Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях

¦                 ¦                ¦                  ¦технического конт- ¦
¦                 ¦                ¦                  ¦роля на производст-¦
¦                 ¦                ¦                  ¦венных предприятиях¦
------------------+----------------+------------------+--------------------

Результаты микробных исследований продукта перед стерилизацией, сырья и вспомогательных материалов регистрируют в журнале (Приложение 2).

Готовые консервы каждой партии подвергают микробиологическому контролю на промышленную стерильность. При этом для исследований отбирают не менее 3 банок консервов для выявления мезофильных микроорганизмов (по методам ГОСТ 10444.3-85, ГОСТ 10444.4-85) и не менее 3 банок консервов для выявления термофильных микроорганизмов (по методам ГОСТ 10444.5-85, ГОСТ 10444.6-85).

Результаты микробиологических исследований готовых консервов регистрируют в журнале (Приложение 5).

Оценку и реализацию партии готовой продукции проводят в соответствии с Санитарно-гигиеническими требованиями к производству мясных консервов для питания детей раннего возраста и Инструкцией о порядке санитарно-технического контроля на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания.

1.3.6.2. Контроль консервов для питания детей дошкольного и школьного возраста и для диетического питания

Микробиологический контроль названной группы продуктов проводят в соответствии с требованиями Инструкции о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания и п. 1.3.5 настоящей Инструкции.

1.3.6.3. Контроль готовых колбасно-кулинарных изделий и полуфабрикатов для детского и диетического питания

Контроль производства полуфабрикатов для детского и диетического питания и готовых колбасно-кулинарных изделий проводят в соответствии с пунктами 1.3.2 и 1.3.3 настоящей Инструкции.

По микробиологическим показателям полуфабрикаты для детского и диетического питания должны соответствовать требованиям, представленным в табл. 1.3.13.

Таблица 1.3.13

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОЛУФАБРИКАТОВ ДЛЯ ДЕТСКОГО И ДИЕТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ

-------------------+-----------------+----------------------------
¦Вид полуфабрикатов¦     Наличие     ¦ ОМЧ (КОЕ/г; КОЕ/куб. см), ¦
¦                  ¦сальмонелл в 25 г¦         не более          ¦
+------------------+-----------------+---------------------------+
¦                  ¦                 ¦        6                  ¦
¦Кусковые          ¦Не допускается   ¦1,0 х 10                   ¦
¦                  ¦                 ¦        6                  ¦
¦Рубленые          ¦Не допускается   ¦5,0 х 10                   ¦
-------------------+-----------------+----------------------------

При превышении микробиологических показателей (табл. 1.3.13) проводят мероприятия, как указано в п. 1.2 настоящей Инструкции.

Готовые колбасно-кулинарные изделия для детского и диетического питания по микробиологическим показателям должны соответствовать требованиям, представленным в табл. 1.3.14.

Таблица 1.3.14

ДОПУСТИМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КОЛБАСНО-КУЛИНАРНЫХ ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ДЕТСКОГО И ДИЕТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ

-------------+-----------+-------------------------------------------------
¦Вид продукта¦    ОМЧ    ¦            Отсутствие в продукте (г)           ¦
¦            ¦ (КОЕ/г),  +----+-----------+--------------+----------------+
¦            ¦ не более  ¦БГКП¦сальмонеллы¦стафилококки  ¦сульфитредуциру-¦
¦            ¦           ¦    ¦           ¦коагулазополо-¦ющие клостридии ¦
¦            ¦           ¦    ¦           ¦жит.          ¦                ¦
+------------+-----------+----+-----------+--------------+----------------+
¦            ¦        3  ¦    ¦           ¦              ¦                ¦
¦Колбасы     ¦1,0 х 10   ¦1   ¦25         ¦1             ¦0,1             ¦
¦            ¦        3  ¦    ¦           ¦              ¦                ¦
¦Готовые     ¦1,0 х 10   ¦1   ¦25         ¦1             ¦0,1             ¦
¦рубленые    ¦           ¦    ¦           ¦              ¦                ¦
¦изделия     ¦           ¦    ¦           ¦              ¦                ¦
-------------+-----------+----+-----------+--------------+-----------------

При превышении микробиологических показателей (табл. 1.3.14) проводят мероприятия, как указано в п. 1.3 настоящей Инструкции.

1.3.7. Контроль продуктов ферментированного гидролиза и пепсина

Продукты ферментированного гидролиза: бульон пищевой, полученный из малоценных пищевых продуктов (голов, ног, шей, крыльев и костного остатка от механической обвалки кур, цыплят и цыплят-бройлеров), кормовая белковая добавка, полученная из технических отходов переработки птицы (кровь, кишечник, зоб, железистый желудок, пищевод, трахея, почки, селезенка, яйцевод, яичники, желчный пузырь, несформировавшиеся яйца, легкие, ветконфискаты и тушки павшей птицы, допущенные ветеринарно-санитарным надзором к переработке на кормовые продукты, головы и ноги, не используемые на пищевые цели; перо покровное, разрешенное к использованию на кормовые цели, подкрылок цыплят, цыплят-бройлеров и кур ОСТ 49-136-82, отходы от выработки перопухового сырья), и пепсин (куриный) пищевой, применяемый в сыродельной промышленности при производстве сыров и других молочных продуктов, подвергают микробиологическому контролю. Исследуется каждая партия выработанного продукта.

Отбор проб для микробиологических анализов производят до отбора на физико-химические и органолептические анализы.

Посуду, инструменты и материалы, соприкасающиеся с продуктом во время отбора проб, стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С в течение 30 мин. или погружением в этиловый спирт с последующим фламбированием.

Пробы от пищевых бульонов и кормовых белковых добавок отбирают асептическим способом в стерильную посуду. Масса точечных проб из различных мест и глубины продукта не должна быть менее 100 г, а общая масса объединенной пробы не менее 500 г.

Пробы пепсина отбирают из разных мест партии в объеме 1% банок или пакетов, но не менее трех. Из каждой отобранной единицы берут точечную пробу пепсина массой 100 г.

Микробиологические исследования проводят по следующим показателям: ОМЧ, БГКП, наличие сальмонелл в 25 г, дополнительно в продуктах ферментативного гидролиза определяют содержание сульфитредуцирующих клостридий (СРК).

Проведение микробиологических анализов и обработка полученных результатов проводятся по общепринятым методикам (табл. 1.3.15).

Таблица 1.3.15

САНИТАРНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОДУКТАМ ФЕРМЕНТИРОВАННОГО ГИДРОЛИЗА И ПЕПСИНА

------------------------------+---------+----------------+----------
¦  Наименования показателей   ¦ Бульон  ¦Добавка кормовая¦ Пепсин  ¦
¦                             ¦ пищевой ¦    белковая    ¦ куриный ¦
+-----------------------------+---------+----------------+---------+
¦                             ¦        4¦        5       ¦        3¦
¦1. Общее количество          ¦5,0 х 10 ¦5,0 х 10        ¦8,0 х 10 ¦
¦микроорганизмов в 1 г        ¦         ¦                ¦         ¦
¦2. БГКП не допускаются в г   ¦1,0      ¦1,0             ¦3,0      ¦
¦3. Сальмонеллы не допускаются¦25       ¦50              ¦25       ¦
¦в г, ГОСТ 25311-82           ¦         ¦                ¦         ¦
¦4. Сульфитредуцирующие       ¦50       ¦-               ¦-        ¦
¦клостридии в 1 г, не более   ¦         ¦                ¦         ¦
------------------------------+---------+----------------+----------

Примечание: (-) не нормируются.

1.3.8. Контроль яиц, мороженых и сухих яйцепродуктов

Настоящий раздел Инструкции распространяется на все соответствующие цехи производства яйцепродуктов птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятий (птицефабрики, птицекомбинаты).

Он включает санитарно-микробиологический контроль поступающего сырья (яиц куриных), готовых продуктов: яичного меланжа, яичного порошка, сухого яичного белка, сухого яичного желтка, а также контроль соблюдения технологических и санитарно-гигиенических режимов производства яйцепродуктов. Контроль санитарного состояния производства и рук работников проводят в соответствии с п. 1.1 настоящей Инструкции.

Для микробиологического анализа яиц, предназначенных для производства яйцепродуктов, отбирают из разных мест партии методом случайной выборки пробу в количестве 30 штук.

Отобранные пробы упаковывают в чистую тару и транспортируют в условиях, исключающих их повреждение и вторичную контаминацию.

При микробиологическом исследовании содержимого яиц поверхность скорлупы яиц обмывают щелочным теплым (30 +/- 2) °С раствором 0,2-процентной концентрации каустической соды или 0,5-процентной кальцинированной соды в течение 1,5 - 2 мин. После мойки яйцо ополаскивают водопроводной водой, дают воде стечь, яйцо погружают в этиловый (70%) спирт, после смачивания спиртом обжигают пламенем.

На остром конце яйца делают стерильным скальпелем отверстие диаметром около 1 см и тоже обжигают. Содержимое одного яйца или нескольких яиц выливают в широкогорлую колбу Эрленмейера и смешивают с помощью стерильных бус или палочками. Полученный гомогенат обрабатывают сразу.

10 куб. см яичной массы (пробы) с помощью стерильной пипетки переносят в колбу, содержащую 90 куб. см физиологического раствора хлористого натрия, и получают таким образом разведение 1:10 (разведение 1). После перемешивания 1 куб. см разведения 1 переносят с помощью пипетки в пробирку, содержащую 9 куб. см физиологического раствора, и получают таким образом разведение 1:100 (разведение 2). Подобным методом получают требуемое количество других разведений.

При микробиологическом исследовании поверхности скорлупы яиц используют смывы, полученные методом тампона или ополаскивания, или измельчения.

При получении смыва методом тампона яйцо погружают в ступку, содержащую 10 куб. см стерильной водопроводной воды или стерильного физиологического раствора хлористого натрия, и с помощью стерильного тампона обмывают поверхность яйца в течение 2 - 3 мин. Яйцо удаляют, смыв используют для исследования.

При получении смыва методом ополаскивания в стерильную посуду или полиэтиленовый пакет наливают 10 куб. см стерильной водопроводной воды или стерильного физиологического раствора хлористого натрия и погружают яйцо. Затем осуществляют встряхивание в течение 3 - 5 мин. Предварительно посуду закрывают стерильной крышкой, верхнюю часть пакета достаточно сжимают, чтобы не допустить разлива жидкости. Размер пакета 15 х 25 см. Яйцо удаляют, смыв используют для исследования.

При получении смыва методом измельчения скорлупу и подскорлупные оболочки отделяют от содержимого яиц и помещают в стерильные банки. В последних измельчают стеклянными палочками, после чего встряхивают со стеклянными бусами в стерильной водопроводной воде или стерильном физиологическом растворе хлористого натрия. После отстаивания в течение 3 - 5 мин. надосадочную жидкость используют для исследования.

Скорлупу и подскорлупные оболочки можно измельчать пестиком со стерильным стеклянным песком в ступках.

На 90,0 куб. см жидкости берется скорлупа от 3 яиц.

Для исследования используют смыв без разведения или же готовят десятикратные разведения в зависимости от степени загрязнения поверхности скорлупы яиц.

Математически поверхность яйца вычисляют по формуле:

                                     В х Р
                               S = П -----,
                                       2

где:

S - площадь поверхности;

В - ширина;

Р - длина окружности;

П - 3,14.

При микробиологическом исследовании яичных мороженых продуктов (меланжа, белка, желтка) для проверки соответствия качества яичных мороженых продуктов требованиям действующей нормативно-технической документации из разных мест партии отбирают 3% ящиков, но не менее шести. Из общего количества отобранных ящиков отбирают по одному пакету, мешку-вкладышу, банке из каждого отобранного в выборку ящика. Из разных мест каждого пакета, мешка-вкладыша или банки стерильным масляным щупом отбирают не менее четырех столбиков продукта в стерильную посуду.

Отобранные пробы соединяют, размораживают, тщательно перемешивают и получают объединенную пробу массой не более 0,5 кг, которую помещают в стерильную посуду с притертой пробкой.

В случае необходимости отправки проб в лабораторию, находящуюся вне места их отбора, пробы упаковывают в общую тару (ящик, пакет), которую опечатывают, пломбируют и доставляют, не допуская оттаивания продукта.

Из объединенной пробы (массой не более 0,5 кг) стерильным инструментом в стерильную посуду с притертой пробкой отбирают 100 г продукта для проведения микробиологического анализа, остальную часть используют для проведения органолептических и физико-химических методов анализа.

Перед проведением микробиологического исследования оттаивание проб проводится в водяной бане при температуре не выше 45 °С до температуры внутри продукта не выше 1 - 5 °С.

При микробиологическом исследовании яичных сухих продуктов (порошка, белка, желтка) для оценки санитарно-микробиологического качества от партии из разных мест отбирают 3% единиц упаковки, но не менее 3-х единиц.

Из разных мест каждой отобранной в выборку упаковочной единицы отбирают не менее трех точечных проб, взятых в равном количестве.

Отбор проб осуществляют щупом, отборником, черпаком, ложкой, металлической трубкой, шпателем или другим приспособлением, которые каждый раз перед использованием стерилизуют фламбированием или в автоклаве.

Масса пробы, отобранной из каждой бочки, барабана, мешка, ящика или банки N 15, должна быть 0,2 кг. От партии яичного сухого продукта, фасованного в пакеты, отбирают из разных мест каждого отобранного в выборку ящика по три пакета. Из выборки яичного продукта, фасованного в банки, из каждой групповой упаковочной единицы отбирают по одной банке.

Пробы, отобранные, как указано выше, соединяют, тщательно перемешивают, подвергают квартованию и получают объединенную пробу массой 0,5 кг.

Объединенную пробу яичного порошка делят на две равные части, которые помещают в чистые стерильные стеклянные банки с притертыми пробками или полиэтиленовые пакеты.

Полиэтиленовые пакеты завязывают следующим образом: верхнюю часть наполненного пакета собирают в пучок, перегибают и плотно завязывают.

Одну часть направляют в лабораторию для анализа, другую пломбируют, снабжают этикеткой и хранят один месяц при температуре на выше 20 °С и относительной влажности 65 - 75% на случай разногласий при определении качества яичного сухого продукта. На этикетке указывают: наименование предприятия-изготовителя; наименование продукта; дату выработки; номер и размер партии; дату и место отбора проб; фамилии лиц, отобравших пробу; обозначение действующего нормативно-технического документа.

Из объединенной пробы стерильным щупом, отборником, черпаком, ложкой, металлической трубкой, шпателем или другим приспособлением в стерильную посуду отбирают 100 г яичного сухого продукта для проведения микробиологического анализа, остальную часть пробы используют для проведения органолептических и физико-химических анализов.

Для приготовления разведений навеску сухих яичных продуктов массой 10 г, взвешенную с погрешностью +/- 0,01 г, вносят в колбочку с 90 куб. см или массой 20 г в 180 куб. см стерильной водопроводной воды или стерильного физилогического раствора, соблюдая правила асептики, и готовят серию десятикратных разведений яичных продуктов в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта.

При выполнении микробиологических анализов из проб сухих яичных продуктов навески отвешивают на стерильных бумажках или в стерильных чашках, из проб жидких набирают стерильными пипетками.

Содержимое яиц, смывы с их скорлупы, яичные мороженые продукты (меланж, белок, желток), сухие яйцепродукты (порошок, белок, желток) подвергают микробиологическому исследованию по методикам, изложенным в данной Инструкции, и в соответствии с действующей нормативно-технической документацией на эти продукты.

Исследования яиц на сальмонеллы проводят в соответствии с Методическими указаниями "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды" (1990 г.), при этом используют смывы с яичной скорлупы и желток яиц.

При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц. После взятия смывов тампон помещают в 10 куб. см предварительной среды обогащения с последующим исследованием по схеме п. 3.3 настоящей Инструкции.

При исследовании желтков в стерильную посуду помещают 5 желтков (одна проба), их гомогенизируют и используют для посева.

Микробиологические показатели яиц, мороженых и сухих яичных продуктов, их оценка представлены в таблице 1.3.16.

Таблица 1.3.16

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЯИЦ, МОРОЖЕНЫХ И СУХИХ ЯИЧНЫХ ПРОДУКТОВ (МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

И САНИТАРНЫЕ НОРМЫ КАЧЕСТВА ПРОДОВОЛЬСТВЕННОГО СЫРЬЯ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ. МЗ СССР, М., 1989)

-----------------------+-----------------+-------------------------+-------------------
¦Наименования продуктов¦Количество       ¦  Масса продукта (г), в  ¦    Примечание    ¦
¦                      ¦мезофильных      ¦ которой не допускаются  ¦                  ¦
¦                      ¦аэробных и       +-----------+-------------+                  ¦
¦                      ¦факультативно-   ¦   БГКП    ¦патогенные   ¦                  ¦
¦                      ¦анаэробных       ¦(колиформы)¦микроорга-   ¦                  ¦
¦                      ¦микроорганизмов, ¦           ¦низмы, в т.ч.¦                  ¦
¦                      ¦КОЕ/г, не более  ¦           ¦сальмонеллы  ¦                  ¦
+----------------------+-----------------+-----------+-------------+------------------+
¦                      ¦      2         3¦           ¦             ¦                  ¦
¦Яйцо куриное диетиче- ¦5 х 10  - 5 х 10 ¦0,1        ¦5 х 25       ¦<*> В желтках 5   ¦
¦ское                  ¦                 ¦           ¦             ¦яиц сальмонеллы не¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦допускаются       ¦
¦                      ¦      4         5¦           ¦             ¦                  ¦
¦Яйцо куриное столовое ¦5 х 10  - 5 х 10 ¦0,1 - 0,01 ¦25           ¦                  ¦
¦                      ¦      5          ¦           ¦             ¦                  ¦
¦Меланж яичный мороже- ¦5 х 10           ¦0,1        ¦25           ¦<*> Не допускаются¦
¦ный; желтки и белки   ¦                 ¦           ¦             ¦St. aureus и про- ¦
¦яичные мороженые <*>  ¦                 ¦           ¦             ¦тей в 1 г         ¦
¦Продукты яичные       ¦                 ¦           ¦             ¦                  ¦
¦мороженые:            ¦      5          ¦           ¦             ¦                  ¦
¦Меланж яичный         ¦5 х 10           ¦0,1        ¦25           ¦Дополнительно     ¦
¦мороженый             ¦                 ¦           ¦             ¦к ОСТ 4911-197-83,¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦а также протей и  ¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦St. aureus в 1 г  ¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦не допускаются    ¦
¦                      ¦      5          ¦           ¦             ¦                  ¦
¦Меланж яичный мороже- ¦5 х 10           ¦0,1        ¦25           ¦То же             ¦
¦ный с солью и сахаром ¦                 ¦           ¦             ¦                  ¦
¦Яичный порошок        ¦-                ¦0,1        ¦25           ¦Протей в 1 г не   ¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦допускается       ¦
¦                      ¦      5          ¦           ¦             ¦                  ¦
¦Яичный порошок для    ¦1 х 10           ¦0,1        ¦25           ¦Протей в 1 г не   ¦
¦продуктов энтерального¦                 ¦           ¦             ¦допускается       ¦
¦питания               ¦                 ¦           ¦             ¦St. aureus в 1 г  ¦
¦                      ¦                 ¦           ¦             ¦не допускается    ¦
-----------------------+-----------------+-----------+-------------+-------------------

Примечание: БГКП - сбраживающие лактозу с образованием кислотного газа при (37 +/- 0,5) °С.

Микробиологический контроль качества проводят в каждой партии выпускаемого продукта.

При несоответствии яиц и яйцепродуктов требованиям по микробиологическим показателям их направляют на выработку термически обрабатываемых продуктов.

2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ

2.1. Помещения для микробиологических исследований

Микробиологическая лаборатория включает в себя следующие помещения:

комнату (около 24 кв. м) с боксом для посевов;

средоварочную (18 кв. м) с боксом;

автоклавную (16 кв. м);

моечную (18 кв. м);

препараторскую.

Комната для бакисследований с застекленным боксом и предбоксником. Бокс оборудован подвесными бактерицидными лампами, осветительными лампами. Количество бактерицидных ламп из расчета мощности облучения 2,5 Вт/куб. м.

В боксе находятся:

стол, винтовой стул;

склянка с дезраствором;

склянка со спиртом;

склянка с ватой и ватными тампонами;

склянка с инструментами (пинцет, скальпель, петля бактериологическая, шпатель, консервный нож, пробойник, ножницы);

склянка для отработанных пипеток;

склянка с карандашами по стеклу;

спиртовка или газовая горелка Бунзена;

металлический поддон.

Посевы производят в боксе. Бокс комплектуется из двух отделений: собственно бокса и предбоксника. Предбоксник служит для надевания специальной санитарной одежды (халаты, колпаки или косынки) и вспомогательных работ. Выключатель к бактерицидным лампам устанавливается на наружной стенке бокса. Бактерицидные лампы включаются по окончании работы и уборки помещения в отсутствие персонала на 30 - 60 мин.

Ежедневно после окончания работ помещение бокса моют горячей водой с мылом или порошком и протирают досуха.

Дезинфекцию помещений производят протиранием всех поверхностей хлорным или другими дезинфицирующими препаратами по соответствующей для каждого препарата инструкции и с помощью бактерицидных ламп.

Воздух в боксе регулярно, не менее 2 раз в неделю, следует проверять на бактериальную загрязненность. Чашки с мясопептонным агаром и средой Сабуро оставляют открытыми на 15 мин. Посев на МПА, со средой из СПА выдерживают в термостате 48 ч при 37 °С, чашки со средой Сабуро - 96 ч при 22 °С. Допустимым ростом считаются 5 колоний на чашках.

В комнате - не менее 2-х письменных столов со стульями для бактериологов, лабораторные столы для оборудования (микроскоп - 2 шт.; весы - 3 шт. (торзионные, циферблатные, рычаговые); баня водяная с электроподогревом; микроизмельчитель тканей; аппарат для встряхивания колб, анаэростат; склянка и кювета для окраски мазков);

шкафы для красок, химреактивов, сухих питательных сред; стерильной посуды: пипеток, пробирок, чашек Петри и др.;

термостаты - не менее 3 шт. (на 30°, 37°, 55°);

холодильники - 2 шт. (для выделенных культур и для чистых сред);

умывальник с предметами личной гигиены.

Средоварочная обеспечивается:

шкафами с лабораторной посудой (колбы плоскодонные разные, пробирки в металлических корзинах, цилиндры, стаканы и др.); с посудой для варки (кастрюли, металлические кюветы и др.); электро- или газовой плитой на 4 конфорки;

электроплитками - 2 - 3 шт.;

pH-метром;

холодильником - 2 шт.;

раковинами и умывальником с предметами личной гигиены.

Автоклавная оборудуется:

автоклавами - 2 шт. (один для чистых материалов, второй для инфицированных);

сушильно-стерилизационными шкафами;

перегонными аппаратами (один для дистиллированной, второй для бидистиллированной воды);

столами - 2 шт. (один для чистых, второй для инфицированных материалов).

Моечная оборудуется:

нагревательными приборами для подогрева воды;

раковинами;

досками для сушки посуды;

сушильными шкафами;

баками с дезрастворами;

шкафами для посуды и хранения моечных средств.

Препараторская служит для хранения запасов имущества (посуды, красок, химикалиев, питательных сред, аппаратов, приборов и пр.). В ней устанавливают шкафы, столы, холодильник. Здесь готовят растворы красок, солей, дезинфицирующих средств; ватные пробки.

2.2. Оборудование, аппаратура, материалы и реактивы для лаборатории

Микробиологический отдел производственной лаборатории должен быть оснащен всем необходимым для проведения бактериологических анализов.

Количество единиц оборудования, аппаратуры и реактивов зависит от ассортимента выпускаемой продукции и количества ежедневных анализов.

Примерный перечень аппаратуры, материалов, реактивов для оснащения микробиологической лаборатории представлен ниже.

Оборудование и аппаратура, инструменты:

Автоклав для стерилизации чистой посуды и питательных сред

Автоклав для убивки отработанного материала и бактериальных культур

Аппарат для встряхивания (шуттель)

Анаэростат

Баня водяная с терморегулятором, обеспечивающим температуру до 100 °С с точностью до +/- 0,5 °С

Весы лабораторные

Гомогенизатор по ГОСТ 9111-59

Горелки газовые и спиртовые по ГОСТ 10090-74

Дистиллятор электрический Д-4

Лампы бактерицидные ДБ-20 или ДБ-60 (1,5 - 2,5 Вт на 1 куб. м воздуха)

Лупа с увеличением 8 - 10х по ГОСТ 8309-75

Микроскоп биологический МБИ, МБВ или другой марки по ГОСТ 8284-67

Мясорубка по ГОСТ 4025-73

Ножи из нержавеющей стали

Нож консервный

Ножницы из нержавеющей стали

Палочки стеклянные по ГОСТ 9425-71

Петля бактериологическая

Пинцеты разные

Плита газовая или электрическая бытовая

Прибор Зейца с воронками (фильтр Зейца) и прибор для подсчета колоний

Пробоотборники, ложки, долота из нержавеющей стали

Скальпели разные

Сушильный шкаф

Ступка фарфоровая вместимостью 300 - 500 куб. см с пестиками по ГОСТ 10444.1-84

Термостаты с диапазоном температур 24 - 70 °С

Термометры от 0 - 5 °С до 50 - 100 °С, 100 - 150 °С по ГОСТ 2823-73

Треножник металлический

Холодильники бытовые

Часы песочные на 1, 2, 3, 5 мин. по ГОСТ 10576-74

Шпатели стеклянные

Штативы для пробирок разной вместимости

Электроплитки по ГОСТ 306-69.

Материалы:

Бумага оберточная

Бумага пергамент, полупергамент

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-75

Карандаши по стеклу

Марля медицинская по ГОСТ 9412-77

Мыло

Порошки стиральные

Сетка асбестовая

Фильтр асбестовый

Шпагат

Щетки, ерши для мойки посуды.

Реактивы, краски, среды, препараты:

Агар микробиологический по ГОСТ 17206-71

Агар сухой питательный, выпускаемый Минмедпромом, готовят по прописи на этикетке

Агар висмут-сульфитный

Альфа-нафтол (ГОСТ 5838-79)

Бромкрезолпурпур (ТУ 6-09-1386-76)

Бромтимоловый синий (ТУ 6-09-2045-72)

Вазелин медицинский (ГОСТ 3882-52)

Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72)

Генциан фиолетовый

Глицерин, х.ч. (ГОСТ 6824-76)

Глюкоза, х.ч., ч.д.а. (ГОСТ 6038-79)

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) высокополимеризованная (ТУ 6-09-4230-78)

Дрожжи хлебопекарные прессованные (ГОСТ 171-69)

Дрожжевой автолизат

Дрожжевой экстракт

Железо сернокислое (ГОСТ 4148-78)

Желчь крупного рогатого скота или медицинская (билирубин, ТУ 6-09-10-364-75)

Зелень бриллиантовая (ТУ 6-09-42-78-76)

Йод кристаллический (ГОСТ 4159-79)

Калий гидрат окиси (едкий) технический (ГОСТ 9285-76)

Калий йодистый (ГОСТ 4275-74)

Калий фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 2493-75)

Калий фосфорнокислый однозамещенный (ГОСТ 4198-75)

Калий углекислый (мел, ГОСТ 83-79)

Кальций фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 3204-76)

Кальций хлористый (ГОСТ 4460-77)

Картофель свежий продовольственный (ГОСТ 7176-68)

Кислота лимонная (ГОСТ 908-79Е)

Кислота соляная (ГОСТ 3118-67)

Кислота фосфорная (ГОСТ 10678-71)

Кислота уксусная (ГОСТ 61-75)

Крахмал растворимый (ГОСТ 10163-76)

Кристаллический фиолетовый (ТУ 6-09-4119-75)

Лактоза (ТУ 6-09-229-72)

Лакмус (ТУ 6-09-4313-76)

Магний хлористый

Мальтоза (ТУ 6-09-3476-73)

Масло вазелиновое (ГОСТ 3164-78)

Масло иммерсионное (ТУ 81-05-79-69)

Метиловый красный (ГОСТ 5853-51)

Молоко свежее пастеризованное (ГОСТ 13277-79)

Мочевина (ГОСТ 6691-77)

Натрий гидрат окиси (едкий, ГОСТ 11078-78)

Натрий селенистокислый

Натрий сернокислый (ГОСТ 429-76)

    Натрий фосфорнокислый двузамещенный Cl H O (ГОСТ 4172-76)
                                          2 2

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (ГОСТ 246-76)

Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный (ГОСТ 11773-76)

Натрий хлористый (ГОСТ 4233-77)

Парафин (ГОСТ 23683-79)

Пептон бактериологический (ГОСТ 13805-76)

Перекись водорода (ГОСТ 10929-76)

Печень говяжья, свиная

Плазма сухая или свежеприготовленная кроличья или человека, приготовленная по ГОСТ 10444.2-75

Сахароза, ч.д.а. (ГОСТ 5833-75)

Спирт этиловый 70- и 96-процентный (ГОСТ 18300-72 и ГОСТ 5962-67)

Среды сухие питательные, выпускаемые Минпищепромом или Минмедпромом, готовят по прописи на этикетке:

с маннитом и индикатором ВР;

с глюкозой и индикатором ВР;

среда Кода;

среда Левина;

среда Плоскирева;

среда Эндо

Трифенилтетразолий хлорид 2, 3, 5 (ТУ 6-09-3838-78)

Яйца куриные свежие

Растворы буферные для проверки pH-метра.

Дезинфицирующие вещества:

Хлорная известь

Хлорамин

Пергидроль

Фенол, едкий натр

и другие хлорсодержащие вещества, разрешенные Минздравом СССР.

2.3. Лабораторная посуда, ее подготовка и хранение

В микробиологическом отделе производственной лаборатории должна быть следующая посуда:

Ведра эмалированные с крышками

Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-64

Кастрюли эмалированные разной вместимости (0,5 л, 1 л, 2 л, 3 л) по ГОСТ 17151-71

Колбы стеклянные широкогорлые плоскодонные на 50, 100, 150, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000 куб. см по ГОСТ 10972-72

Лотки эмалированные

Пипетки пастеровские

Пипетки бактериологические вместимостью 1, 2, 5, 10, 20 куб. см с ценой деления 0,01 куб. см на полное опорожнение по ГОСТ 1770-74

Поплавки стеклянные (маленькие пробирки, преципитационные)

Пробирки бактериологические по ГОСТ 10515-75

Стеклянные банки с крышками 0,5 - 1,5 л

Стекла покровные по ГОСТ 6672-75

Стекла предметные по ГОСТ 9274-75

Стекла часовые одиночные 600 - 800 мм

Стаканчики для взвешивания (бюкса) разной вместимости

Цилиндры стеклянные мерные вместимостью 50, 100, 500 куб. см

Чашки Петри бактериологические по ГОСТ 10973-75.

Лабораторная посуда для микробиологических исследований подвергается мойке, сушке, упаковке в бумагу или специальные металлические закрывающиеся футляры и стерилизации.

При подготовке новой посуды ее погружают в ведро с теплой водой, в которой растворяют хозяйственное мыло, и ставят на слабый огонь. После 15-минутного кипячения посуду вынимают, ополаскивают чистой водой. Затем кипятят в течение 15 мин. в подкисленной воде (1 - 2-процентные растворы соляной кислоты), ополаскивают водопроводной и дистиллированной водой.

Посуду, бывшую в употреблении, моют 0,5-процентным щелочным раствором с помощью ершей и щеток и ополаскивают водопроводной водой.

Посуда, в которой содержался зараженный материал, поступает в мойку после предварительной дезинфекции (убивки в автоклаве), гарантирующей гибель находящихся в ней патогенных микроорганизмов. Сильно загрязненную посуду со следами жира, красок и иммерсионного масла опускают на 2 ч в хромовую смесь, подогретую до 45 °С, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.

Посуду с питательными средами после подсчета на них споровых микроорганизмов обеззараживают перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °С в течение 1,5 ч.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре (холодная сушка) или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 100 - 105 °С.

Предметные стекла после мойки и ополаскивания вытирают чистой салфеткой или помещают в склянку с притертой пробкой в смесь спирта и этилового эфира в соотношении 1:1.

Лабораторную посуду перед использованием стерилизуют. Стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при температуре 150, 160 и 180 °С соответственно 2 ч, 1 ч и 30 мин.; или в автоклаве при давлении 1 атм. (121 °С) в течение 30 мин. - 1 ч.

Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывает ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1 - 5 шт. Пастеровские пипетки по 3 - 15 шт. заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты.

Изготовленные ватные или марлевые тампоны стерилизуют каждый в отдельности или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 30 мин.

Тампон может быть закреплен на конце металлической проволоки или деревянной палочки, пропущенной через ватную пробку. В этом случае его вместе с пробкой вставляют в пробирку с 3 - 4 или 10 куб. см физиологического раствора.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

Срок хранения стерильной посуды не более 30 суток.

3. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

3.1. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - общее микробное число (ОМЧ)

Метод основан на количественном подсчете колоний микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре при температуре 30 °С в течение 72 ч.

При исследовании образцов на ОМЧ руководствуются ГОСТ 26670-86, ГОСТ 9958-81 с учетом нижеизложенных рекомендаций.

Для определения ОМЧ следует выбирать разведения, при посеве которых на чашках Петри вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. При посеве продуктов, не требующих разведения, учитывают все выросшие на чашках колонии (т.е. и менее 30).

При посеве по 1 куб. см цельного продукта или каждого соответствующего его разведения вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение) и заливают в каждую чашку по 15 - 20 куб. см агаризованной питательной среды, расплавленной на водяной бане и остуженной до 45 °С. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат дном вверх, инкубируют при 30 °С в течение 72 ч; при необходимости предварительный учет производят через 48 ч.

Количество колоний подсчитывают на каждой из высеянных чашек. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном кверху. Каждую колонию отмечают на дне чашки чернилами или тушью.

При подсчете придерживаются следующих правил:

- если на чашке выросло небольшое количество колоний, примерно до 100, подсчитывают все колонии;

- если колонии распределены равномерно и их количество измеряется несколькими сотнями (200 - 300 колоний), допускается подсчет колоний не менее чем на 1/3 площади чашки. В этих случаях дно чашки делят карандашом на 6 секторов и считают колонии в 3 секторах. Затем делают пересчет на всю площадь чашки: вычисляют среднее количество колоний на площади одного сектора и полученное количество колоний на одном секторе умножают на 6.

Число колоний, выросших на чашке, должно отражать количество жизнеспособных микроорганизмов, содержащихся в засеянном объеме исследуемого материала. Поскольку последний, как правило, засевают в разведенном виде, число выросших на чашке колоний умножают на степень взятого разведения, рассчитывают среднее арифметическое и устанавливают количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 куб. см продукта.

При установлении количества мезофильных бактерий не все чашки могут быть использованы для вычисления среднего арифметического:

- нельзя использовать посевы для вычисления среднего арифметического, если количество выросших колоний на чашках менее 30. В этом случае в протокол исследований вносят показатели обсемененности, полученные при подсчете колоний только по одной или двум чашкам, число колоний на которых больше 30. В случае роста колоний на засеянных чашках в количестве менее 30 в результатах анализа рекомендуется следующая формулировка: "Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)";

- не используются посевы для вычисления среднего арифметического показателя на тех чашках, на поверхности которых более чем на 1/2 площади отмечается ползучий рост спорообразующих микроорганизмов; последние могут маскировать рост прочих бактерий. Возможны случаи, когда на чашках из всех разведений получен рост споровых микроорганизмов, и подсчет изолированных колоний практически невозможен. В этих случаях в протоколе исследования следует указать: "Рост спорообразующих микроорганизмов".

Пример расчета: если на чашках Петри при посеве 0,1 г продукта выросло в среднем 135 колоний, а при посеве 2-го разведения (0,01 г продукта) - 9 колоний, то в результатах исследования учитывают цифровые данные, полученные при посеве 1-го разведения, т.е. количество микроорганизмов 135 х 10 = 1350 в 1 г продукта.

Для получения более точных данных по количеству мезофильных бактерий целесообразно сопоставлять результаты подсчета колоний, полученные на чашках, с посевами материала из последовательных разведений. Числа подсчитанных колоний должны примерно соответствовать кратности взятых разведений.

Если количество колоний на чашках с посевами из последующих разведений (1:10, 1:100) почти совпадает или мало между собой разнится, то это указывает на недостаточное перемешивание посевного материала при приготовлении разведений и перед посевом.

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек

В соответствии с принятой международной номенклатурой в настоящей Инструкции к бактериям группы кишечных палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24 - 48 ч, в основном являющиеся представителями родов Esherichia Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.е. учитываются как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП).

Методы исследования на БГКП приведены в ГОСТ 7702.2-74, ГОСТ 9988-81, при этом следует учитывать следующие методические рекомендации.

Для посева используют то количество продукта (1 г и т.д.), в котором предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий). Посев производят в среду Кесслер с лактозой (с поплавками) либо в среду Хейфеца с лактозой (с поплавками) с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10. Применение среды Кода не допускается.

Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. При отсутствии признаков роста - газообразования и изменения среды дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) и о соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП.

При наличии признаков роста на среде Кесслер или Хейфеца для окончательного заключения о наличии в продукте БГКП из подозрительных пробирок производят посев на чашки со средой Эндо или Левина. Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 18 - 24 ч.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для БГКП (на среде Эндо - красных с металлическим блеском или без него, розовых и бледно-розовых, на среде Левина - черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром), засеянная навеска продукта считается не загрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на бактерии группы кишечных палочек.

При наличии на среде Эндо или Левина типичных для кишечных палочек (колиформных бактерий) колоний их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивая их по Граму, и микроскопируют. Обнаружение типичных для кишечных палочек грамотрицательных не содержащих спор палочек указывает на наличие бактерий группы кишечных палочек в анализируемой массе продукта и несоответствие продукта микробиологическому нормативу.

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ ОБРАЗЦОВ НА НАЛИЧИЕ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК (КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ)

--------------------------                 --------------------------------
¦   Посев пробы (1 г,    ¦                 ¦ Посев пробы сухого продукта  ¦
¦1 куб. см из разведений)¦                 ¦(1 г, 1 куб. см из разведений)¦
-----------+--------------                 ----------------+---------------
           ¦                                               \/
           ¦                               --------------------------------
           ¦                               ¦  Фосфатный буферный раствор  ¦
           ¦                               ¦  (инкубирование при 37 °С в  ¦
           ¦                               ¦      течение 18 - 24 ч)      ¦
           ¦                               ----------------+---------------
           \/             (на одну из сред)                \/
       ---------------------------------------------------------
       \/                                                      \/
--------------------------                 --------------------------------
¦     Среда Кесслер      ¦                 ¦ Среда Хейфеца (инкубирование ¦
¦(инкубирование при 37 °С¦                 ¦     при 37 °С в течение      ¦
¦    в течение 24 ч)     ¦                 ¦          12 - 24 ч)          ¦
---------------------+----                 ----+---------------------------
                     ------------      ---------
                                \/     \/
                           ------------------
                           ¦Просмотр посевов¦
                           -----+------+-----
         ------------------------      -------------
         \/                                        \/
------------------                          ---------------
¦Отсутствие роста¦                          ¦Наличие роста¦
---------+--------                          -------+-------
         \/                                        ¦(на одну из сред)
------------------                    -------------+-------------
¦   ЗАКЛЮЧЕНИЕ   ¦                    \/                        \/
------------------     ----------------------------------------------------
                       ¦       Среда Эндо       ¦¦      Среда Левина      ¦
                       ¦(инкубирование при 37 °С¦¦(инкубирование при 37 °С¦
                       ¦  в течение 18 - 24 ч)  ¦¦  в течение 18 - 24 ч)  ¦
                       ---------------+-------------------------+----------
                                      \/                        \/
                                     ------------------------------
                                     ¦      Просмотр посевов      ¦
                                     ---------------+--------------
                                                    \/
                                     ------------------------------
                                     ¦         ЗАКЛЮЧЕНИЕ         ¦
                                     ------------------------------

3.3. Определение бактерий из рода сальмонелл

Сальмонеллы - обширный род семейства энтеробактерий, включающих более 2200 серотипов, большинство из которых обладает патогенными свойствами. К сальмонеллам относятся аэробные и факультативно-анаэробные грамотрицательные подвижные (за исключением S. gallinarum-pullorum) палочки, хорошо растущие на обычных питательных средах и разнообразных пищевых субстратах.

При исследовании образцов на наличие сальмонелл руководствуются ГОСТ 7702.2-74; ГОСТ 9958-81; ГОСТ 25311-82 с учетом нижеизложенных методических рекомендаций.

Навеску продукта (25 г или др.) высевают в пептонную буферную воду в соотношении 1:9. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18 - 24 ч.

После этого производят пересев по 1 куб. см культуры из пептонной буферной воды в одну из сред: Мюллера, Кауфмана, хлормагниеваемую М, селенитовый бульон в соотношении посевного материала и среды 1:9. Посевы инкубируют 24 - 48 ч при 37 °С.

Через 24 ч и 48 ч со второй среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, магниевой, селенитового бульона) пересевают на две любые дифференциальные среды (по выбору): Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар.

Посевы просматривают через 18 - 24 ч термостатирования при 37 °С. При отсутствии роста подозрительных колоний инкубирование посевов продолжают еще 24 ч.

Сальмонеллы на средах Эндо и Плоскирева растут в виде прозрачных бесцветных колоний, на среде Левина - бледно-розовых, голубоватых, розовато-фиолетовых колоний. На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных колоний с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют S. paratyphoid, S. choleraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum и некоторые другие, которые при росте на висмут-сульфитном агаре образуют нежные светло-зеленые или серовато-зеленые колонии.

Из каждой среды на чашке Петри из подозрительных колоний (не менее трех) производят посев штрихом и уколом на одну из комбинированных сред (Олькеницкого, Клиглера, Ресселя).

Пробирки с посевами выдерживают в термостате при 37 °С 24 ч. Производят идентификацию культур, высеянных на комбинированные среды, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины.

Покраснение или пожелтение скошенной части столбика среды Олькеницкого указывает на образование кислоты в результате ферментации лактозы, сахарозы или обоих сахаров. Покраснение или пожелтение самого столбика указывает на расщепление глюкозы. Восстановление цвета среды до исходного (бледно-розовый) свидетельствует о расщеплении мочевины.

Механизм действия среды Клиглера и Ресселя идентичен со средой Олькеницкого. Об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелл.

Культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа), подвергаются дальнейшему исследованию.

Подозрительные колонии с комбинированной среды пересевают в пробирки со скошенным МПА, а также на среды Гисса с сахарами, 1-процентную пептонную воду для определения индола и сероводорода.

Сальмонеллы расщепляют маннит с образованием кислоты, вследствие чего меняется цвет среды Гисса.

При исследовании на индол и сероводород из подозрительной колонии микроорганизмы высевают в пробирки с 1-процентной пептонной водой и термостатируют при 37 °С 24 ч. Затем в пробирку с суточной культурой по стенке добавляют 5 - 10 капель реактива Эрлиха. При наличии индола не позднее чем через 5 мин. в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии кольцо остается светло-желтого цвета.

Для определения индолообразования пользуются также реактивом Ковача. К суточной культуре добавляют 0,2 - 0,3 куб. см реактива и взбалтывают. Результаты учитывают через 10 мин.: реактив поднимается на поверхность среды и при наличии индола окрашивается в темно-красный цвет.

Сальмонеллы индола не образуют.

Для определения сероводорода в пробирку с посевом культуры в 1-процентную пептонную воду помещают под пробку полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченной уксусно-кислым свинцом и высушенной. Полоска не должна соприкасаться с питательной средой. Посев инкубируют при 37 °С 24 - 72 ч. Если культура выделяет сероводород, то бумажка с уксусно-кислым свинцом чернеет от образующегося сернистого свинца.

При использовании среды Клиглера об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

Сальмонеллы выделяют сероводород.

Из пробирок с комбинированной средой с суточной культурой, показавшей типичную окраску среды для сальмонелл, или из пробирок с суточной культурой, пересеянной на МПА, проводят серологическое исследование. Для этого петлей берут небольшое количество культуры из пробирок, эмульгируют в капле физиологического раствора на предметном стекле. Добавляют каплю поливалентной O-сыворотки к раствору и осторожно покачивают предметное стекло, чтобы смешать жидкости.

Положительная реакция на сальмонеллы (агглютинация) наблюдается в течение 30 - 60 сек. Обязательна постановка отрицательной реакции (культура + физиологический раствор). Если при проведении серологического исследования агглютинация не обнаруживается, конечный результат записывают как отсутствие сальмонелл.

Любая агглютинация, которая появляется на стекле, говорит о вероятности присутствия сальмонелл.

По показаниям для полной биохимической типизации сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд (ГОСТ 7702.2-74) и реакцию агглютинации не только с O-, но и с H-сыворотками (ГОСТ 7702.2-74).

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ ОБРАЗЦОВ НА НАЛИЧИЕ САЛЬМОНЕЛЛ

                     Посев проб (25 г или др. навески)
----------------------                 ------------------------------------
¦  Среда обогащения  ¦                 ¦Пересев на вторую среду обогащения¦
¦(пептонно-буферная).+---------------->¦(одну из сред: Мюллера, Кауфмана, ¦
¦Инкубирование 37 °С ¦       ----------+ магниевую, селенитовый бульон).  ¦
¦     18 - 24 ч      ¦       ¦         ¦   Инкубирование 37 °С 24 - 48 ч  ¦
----------------------       \/        ------------------------------------
---------------------------------                        ------------------
¦Пересев на две дифференциально-+----------------------->¦Просмотр посевов¦
¦ диагностические среды (Эндо,  ¦        ----------------+---------+-------
¦  Плоскирева, Левина, висмут-  ¦        ¦                         \/
¦ сульфитный агар - по выбору). ¦        ¦               ------------------
¦ Инкубирование 37 °С 18 - 24 ч ¦        ¦               ¦Отсутствие роста¦
---------------------------------        ¦               ¦ подозрительных ¦
                                         ¦               ¦    колоний     ¦
            ------------------------------               ----------+-------
            \/                                                     \/
---------------------- ---------------------- -----------------------------

¦Отбор подозрительных¦ ¦Отбор подозрительных¦<+Инкубирование посевов на   ¦
¦      колоний       ¦ ¦      колоний       ¦ ¦дифференциально-диагности- ¦
------------+--------- ---------+------------ ¦ческих средах 37 °С 24 ч   ¦
            \/                  \/            ---------------------+-------
------------------------------------                               \/
¦Пересев на одну из комбинированных¦          -----------------------------
¦  сред (Олькеницкого, Клиглера,   ¦          ¦     Отсутствие роста      ¦
¦  Ресселя). Инкубирование 37 °С   ¦          ¦  подозрительных колоний   ¦
¦            18 - 24 ч             ¦          ---------------------+-------
----------------------+-------------                               \/
                      \/                      -----------------------------
      ------------------------------          ¦     Работу с посевами     ¦
   ---+Просмотр посевов через 24 ч,+--¬       ¦        прекращают         ¦
   ¦  ¦         48 ч, 72 ч         ¦  ¦       ---------------------+-------
   ¦  ------------------------------  ¦        /\                  ¦
   \/                                 \/       ¦                   ¦
-----------------------------------------------+-¬                 ¦
¦  Наличие характерных  ¦¦Отсутствие характерных ¦                 ¦
¦биохимических изменени馦биохимических изменений¦                 ¦
------------+-------------------------------------                 ¦
            \/                                                     \/
-------------------------                            ----------------------
¦Пересев на цветной ряд ¦                            ¦     ЗАКЛЮЧЕНИЕ     ¦
¦   с дополнительными   ¦                         -->¦    об отсутствии   ¦
¦        тестами        ¦                         ¦  ¦     сальмонелл     ¦
------------+------------           ------------->¦  ----------------------
            \/                      ¦             ¦  ----------------------
-------------------------           ¦             ¦  ¦     ЗАКЛЮЧЕНИЕ     ¦
¦Просмотр посевов через ¦           ¦             L->¦о наличии сальмонелл¦
¦   24 ч, 48 ч, 72 ч    ¦           ¦                ----------------------
------------+------------           ¦
            \/                      ¦
-------------------------           ¦
¦    Биохимическая и    ¦           ¦
¦    серологическая     +------------
¦     идентификация     ¦
-------------------------

3.4. Определение сульфитредуцирующих клостридий

    К  сульфитредуцирующим клостридиям относятся облигатные спорообразующие
анаэробные  бактерии,  которые  восстанавливают  сульфит  натрия (Na SO ) в
                                                                    2  3
сульфид  натрия  (Na S),  последний,  соединяясь  с хлорным (или цитратным)
                    2
железом, образует черное соединение сернистого железа (FeS).

Методы исследования на сульфитредуцирующие клостридии приведены в ГОСТе 9958-81 с изменением N 2, в ГОСТе 10444.9-88. Ниже приведены методические рекомендации с учетом стандартных методик.

Выделение сульфитредуцирующих клостридий из исследуемой пробы проводят в 2 этапа, которые включают в себя обнаружение сульфитредуцирующей способности микроорганизмов и доказательство, что выделенные микроорганизмы являются клостридиями, так как сульфитредуцирующей способностью обладают не только клостридии, но и многие энтеробактерии.

В зависимости от последовательности этапов возможны 2 способа проведения исследований.

Первый способ исследования. Сначала определяют, что микроорганизмы обладают сульфитредуцирующей способностью. Для этого по 1 куб. см исходного материала или его разведения производят посев либо в чашки Петри глубинным способом с заливкой средой Вильсон-Блера или другими агаризованными средами с сульфитредуцирующими растворами, либо в стерильные пробирки с заливкой посевного материала названными средами высоким столбиком (10 - 12 куб. см).

Посевы термостатируют в анаэростате при температуре (37 +/- 0,5) °С в течение 48 ч. При отсутствии анаэростата посевы заливают слоем (не менее 2 мм) голодного агара с последующим инкубированием в термостате 24 - 48 ч.

Сульфитредуцирующие микроорганизмы образуют темно-серые или черные колонии и вызывают потемнение среды.

Для подтверждения принадлежности выросших колоний к клостридиям производят пересев в пробирки со средой Китт-Тароцци, прогретые непосредственно перед посевом 25 мин. в кипящей водяной бане и охлажденные до 40 - 50 °С. Термостатирование проводят при (37 +/- 0,5) °С 24 - 48 ч. Сразу после появления признаков роста (помутнение среды, выделение газа, появление постороннего запаха) проводят микрокопирование, выявляют каталазную активность микроорганизмов с помощью раствора перекиси водорода (30 г/куб. дм). При наличии в мазках спорообразующих палочек, при отсутствии каталазы, о чем судят по отсутствию пузырьков газа при добавлении к капле культуральной жидкости на предметном стекле такого же количества перекиси водорода, делают заключение о принадлежности микроорганизмов к клостридиям.

В случае отсутствия спор в мазке, положительной пробы на каталазу производят пересев со среды Китт-Тароцци на чашку Петри глубинным способом с заливкой 35 - 40 куб. см питательного агара или средой Вильсон-Блера. Застывшую поверхность плотной среды в первом случае накрывают стерильным предметным стеклом, во втором случае (при использовании среды Вильсон-Блера) заливают голодным агаром. Чашки переворачивают и термостатируют 24 - 48 ч при (37 +/- 0,5) °С. Появление колоний в глубине агара на 2 - 3 мм от края стекла свидетельствует о том, что микроорганизмы являются клостридиями. Появление в чашках со средой Вильсон-Блера в нижнем слое агара черных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии в посевах сульфитредуцирующих клостридий.

Второй способ исследования заключается в первоначальном выделении клостридий, а затем в установлении их сульфитредуцирующей способности. Второй способ отличается от первого только последовательностью посевов в питательные среды. Сначала исследуемый материал высевают в среду Китт-Тароцци, производят микрокопирование, определение каталазы, а затем, установив принадлежность микроорганизмов к клостридиям, производят пересев на среды с сульфитредуцирующими растворами (Вильсон-Блера и др.).

3.5. Методика выделения бактерий рода протей

Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии рода протей.

Из продукта или соответствующих разведений высевают по 1,0 куб. см в жидкую среду обогащения (среда жидкая селективная). Посевы инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 48 ч.

Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды при росте бактерий, расщепляющих мочевину; наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выявляемых бактерий.

Для подтверждения присутствия бактерий рода протей из всех пробирок, в которых наблюдается помутнение среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред (агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Лейфсону в модификации Хайнса, агар дифференциально-диагностический), чтобы получить рост изолированных колоний.

Посевы инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 48 ч.

На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой формы диаметром 1 - 3 мм. Бактерии рода протей обладают свойством роения (ползучим ростом).

Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний для выделения чистых культур и дальнейшего изучения.

Для получения чистых культур используют скошенный в пробирке мясопептонный агар или мясопептонный бульон. Посевы инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 24 ч.

Биохимическое подтверждение бактерий рода протей проводят следующим образом: из 24-часовой культуры делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара (среда для расщепления фенилаланина), культивируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 48 ч, после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3 - 5 капель раствора хлорного железа, при этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.

Бактерии рода протей дают положительную реакцию.

Для определения образования сероводорода культуру высевают методом укола в столбик и штрихами на поверхности агаризованной среды (агар тройной сахарный с цитратом железа).

Посевы инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик чернеет. Бактерии рода протей образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.

3.6. Определение коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus)

St. aureus - аэробные грамположительные сферические пигментообразующие микроорганизмы, обладающие ферментом коагулазой. Большая часть St. aureus способна к продукции энтеротоксинов.

Метод основан на способности стафилококков расти на питательных средах с повышенным содержанием поваренной соли. Принадлежность к St. aureus определяют по способности коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

Исследования проводят по ГОСТ 7702.2-74; ГОСТ 9958-81 с учетом нижеизложенных рекомендаций.

При исследовании сухих продуктов перед посевами на питательные среды проводят предварительную инкубацию в фосфатном буферном растворе. Для этого 1 г продукта помещают в 9 куб. см раствора, смесь выдерживают при температуре 37 °С в течение 18 - 24 ч. На следующий день пипеткой переносят 1 куб. см смеси в пробирку с солевым бульоном.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: