в осветительной части микроскопа вдоль оптической оси.

15. Проверить окончательную центрировку электродов лампы, наблюдая изображение электродов и светящейся дуги лампы через точечную диафрагму.

От правильной настройки (центрировки) люминесцентного осветителя зависит интенсивность и равномерность свечения объектов в поле зрения.

Настройка микроскопа для наблюдения объектов в свете люминесценции

1. Вставить в пазы корпуса осветителя выбранные для работы возбуждающий (ФС 1-4) и запирающий (СЗС 21-2) светофильтры или направляющую с пластиной.

2. Установить в гнездо светофильтр БС 8-3 вместо светофильтра НСЗ-2.

3. Вставить окуляры в окулярные трубки бинокулярной насадки.

4. Установить в револьверное устройство полный набор объективов.

5. Ввести в ход лучей выбранный рабочий объектив.

6. Установить на предметном столике микроскопа препарат и закрепить его с помощью препаратоводителя.

7. Открыть полевую диафрагму до размеров поля зрения в окуляре.

8. Раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений, видимых правым и левым глазом исследователя.

9. С помощью механизмов грубой и точной фокусировки (макро- и микровинт) добиться оптимальной резкости изображения. Если объект наблюдения недостаточно контрастный, сфокусировать прибор можно, ориентируясь на маркировку, нанесенную на препарат.

10. Проверить равномерность освещения поля зрения, перемещая рукоятку коллектора.

Микроскоп готов к работе.

Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между наблюдениями необходимо закрывать шторку лампы, находящуюся в осветительном тракте ртутной лампы.

3.4.6. Порядок проведения микроскопического исследования

Современные микроскопы являются сложными техническими устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации. Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но можно провести самостоятельно, руководствуясь инструкцией к микроскопу и вышеприведенным описанием. Несоблюдение правил настройки может привести к существенному снижению эффективности микроскопических исследований и даже невозможности их проведения.

Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen, производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа. Рекомендуется это делать с помощью бинокулярного микроскопа.

При исследовании мазков, окрашенных флюоресцентными красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной из важных особенностей работы в этом случае является то, что окрашенные флюорохромными красителями мазки не подлежат длительному хранению при дневном свете или длительному просмотру, так как интенсивность люминесценции окрашенного объекта при этом быстро снижается.

Работу начинают с определения положительных мазков предыдущего дня или просмотра. Это позволит относительно быстро оценить состояние настройки и готовности микроскопа к работе.

Перед началом микроскопического исследования в световом микроскопе необходимо:

- проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для проведения микроскопического исследования оборудования и дополнительных материалов;

- снять чехол, которым накрыт микроскоп;

- осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой механические части микроскопа;

- убедиться в целости оптической системы;

- включить осветительную систему и убедиться в достаточности освещения, ее настройки;

- с помощью бумажной салфетки или ватного тампона, смоченного спирто-эфирной смесью, протереть линзы микроскопа;

- убедиться в том, что подготовленные для микроскопии окрашенные препараты достаточно хорошо высушены;

- вращая винт грубой фокусировки (макровинт), опустить предметный столик, максимально отдалив его от объектива;

- поворотом револьверного устройства установить объектив с малым увеличением (10x) точно над конденсором;

- поместить на столик предметное стекло таким образом, чтобы мазок находился прямо под объективом; при этом обязательно убедиться, что мазок находится в верхней плоскости предметного стекла, а не снизу;

- закрепить препарат на столике с помощью клемм препаратоводителя;

- с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка для просмотра;

- раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений, видимых правым и левым глазом исследователя;

- глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с препаратом к объективу, но не допускать соприкосновения предметного стекла с линзой объектива;

- глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого лучше всего использовать регулятор накала лампы, использовать темные или матовые фильтры и в крайнем случае изменить степень открытия диафрагмы.

Положение конденсора изменять не рекомендуется;

- продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы объектива. Обычно достаточно нескольких поворотов винта;

- затем, глядя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими поворотами микровинта настроить изображение до получения достаточной резкости.

НИКОГДА НЕ ПОДНИМАЙТЕ СТОЛИК МИКРОСКОПА, ГЛЯДЯ В ОКУЛЯР. ЭТО МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К СОПРИКОСНОВЕНИЮ ФРОНТАЛЬНОЙ ЛИНЗЫ ОБЪЕКТИВА С ПРЕДМЕТНЫМ СТЕКЛОМ, ПОВРЕЖДЕНИЮ ЛИНЗЫ ИЛИ К ПОРЧЕ ПРЕПАРАТА;

- глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать изображение;

- глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать изображение путем поворота дополнительного фокусировочного кольца, расположенного на левом окуляре.

3.4.7. Исследование объекта с большим увеличением с помощью "сухой" оптической системы

Порядок работы

После работы с препаратом под малым или средним увеличением, не меняя фокусировки, выбрать объектив с более сильным увеличением.

Убедиться, что этот объектив не касается предметного стекла, и поворотом револьверного устройства поместить выбранный объектив непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться почти в фокусе объектива.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: