Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных

При постановке реакции в трех пробирках в первую наливают 0,1 мл испытуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки 0,2 мл переносят во вторую пробирку и 0,1 мл - в третью, в которую затем добавляют 0,1 мл физиологического раствора (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, как указано в подпункте 4.3.2.

Разлив сывороток, физиологического раствора и других компонентов реакции производят при помощи пипеток или аппарата Флоринского.

Реакцию проводят по схеме главного опыта (см. таблицу 3).

Главный опыт сопровождается следующими контролями:

негативная и бруцеллезная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

гемолитическая система (0,6 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы).

4.3.5. Постановка реакции длительного связывания комплемента.

Реакцию длительного связывания комплемента на холоде проводят в пробирках в объеме сыворотки, антигена и комплемента по 0,2 мл, гемолитической системы - в оттитрованной рабочей дозе.

Последовательность постановки РДСК

Первый день. Разлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и
             для титрования гемолитической системы. Инактивирование
             сывороток.
             Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и
             гемотоксичность.
             Разлив антигена и комплемента.
             Приготовление гемолитической системы.
             Помещение пробирок в холодильник.

Второй день. Выдерживание пробирок главного опыта и гемолитической системы
             при комнатной температуре 20 минут.
             Титрование гемолитической системы.
             Определение рабочей дозы гемолитической системы.
             Главный опыт.
             Разлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми
             сыворотками.
             Учет и оценка результатов реакции.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. таблицу 6). Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Необходимые разведения сывороток готовят в порядке как указано в подпункте 4.3.3. Инактивирование разведенных сывороток крови проводят, как указано в подпункте 4.3.2.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при титре в гемсистеме, указанном биопредприятием, - 0,19 - 0,22).

Примечание: Если титр комплемента в гемсистеме не известен, перед постановкой реакции определяют его рабочее разведение согласно схеме по таблице 4.

Таблица 4

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАБОЧЕГО РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ РДСК

-----------------------+---------------------------------------------------
¦      Компоненты      ¦     Номера пробирок и разведения комплемента     ¦
¦                      +----+----T----+----T----+----T----+----T----+-----+
¦                      ¦ 1  ¦ 2  ¦ 3  ¦ 4  ¦ 5  ¦ 6  ¦ 7  ¦ 8  ¦ 9  ¦ 10  ¦
¦                      +----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----+
¦                      ¦1:10¦1:20¦1:30¦1:40¦1:50¦1:60¦1:70¦1:80¦1:90¦1:100¦
+----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----+
¦                  Приготовление разведений комплемента                   ¦
¦                                                                         ¦
¦Комплемент в разведе- ¦0,2 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1  ¦
¦нии 1:10              ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦     ¦
¦Физиологический       ¦-   ¦0,1 ¦0,2 ¦0,3 ¦0,4 ¦0,5 ¦0,6 ¦0,7 ¦0,8 ¦0,9  ¦
¦раствор               ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦     ¦
¦                                                                         ¦
¦                         Титрование комплемента                          ¦
¦                                                                         ¦
¦Комплемент в разведе- ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2  ¦
¦ниях                  ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦     ¦
¦Физиологический       ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4  ¦
¦раствор               ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦     ¦
¦Гемолитическая система¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4  ¦
¦                                                                         ¦
¦                    Водяная баня 37 - 38° - 10 минут                     ¦
¦                                                                         ¦
¦Примерный результат   ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ЧГ  ¦ЧГ  ¦ЧГ  ¦ЧГ  ¦ЧГ   ¦
-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+------

В данном примере полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:50, рабочее разведение его в 2 раза меньше, т.е. 1:25.

Разлив компонентов и последовательность постановки реакции осуществляют по схеме, указанной в таблице 6.

Перед разливом гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической системы на трех сыворотках - негативной (свежей или консервированной), позитивной (бруцеллезной или овисной) и сыворотке исследуемой партии по схеме согласно таблице 5.

Таблица 5

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

------------------------+---------+----------------------------------------
¦  Компоненты реакции   ¦   Ряд   ¦            Номера пробирок            ¦
¦                       ¦пробирок +---+---T---+---T---+---T---+---T---+---+
¦                       ¦в штативе¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦10 ¦
+-----------------------+---------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Позитивная, негативная ¦первый   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦или испытуемая сыворот-¦второй   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦ка в разведении 1:5    ¦         ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦
¦                       ¦         ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦
¦Физиологический раствор¦первый   ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦
¦                       ¦второй   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦                       ¦         ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦
¦Антиген в рабочем титре¦первый   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦                       ¦второй   ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦-  ¦
¦                       ¦         ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦
¦Комплемент в рабочем   ¦первый   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦разведении             ¦второй   ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦                                                                         ¦
¦                Холодильник 16 - 18 часов при плюс 2 - 6°                ¦
¦                                                                         ¦
¦Гемолитическая система ¦первый   ¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦1,0¦
¦                       ¦второй   ¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦1,0¦
¦                                                                         ¦
¦                    Водяная баня 37 - 38° - 20 минут                     ¦
¦                                                                         ¦
¦Примерный результат    ¦первый   ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦
¦                       ¦второй   ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦
------------------------+---------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----

Примечание: Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном гемолиз будет отсутствовать, это означает, что для титрования гемсистемы была взята положительная сыворотка. В таких случаях при определении титра гемсистемы следует учитывать показания реакции в пробирках без антигена.

Таблица 6

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РДСК

------------------------+------------------+-------------------------------
¦  Компоненты реакции   ¦   При массовом   ¦ Для повторного исследования  ¦
¦                       ¦   исследовании   +--------------------+---------+
¦                       +---------+--------+пробирки для каждой ¦контроль ¦
¦                       ¦пробирки ¦контроль¦испытуемой сыворотки¦гемолити-¦
¦                       ¦с испыту-¦гемоли- +------+------+------+ческой   ¦
¦                       ¦емыми сы-¦тической¦  1   ¦  2   ¦  3   ¦системы  ¦
¦                       ¦воротками¦системы ¦      ¦      ¦      ¦         ¦
+-----------------------+---------+--------+------+------+------+---------+
¦Испытуемая сыворотка   ¦0,04     ¦-       ¦0,04  ¦0,04  ¦0,02  ¦-        ¦
¦Физиологический раствор¦0,16     ¦0,6     ¦0,36  ¦0,16  ¦0,18  ¦0,6      ¦
¦                                                                         ¦
¦                    Водяная баня 63 - 64° - 30 минут                     ¦
¦                                                                         ¦
¦Антиген бруцеллезный   ¦0,2      ¦-       ¦-     ¦0,2   ¦0,2   ¦-        ¦
¦или овисный в рабочем  ¦         ¦        ¦      ¦      ¦      ¦         ¦
¦титре                  ¦         ¦        ¦      ¦      ¦      ¦         ¦
¦Комплемент в рабочем   ¦0,2      ¦-       ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦-        ¦
¦разведении             ¦         ¦        ¦      ¦      ¦      ¦         ¦
¦                                                                         ¦
¦           Холодильник плюс 2 - 6° - 16 - 18 часов и 20 минут            ¦
¦                        при комнатной температуре                        ¦
¦                                                                         ¦
¦Гемолитическая система ¦0,5      ¦0,5     ¦0,5   ¦0,5   ¦0,5   ¦0,5      ¦
¦в рабочем титре        ¦         ¦        ¦      ¦      ¦      ¦         ¦
¦                                                                         ¦
¦                    Водяная баня 37 - 38° - 20 минут                     ¦
---------------------------------------------------------------------------

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр на один интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0,6 мл рабочий титр - 0,5 мл).

Контроли реакции:

негативная и позитивная (бруцеллезная или овисная) сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена;

гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.

4.3.6. Учет результатов РСК и РДСК.

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакций в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках - через 3 - 4 часа, когда в контрольных пробах с позитивной (бруцеллезной или овисной) сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).

Результаты реакций оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и
                  бесцветная;
+++ (3 креста)  - гемолиз 25% эритроцитов;
++ (2 креста)   - гемолиз 50% эритроцитов;
+ (1 крест)     - гемолиз 75% эритроцитов;
- (минус)       - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость
                  интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень задержки гемолиза эритроцитов определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну. Из этой жидкости готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

------------------------------+------+------+------+------+-------
¦       Номера пробирок       ¦  1   ¦  2   ¦  3   ¦  4   ¦  5   ¦
+-----------------------------+------+------+------+------+------+
¦Гемолизированная жидкость    ¦1,0   ¦0,75  ¦0,5   ¦0,25  ¦-     ¦
¦Физиологический раствор      ¦-     ¦0,25  ¦0,5   ¦0,75  ¦10    ¦
¦Процент гемолиза             ¦100   ¦75    ¦50    ¦25    ¦0     ¦
------------------------------+------+------+------+------+-------

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в пробирках шкалы и процент гемолиза выражают в крестах.

4.3.7. Диагностическая оценка РСК и РДСК.

При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном) все сыворотки, давшие задержку гемолиза на один крест и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена); сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15 - 30 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная РСК (РДСК), считают реагирующими положительно.

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток по каждой экспертизе, номера серий, сроки годности антигена, комплемента, гемолизина и их рабочие титры записывают в журнал серологических исследований.

В заключении лаборатории о результатах исследования сывороток крови животных указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и показания реакции в крестах.

4.4. Постановка и учет результатов пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба или РБП).

4.4.1. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП) применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей.

4.4.2. Компоненты РБП:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

бруцеллезный антиген, окрашенный бенгальским розовым (роз бенгал антиген) (см. Приложение N 2, п. 6);

позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

0,5-процентный фенолизированный физиологический раствор (см. Приложение N 2, п. 1).

4.4.3. Постановка РБП. Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18 - 30 °С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата (ШПРБ-1) или микропипетки. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным физиологическим раствором и кончик подсушивают фильтровальной бумагой.

При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей - 0,015 мл антигена. Затем антиген тщательно в каждой лунке смешивают с сывороткой активными движениями ручного полисмесителя до получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток каждого ряда лунок (смесителем на 5 проб) или во всех лунках пластинки (смесителем на 25 проб) смеситель ополаскивают фенолизированным физиологическим раствором и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 минут осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 минут появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной (с активностью 100 - 200 МЕ) сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

4.4.4. Учет результатов реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 минут после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением их на 5 минут в 3-процентный раствор фенола, затем тщательно моют водопроводной водой, высушивают на воздухе и используют повторно. Для проведения дезинфекции и сушки пластинок используют кассеты и штативы-сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование данной сыворотки и по результатам его дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

4.4.5. Диагностическая оценка РБП. При получении положительного результата РБП при исследовании сывороток крови животных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки, с которыми получена положительная РБП, в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК (см. подпункты 4.2 и 4.3) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК не исследуют.

Диагностическую оценку результатов исследования сывороток крови и РБП проводят по следующей схеме:

-------------------------------------------------+----------------
¦               Результаты реакций               ¦Диагностическая¦
+---------------+---------------+----------------+    оценка     ¦
¦      РПБ      ¦       РА      ¦   РСК (РДСК)   ¦               ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦положительная  ¦положительная  ¦положительная   ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦положительная  ¦сомнительная    ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦положительная  ¦отрицательная   ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦сомнительная   ¦положительная   ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦сомнительная   ¦сомнительная    ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦сомнительная   ¦отрицательная   ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦отрицательная  ¦положительная   ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦отрицательная  ¦сомнительная    ¦положительная  ¦
¦положительная  ¦отрицательная  ¦отрицательная   ¦сомнительная   ¦

¦отрицательная  ¦не исследуется ¦не исследуется  ¦отрицательная  ¦
----------------+---------------+----------------+----------------

При получении положительного результата РБП при исследовании сывороток крови животных в неблагополучных по бруцеллезу стадах (на фермах, в хозяйствах, населенных пунктах) овец, коз, свиней и северных оленей, с сыворотками крови которых получена положительная РБП, признают больными бруцеллезом, а сыворотки крови крупного рогатого скота, буйволов, лошадей и верблюдов дополнительно исследуют РА и РСК. Диагностическую оценку результатов исследования сывороток в РБП в этом случае проводят по схеме, приведенной выше.

В заключении лаборатории о результатах исследований сообщают диагностическую оценку (положительная, сомнительная, отрицательная) и указывают показания всех реакций. Например, "положительная (РБП положительная, РА 200 МЕ, РСК ++)", "сомнительная (РБП положительная, РА -, РСК -)".

При диагностической оценке "сомнительная" сыворотку крови данного животного повторно исследуют через 15 - 30 дней в РБП, РА и РСК (РДСК). При получении положительных или вновь сомнительных показаний реакций результат исследования оценивают положительно.

4.5. Кольцевая реакция с молоком (КР).

4.5.1. Кольцевую реакцию применяют с целью проверки благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока в КР разрешается проводить только непосредственно в хозяйствах, в ветеринарных лабораториях, на мясо-молочных и пищевых контрольных станциях.

Исследование молока в КР разрешается проводить только ветеринарным врачам лабораторий, мясо-молочных и пищевых контрольных станций и ветеринарным врачам хозяйств, прошедшим при лабораториях специальную подготовку по постановке и учету реакции.

4.5.2. Компоненты реакции:

исследуемое молоко (см. подпункт 2.2);

антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком (см. Приложение N 2, п. 6);

сыворотка позитивная бруцеллезная.

4.5.3. Постановка кольцевой реакции.

Уленгутовские пробирки устанавливают в резиновые штативы и нумеруют в соответствии с описью проб молока. В пробирки разливают по 0,05 мл антигена, затем шприцем с иглой длиной 50 - 60 мм, нажимая на поршень слабыми толчками, вливают в них по 1 мл молока и тщательно смешивают его с антигеном. После каждой пробы молока шприц двукратно промывают теплой водой.

При постановке КР в пробирках Флоринского или серологических берут по 2 мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли:

с молоком от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока).

Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37 - 38° на 1 час.

4.5.4. Учет и оценка результатов кольцевой реакции.

Результаты реакции учитывают визуально сразу после извлечения штативов из водяной бани (термостата) по следующей схеме (в крестах):

+++ (3 креста) - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика
                 молока в слое сливок (остальная часть молока остается
                 белой);
++ (2 креста)  - достаточно выраженное синее кольцо в слое сливок
                 (остальная часть молока имеет синеватый цвет);
+ (1 крест)    - синее кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик
                 молока имеет синий цвет;
- (знак минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в
                 первоначальный синий цвет, который был получен сразу после
                 добавления к нему антигена, а слой сливок - белого или
                 слегка желтоватого цвета.

Все пробы молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, а с оценкой 1 крест - сомнительными.

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

При получении отрицательных результатов исследования сывороток крови в РБП или в РА и РСК (РДСК) у всех животных данное стадо считают благополучным по бруцеллезу, а животных, с молоком которых получена положительная КР, оставляют в стаде.

В случае получения положительных результатов исследования на бруцеллез крови с животными стада поступают в соответствии с инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных. При этом изолируют также и животных, выделенных при исследовании молока в КР, если эта реакция не была связана с другим заболеванием животных.

5. АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

5.1. Метод аллергического исследования основан на выявлении у больных бруцеллезом животных повышенной чувствительности замедленного типа к специфическому аллергену.

5.2. Аллергический метод применяют для исследования на бруцеллез крупного рогатого скота, буйволов, овец, коз, свиней и северных оленей, не подвергавшихся прививке вакцинами против бруцеллеза, в случаях, предусмотренных инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

Аллергическое исследование на бруцеллез животных разрешается проводить только ветеринарным врачам или фельдшерам со средним специальным образованием под наблюдением врача.

5.3. Для аллергической диагностики бруцеллеза у животных применяют бруцеллин ВИЭВ.

Бруцеллин - стерильный биологический препарат, представляет собой прозрачную жидкость коричневато-желтого цвета без опалесценции, содержащую продукты жизнедеятельности и специфические вещества, извлеченные из бруцелл.

Флаконы с бруцеллином должны быть плотно закрыты пробками и закатаны алюминиевыми колпачками. При встряхивании и переворачивании флакона препарат не должен просачиваться через пробку. На каждом флаконе должна быть этикетка (или надпись) с обозначением наименования биопредприятия, изготовившего бруцеллин, наименования препарата и его количества, номера серии, даты выпуска, срока годности, номера госконтроля, условий хранения, стандарта (ГОСТ) и обозначения ТУ.

5.4. Бруцеллин используют только в день вскрытия флакона. Он пригоден для применения в течение 18 месяцев со дня изготовления при условии хранения в темном сухом помещении при температуре плюс 2 - 15 °С.

5.5. Каждый флакон с бруцеллином перед применением просматривают. При обнаружении в препарате каких-либо примесей, плесени, хлопьев, при нарушении целостности стекла или укупорки, отсутствии надписи на флаконе, а также бруцеллин, подвергавшийся замораживанию и давший осадок или помутнение, к применению не допускается.

5.6. Для введения животным бруцеллина используют короткие инъекционные иглы (N 0420 - 0813) или иглы для внутрикожных инъекций с двумя трубками (N 0706, ТУ 46-22-607-80) и шприцы, снабженные бегунком, вместимостью 2 или 5 мл. При исследовании свиней можно применять безыгольные инъекторы.

Шприцы и иглы перед и после их использования стерилизуют кипячением в течение 30 минут в дистиллированной или кипяченой воде без добавления дезинфицирующих средств. Безыгольные инъекторы стерилизуют в соответствии с инструкцией по их использованию.

Во время исследования животных инъекционные иглы меняют перед каждым наполнением шприца бруцеллином, а в промежутках между инъекциями препарата иглу держат в ватном тампоне, смоченном 70° спиртом.

5.7. Непосредственно перед применением бруцеллина алюминиевый колпачок флакона с препаратом приоткрывают, резиновую пробку обрабатывают спиртом, прокалывают инъекционной иглой и шприцем через нее набирают необходимое количество аллергена.

Бруцеллин вводят животным под кожу нижнего века на 1 см ниже края века со стороны наружного угла глаза (пальпебральная проба): овцам, козам и оленям в дозе 0,5 мл, крупному рогатому скоту и буйволам в дозе 1,0 мл.

Вводить бруцеллин под кожу века, имеющую травматические повреждения, уплотнения, абсцессы и другие поражения, не разрешается. Животных с заболеванием глаз или с густым шерстным покровом в области век метят и вводят им бруцеллин внутрикожно в центре одной из подхвостовых складок в дозах: овцам и козам - 0,2 мл и крупному рогатому скоту и буйволам - 0,3 мл (внутрикожная проба).

Свиньям бруцеллин вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины, ближе к основанию уха в дозе 0,2 мл. Правильность внутрикожной инъекции препарата контролируют по образованию бугорка размером с горошину.

При инъекции препарата животным обязательно соблюдение правил асептики. Участок кожи перед уколом протирают ватой, смоченной в спирте или 3-процентном растворе борной кислоты.

5.8. У животных, больных бруцеллезом, на месте введения бруцеллина наступает воспалительная реакция в виде плотной или тестоватой припухлости, обычно хорошо видимой при осмотре; у свиней, кроме того, может развиваться гиперемия, иногда кровоизлияние в виде темно-красного пятна в центре отека. У здоровых животных местная реакция не возникает.

5.9. Реакцию на бруцеллин у овец, коз, оленей, крупного рогатого скота и буйволов учитывают один раз через 48 часов, у свиней - два раза, через 24 и 48 часов после введения препарата, путем осмотра, а при неясно выраженной реакции - пальпацией места инъекции.

При обнаружении на месте введения препарата припухлости реакцию оценивают как положительную.

В случае неясно выраженной реакции пальпируют место введения препарата и сравнивают с кожей века другого глаза (или подхвостовой складки), а у свиней - с кожей основания другого уха. Если обнаруживают хотя бы небольшую разницу, реакцию считают положительной. При отсутствии указанных признаков реакции результат исследования считают отрицательным.

Реагирующих на бруцеллин животных метят и выделяют из отары (стада).

5.10. С животными, признанными при исследовании бруцеллина реагирующими положительно, поступают согласно Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

5.11. После применения бруцеллина у животных можно в любые сроки брать кровь для исследования на бруцеллез серологическими методами.

5.12. Проведение аллергического исследования на бруцеллез животных оформляют актом с приложением к нему описи реагировавших животных (указывают инвентарный номер, пол и возраст животных, характер реакции на бруцеллин). Один экземпляр акта направляют главному ветврачу района, другой хранят в хозяйстве.

С выходом настоящих Методических указаний утрачивают силу:

"Наставление по лабораторной диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных" от 17 февраля 1940 г.;

"Наставление по диагностике бруцеллеза у коров методом кольцевой реакции (КР) с молоком" от 2 ноября 1960 г.;

"Наставление по применению бруцеллина ВИЭВ для аллергической диагностики бруцеллеза у мелкого рогатого скота и свиней" от 24 декабря 1969 г.;

"Временное наставление по клинической и лабораторной диагностике инфекционного заболевания овец, вызываемого бруцеллой овис (инфекционный эпидидимит баранов)" (приложение к циркулярному письму Главного управления ветеринарии МСХ СССР от 10 марта 1970 г. N 116-9);

"Наставление по постановке и учету реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных" от 19 мая 1964 г. с изменениями и дополнениями, внесенными 11 декабря 1970 г.;

"Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК) при диагностике бруцеллеза у животных" от 27 мая 1976 г.;

"Наставление по постановке и учету пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба или РБП) при диагностике бруцеллеза у животных" от 12 декабря 1978 г.

Указания по диагностике бруцеллеза животных разработаны Всесоюзным Ордена Ленина научно-исследовательским институтом экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (проф. П.С. Уласевич, кандидаты вет. наук А.Н. Касьянов и В.А. Ромахов), Всесоюзным государственным ордена Трудового Красного Знамени научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР (канд. вет. наук К.В. Шумилов), Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР (Э.С. Плотников) и Центральной ветеринарной лабораторией (Б.И. Антонов, Т.А. Сысоева, В.В. Борисова).

Приложение N 1
к Методическим указаниям
по диагностике бруцеллеза животных
от 30 декабря 1982 года

1. МЕТОДЫ ОКРАСКИ БРУЦЕЛЛ

Окраска мазков по Стампу. Фиксированный на пламени мазок окрашивают в течение 10 мин. раствором карболового фуксина Циля в разведении 1:10, слегка промывают водой и дифференцируют 0,5-процентным раствором уксусной кислоты в течение 30 сек. Вновь тщательно промывают водой и докрашивают 1-процентным раствором метиленового синего в течение 20 - 30 сек. Краску сливают, мазок промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - красные, другая микрофлора и фон препарата - синие.

Окраска мазков по Козловскому. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 2-процентным раствором сафранина, подогревая до появления пузырьков. Затем мазок быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 0,75 - 1-процентным водным раствором малахитового зеленого в течение 0,5 - 1 мин. Краску сливают, мазок промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - ярко-красные, другая микрофлора и фон препарата окрашены в зеленый цвет.

Раствор малахитового зеленого может быть заменен 1-процентным раствором метиленового синего или бриллиантовой зелени.

Окраска мазков по Шуляку-Шин. Фиксированный на пламени мазок окрашивают в течение 2 минут карболовым фуксином Циля, разведенным 1:5, промывают водой и докрашивают в течение 5 минут 2-процентным водным раствором метиленового синего. Краску сливают, мазок промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - ярко-красные, другая микрофлора и фон препарата окрашены в сине-голубой цвет.

2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Мясная вода. Свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 л водопроводной воды и выдерживают в течение 15 - 18 часов в прохладном месте. Затем настой кипятят в течение 30 - 40 минут, доливают дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или через полотно. Полученную мясную воду стерилизуют при 120° в течение 20 мин.

Печеночная вода. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 л водопроводной воды, настаивают в течение 1 часа и кипятят при помешивании в течение 3 минут. После отстаивания фарш удаляют, а жидкость доливают дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по колбам, стерилизуют при 112° (0,5 атм.) в течение 30 - 40 минут.

Мясо-пептонный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (МППГГА). К 610 мл мясной воды добавляют 305 мл печеночной воды, 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 20 - 30 г агар-агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь варят в течение 1 часа в автоклаве, фильтруют через нейлоновый или ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2, добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Среду разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение 30 минут. рН среды до стерилизации - 7,3 - 7,4, после стерилизации - 6,8 - 7,0.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) готовят аналогично МППГГА, но без добавления агар-агара, глюкозы и глицерина.

Печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА). К печеночной воде добавляют 1% пептона, 0,5% х.ч. хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь варят в течение 1 часа в автоклаве, фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр, устанавливают рН 7,0 - 7,2, добавляют 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение 30 минут.

Печеночно-глюкозно-глицериновый бульон готовят аналогично ПГГА, но без добавления агар-агара.

Картофельный агар. 500 г очищенного картофеля (берут белые или желтые клубни средней величины), нарезанного ломтиками, варят в 1 л водопроводной воды до готовности (избегать сильного разваривания картофеля). Затем отвар фильтруют через ватный фильтр и дистиллированной водой доводят объем до первоначального (1 л). К фильтрату добавляют 1% пептона, 0,5% х.ч. хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара. Смесь варят до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2 и отстаивают в теплом месте. В застывшем агаре срезают нижний слой с осадком, а прозрачную часть агара расплавляют и фильтруют через ватный фильтр. Вновь устанавливают рН 7,2, добавляют 1% глюкозы, и 3% глицерина, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют при 115° (0,7 атм.) в течение 20 - 30 минут. После стерилизации рН среды 6,8.

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 165 мл мясной воды. Смешивают, кипятят до расплавления агара, устанавливают рН 7,8. Затем стерилизуют текучим паром в течение 1 часа, после чего пар закрывают, давление доводят до 2 атм. и нагреватель выключают. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 часа, затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят рН до 7,4, разливают в колбы, учитывая объем среды, и стерилизуют при 115° (0,7 атм.) в течение 15 минут.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 50° и добавляют к ней нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади и раствор декстрозы, профильтрованные через фильтр Зейтца. Конечная концентрация сыворотки в среде должна быть 10%, декстрозы - 1%.

Плотный печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1000 мл печеночной воды добавляют 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия, 20 г агар-агара. К полученной смеси добавляют 17 мл 10-процентного раствора двууглекислой соды и автоклавируют при 115° (0,7 атм.) в течение 20 - 25 минут, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,0 - 7,2 и добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Разливают в колбы и стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение 20 минут. Хранят в прохладных условиях. Перед употреблением смесь расплавляют, охлаждают до 50° и добавляют 10 - 20% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота (овец) или 10 - 15% аминопептида, затем разливают в пробирки или бактериологические чашки.

Полужидкий печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. Берут мясной печеночной воды по 500 мл, добавляют 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия, 1,5 - 2 г агар-агара. Устанавливают рН 7,0 - 7,2. Смесь кипятят, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 115° (0,7 атм.) в течение 30 минут. Хранят на холоде. Перед употреблением добавляют стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота или овец или аминопептид из расчета 10% к объему среды и разливают в пробирки.

Эритрит агар. Представляет собой готовую питательную среду для выделения бруцелл. Готовится по прописи завода-изготовителя.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ УГЛЕКИСЛОГО ГАЗА

В пробирку наливают 2 - 3 мл 0,1-процентного раствора бикарбоната натрия и добавляют 1 - 2 капли 0,5-процентного раствора бромтимолового синего. В обычной атмосфере смесь имеет отчетливый синий цвет.

Пробирку ставят в эксикатор, в котором необходимо определить содержание углекислого газа. Учет проводят через 1 час по изменению окраски смеси, пользуясь следующей таблицей.

----------------+-------------------------------------------------
¦ Окраска смеси ¦Процентное содержание CO  в атмосфере эксикатора¦
¦               ¦                        2                       ¦
+---------------+------------------------------------------------+
¦Синяя          ¦до 5                                            ¦
¦Сине-зеленая   ¦5                                               ¦
¦Зеленая        ¦10                                              ¦
¦Зелено-желтая  ¦15                                              ¦
¦Желтая         ¦20                                              ¦
----------------+-------------------------------------------------

Приложение N 2
к Методическим указаниям
по диагностике бруцеллеза животных
от 30 декабря 1982 года

1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФЕНОЛИЗИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ ХЛОРИДА НАТРИЯ ДЛЯ РА

Для приготовления фенолизированного 0,85; 5 и 10-процентного раствора хлорида натрия в 1000 мл дистиллированной воды растворяют при подогревании соответственно 8,5; 50 или 100 г хлорида натрия и 5 г фенола. Доводят рН раствора до 7,0 - 7,2 и фильтруют через бумажный фильтр.

2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА ХЛОРИДА НАТРИЯ С ДОБАВЛЕНИЕМ ИОНОВ МАГНИЯ И КАЛЬЦИЯ (ДЛЯ РСК И РДСК)

Основные растворы солей магния и кальция готовят следующим образом: 1 г хлорида магния х.ч. растворяют в 11,8 мл и 1 г хлорида кальция х.ч. - в 54,4 мл дистиллированной воды. Основные растворы этих солей хранят в холодильнике.

Перед постановкой реакции берут на 1 л физиологического раствора хлорида натрия по 1,2 мл основных растворов хлорида магния и хлорида кальция. Смесь кипятят, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят рН до 7,3 - 7,4 прибавлением едкого натрия или соляной кислоты.

3. ПОЛУЧЕНИЕ И ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ ЭРИТРОЦИТОВ БАРАНА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РСК И РДСК

Кровь у барана (овцы) берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд со стеклянными или фарфоровыми бусами (для дефибринирования) или в сосуд с налитым в него раствором Алсивера в количестве, равном объему крови (для дефибринирования и консервирования). Для консервирования дефибринированной крови применяют раствор стрептомицина (1 г стрептомицина, растворенного в 20 мл физиологического раствора, на 100 мл крови).

Дефибринированная кровь пригодна для исследования в течение трех дней, консервированная стрептомицином или раствором Алсивера - в течение 12 дней.

Приготовление раствора Алсивера: в 1000 мл дистиллированной воды растворяют 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлорида натрия, 8,0 г лимоннокислого натрия, 0,5 г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве (при 103 - 105 °С в течение 30 минут) через фильтр Зейтца.

Для приготовления суспензии эритроцитов крови барана берут свежую дефибринированную или консервированную кровь, центрифугируют при 1500 - 3000 об./мин. в течение 15 мин., жидкую часть сливают, а осадок 2 - 3 раза отмывают в физиологическом растворе путем центрифугирования в указанном порядке до полного обесцвечивания надосадочной жидкости.

4. ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ В РСК

Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 с интервалами в дозах по 0,02 мл. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме, как указано в таблице 1.

Таблица 1

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ

------------------------+--------------------------------------------------
¦       Компоненты      ¦                 Номера пробирок                 ¦
¦                       +----+----T----+----T----+----T----+----T----+----+
¦                       ¦ 1  ¦ 2  ¦ 3  ¦ 4  ¦ 5  ¦ 6  ¦ 7  ¦ 8  ¦ 9  ¦ 10 ¦
+-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Комплемент в разведении¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦
¦1:20                   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦Физиологический раствор¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦-   ¦
¦Гемолизин в удвоенном  ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦титре                  ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦2,5-процентная взвесь  ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦эритроцитов барана     ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦Физиологический раствор¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦
¦                                                                         ¦
¦                   Водяная баня 10 минут при 37 - 38°                    ¦
¦                                                                         ¦
¦Примерный результат    ¦ЧГ  ¦ЧГ  ¦ЧГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦ПГ  ¦
------------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----

Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее количество его, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 минут в водяной бане при 37 - 38 °С.

В примере, приведенном в таблице 1, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

5. ТИТРОВАНИЕ ГЕМОЛИЗИНА

Гемолизин титруют периодически один раз в три месяца и каждую новую серию в разведениях 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000, 1:3500 и 1:4000 по схеме, как указано в таблице 2.

Таблица 2

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИЗИНА

-------------------+-------------------------------------------------------
¦    Компоненты    ¦                Разведение гемолизина                 ¦
¦                  +-----+------+------+------+------+------+------+------+
¦                  ¦1:500¦1:1000¦1:1500¦1:2000¦1:2500¦1:3000¦1:3500¦1:4000¦
+------------------+-----+------+------+------+------+------+------+------+
¦Гемолизин         ¦0,2  ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦
¦Комплемент в      ¦0,2  ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦
¦разведении 1:20   ¦     ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦
¦Эритроциты        ¦0,2  ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦0,2   ¦
¦(2,5-процентная   ¦     ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦
¦взвесь)           ¦     ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦
¦Физиологический   ¦0,4  ¦0,4   ¦0,4   ¦0,4   ¦0,4   ¦0,4   ¦0,4   ¦0,4   ¦
¦раствор           ¦     ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦
¦                                                                         ¦
¦                    Водяная баня 10 мин. при 37 - 38°                    ¦
¦                                                                         ¦
¦Примерный         ¦ПГ   ¦ПГ    ¦ПГ    ¦ЧГ    ¦ЧГ    ¦ЧГ    ¦ЧГ    ¦ЧГ    ¦
¦результат         ¦     ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦      ¦
-------------------+-----+------+------+------+------+------+------+-------

Разведения гемолизина готовят из основного (1:100) по следующей схеме:

-------------------------------+----------------+-----------------
¦Основное разведение гемолизина¦Физиологический ¦   Получаемые   ¦
¦          1:100 (мл)          ¦  раствор (мл)  ¦   разведения   ¦
+------------------------------+----------------+----------------+
¦             0,4              ¦      1,6       ¦     1:500      ¦
¦             0,1              ¦      0,9       ¦     1:1000     ¦
¦             0,1              ¦      1,4       ¦     1:1500     ¦
¦             0,1              ¦      1,9       ¦     1:2000     ¦
¦             0,1              ¦      2,4       ¦     1:2500     ¦
¦             0,1              ¦      2,9       ¦     1:3000     ¦
¦             0,1              ¦      3,4       ¦     1:3500     ¦
¦             0,1              ¦      3,9       ¦     1:4000     ¦

-------------------------------+----------------+-----------------

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 минут 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. В приведенной таблице 2 титр гемолизина равен 1:1500.

Рабочий титр гемолизина для РСК в 2 раза и для РДСК в 3 раза выше. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий титр в РСК будет 1:750, в РДСК - 1:500.

6. БРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ АНТИГЕНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, изготовленный на биофабрике, представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в физиологическом растворе. Специфическая активность антигена стандартизована по референтной агглютинирующей сыворотке, что позволяет выражать результаты реакции, агглютинации в международных единицах антител на 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 с оценкой ++ и более содержит 100 МЕ, 1:200 - 200 МЕ и т.д.).

Перед употреблением антиген тщательно встряхивают.

Антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы (РБП), изготовленный на биофабрике, представляет собой стандартизованную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет.

Перед употреблением антиген выдерживают 30 - 40 минут при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.

Антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет. Перед употреблением антиген тщательно встряхивают.

Антиген овисный для РДСК, изготовленный на биофабрике, представляет собой прозрачную, желтовато-зеленоватого цвета жидкость, полученную из клеток бруцелла овис путем экстрагирования.

Антигены хранят в сухом темном месте при температуре плюс 2 - 12 °С.

Антигены во флаконах без этикеток (без надписи) или с трещинами, содержащие постороннюю примесь, неразбивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не пригодны.

Утверждаю
Начальник Главного управления
ветеринарии Министерства
сельского хозяйства СССР
А.Д.ТРЕТЬЯКОВ
29 марта 1983 г. N 115-6а

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ВАКЦИНЫ ЖИВОЙ СУХОЙ ИЗ ШТАММА РЕВ-1 БРУЦЕЛЛА МЕЛИТЕНЗИС ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Вакцину из штамма Рев-1 применяют для профилактической иммунизации ярок (козочек) в комплексе мер, предусмотренных Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

1.1.1. Перечень республик, краев и областей, в которых допускается применение указанной вакцины для иммунизации животных против бруцеллеза, устанавливает Главное управление ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. В республиках, краях и областях разрешение на применение вакцины в районах и хозяйствах выдают соответственно ветеринарные отделы областных (краевых) управлений сельского хозяйства, министерств сельского хозяйства автономных республик, главные управления (управления) ветеринарии министерств сельского хозяйства союзных республик, не имеющих областного деления.

1.1.2. Вакцинировать животных против бруцеллеза разрешается ветеринарным врачам или ветеринарным фельдшерам со средним специальным образованием под контролем ветврача.

1.2. Вакцину живую сухую готовят из слабовирулентного штамма Рев-1 бруцелла мелитензис.

Вакцина представляет собой сухую мелкозернистую массу светло-коричневого или серовато-желтоватого цвета; ее выпускают в ампулах, запаянных под вакуумом и уложенных в коробки. При разведении вакцины физиологическим раствором образуется равномерная взвесь серовато-желтого цвета без хлопьев, комочков и осадка.

1.3. На каждой ампуле с вакциной должна быть надпись с указанием названия вакцины, номера серии, срока годности и количества препарата.

Ампулы с вакциной, не имеющие указанной надписи, а также разбитые, с трещинами, содержащие механические примеси или плесень, с истекшим сроком годности препарата, упакованные в коробки без этикеток, бракуют и обеззараживают кипячением в течение 30 минут.

1.4. На этикетках коробок с вакциной должно быть указано: наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, наименование препарата, номер серии и номер госконтроля, дата изготовления, срок годности, количество ампул и количество доз в ампуле и в коробке, условия хранения вакцины и обозначение ТУ.

В каждой коробке должно быть наставление по применению вакцины.

1.5. Вакцина пригодна для применения в течение 12 месяцев со дня ее изготовления при условии хранения в темном сухом помещении при температуре плюс 2 - 12 градусов. При хранении вакцины при температуре выше указанной активность ее не гарантируется. В жаркое время года вакцину доставляют к месту применения в термочемоданах или термосах со льдом.

1.6. Перед применением вакцину разводят физиологическим раствором из расчета, чтобы одна прививочная доза составляла 2 мл разведенной вакцины.

Для этого шейку ампулы с сухой вакциной в верхней части протирают смоченной спиртом ватой и обламывают. В ампулу шприцем с иглой вносят 4 мл физиологического раствора и затем ее осторожно встряхивают до превращения массы в равномерную взвесь.

1.7. Разведенную в ампулах вакцину шприцем с длинной иглой отсасывают и переносят во флакон емкостью 500 - 1000 мл с предварительно налитым в него физиологическим раствором. С учетом жидкости, перенесенной из ампул с вакциной, во флаконе должно быть столько физиологического раствора, сколько необходимо, чтобы приготовить расчетное количество доз вакцины в разведенном виде для прививки животным.

1.7.1. Физиологический раствор, флаконы, шприцы и иглы, используемые для приготовления сухой вакцины к применению (см. пункты 1.6 и 1.7), должны быть стерильными.

1.7.2. Приготовленную для применения вакцину защищают от прямого солнечного света и используют в течение не более 4 часов.

Вакцину, не использованную в указанное время, уничтожают путем кипячения в течение 30 минут. Кипячению подлежат также ампулы и флаконы из-под использованной вакцины, шприцы и иглы.

1.8. Вакцину животным вводят в объеме 2 мл под кожу в бесшерстное место за локтевым суставом.

Для каждого животного используют простерилизованную иглу. Поверхность кожи в месте введения вакцины предварительно дезинфицируют.

1.9. Иммунитет у животных после прививки живой сухой вакциной из штамма Рев-1 наступает через 3 недели.

1.9.1. Каждое привитое животное метят путем выщипа круглого отверстия в основании правого уха. Их берут на учет и за ними устанавливают наблюдение, имея в виду, что у вакцинированных животных может повыситься температура тела, иногда отмечается кратковременная хромота.

1.9.2. Не подлежат вакцинации:

животные низкой упитанности или больные какой-либо болезнью (их допрививают после выздоровления);

взрослые овцы (козы);

бараны (козлы) и валухи;

ярки (козочки) в благополучных племенных хозяйствах, отобранные к продаже.

1.9.3. В период вспышки в хозяйстве острой инфекционной болезни (сибирская язва, ящур и др.) прививки животных против бруцеллеза не разрешаются.

1.10. Проведенную вакцинацию ярок (козочек) по каждой отаре оформляют актом, в котором указывают наименование хозяйства, фермы, номер отары, от каких овец (благополучных или неблагополучных по бруцеллезу) получен молодняк, результаты исследования на бруцеллез перед вакцинацией, количество и возраст вакцинированных животных, наименование предприятия, изготовившего вакцину, номер серии, дату изготовления и срок годности препарата. Один экземпляр акта направляют главному ветврачу района, другой хранят в хозяйстве. К акту прилагают опись животных.

2. ПРИМЕНЕНИЕ ВАКЦИНЫ ЖИВОЙ СУХОЙ ИЗ ШТАММА РЕВ-1

2.1. Вакцину из штамма Рев-1 применяют для иммунизации ярок (козочек) как на благополучных, так и неблагополучных по бруцеллезу (фермах в хозяйствах, расположенных в районах со значительным распространением бруцеллеза мелкого рогатого скота, а также в хозяйствах при отгонном ведении овцеводства.

Допускается вакцинация ярок (козочек), принадлежащих гражданам, в населенных пунктах, неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота.

2.2. Вакцинируют ярок и козочек однократно начиная с трех-четырехмесячного возраста, но не позднее чем за два месяца до первого осеменения.

2.2.1. В неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах вакциной из штамма Рев-1 иммунизируют ярок (козочек) ежегодно до снятия ограничений по бруцеллезу с хозяйства и продолжают в течение трех лет после оздоровления поголовья.

2.2.2. Ярок (козочек), полученных от маток благополучных по бруцеллезу отар (стад), иммунизируют без предварительного исследования.

2.2.3. Перед вакцинацией ярок и козочек, полученных от маток неблагополучных по бруцеллезу отар (стад), исследуют на бруцеллез серологическими методами. Реагирующих животных удаляют из отары, остальных прививают вакциной. Из вакцинированного молодняка формируют отдельные отары.

2.3. Для исследования на бруцеллез животных, привитых вакциной из штамма Рев-1, применяют серологические методы (РБП - роз бенгал проба или РА и РСК (РДСК)). Плановое исследование проводят перед осеменением маток или через 1 - 2 месяца после окота, но не ранее чем через 12 месяцев после вакцинации.

2.4. За привитыми вакциной из штамма Рев-1 животными ведут ветеринарное наблюдение: исследуют на бруцеллез овец (коз), оставшихся без приплода, а также абортировавших и имеющих другие признаки, подозрительные на заболевание животных бруцеллезом. Абортированные плоды и другой материал от таких животных направляют в ветеринарную лабораторию для бактериологического и биологического исследований, одновременно от них направляют кровь для серологического исследования на бруцеллез.

2.5. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве:

2.5.1. Если при лабораторных исследованиях материала от животных, привитых вакциной из штамма Рев-1, и при проверке на бруцеллез овец (коз) по окончании окота получены отрицательные результаты исследований по группе (отаре), все поголовье группы (отары) признают благополучным по бруцеллезу.

2.5.2. В случае если при исследовании вакцинированных овец (коз) выделяются животные с положительной реакцией, всех животных данной отары сдают на убой или удаляют из отары и сдают на убой реагирующих, а остальных исследуют 2 - 3 раза через каждые 30 дней, осеменяют и оставляют под наблюдением до окончания следующего окота.

2.5.3. В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах овец (коз) отар, где произошла острая вспышка бруцеллеза (аборты, массовое выделение реагирующих), сдают на убой, а животных других неблагополучных отар данного хозяйства реиммунизируют вакциной из штамма 19 за 2 месяца до осеменения, но не ранее чем через 2 года после иммунизации их вакциной из штамма Рев-1. Овец (коз) в дальнейшем прививают вакциной из штамма 19 ежегодно, перед прививкой и после нее на бруцеллез не исследуют, содержат обособленно и по мере хозяйственной выбраковки сдают на убой.

Ярок в данном хозяйстве иммунизируют вакциной из штамма Рев-1 против бруцеллеза.

2.6. Перед снятием ограничений с фермы (бригады, отделения хозяйства), населенного пункта исследуют на бруцеллез все поголовье овец и коз (в том числе иммунизированных вакциной из штамма Рев-1 против бруцеллеза, за исключением животных, привитых этой вакциной менее чем за 12 месяцев до снятия ограничений), находящихся на территории данного хозяйства, населенного пункта.

2.7. При иммунизации вакциной из штамма Рев-1 овец, принадлежащих населению, соблюдают требования и условия, указанные в настоящем Наставлении и предусмотренные Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

2.8. В случае если после прививок у животных возникли какие-либо осложнения (абсцессы и т.п.), об этом необходимо немедленно сообщить Всесоюзному государственному научно-контрольному институту ветпрепаратов (123022, г. Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5) и биопредприятию, изготовившему вакцину. Одновременно высылают в их адрес по 3 - 5 невскрытых ампул с вакциной из использованной серии.

* * *

С утверждением настоящего Наставления утрачивают силу:

"Временное наставление по применению сухой живой вакцины из штамма Рев-1 бруцелл вида мелитензис против бруцеллеза мелкого рогатого скота", утвержденное Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20 июня 1974 года;

"Указания по борьбе с бруцеллезом мелкого рогатого скота с использованием в общем комплексе противобруцеллезных мероприятий вакцины из штамма Рев-1 бруцелл вида мелитензис", утвержденные Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20 июня 1974 года.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: