- Законы
- Кодексы
- Форум
Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных
В данном хозяйстве в течение последующих двух лет проводят исследование овцематок (коз) после окота и производителей (серологически или аллергически).
Вакцинацию против бруцеллеза овец (коз) в хозяйствах области, края, республики (за исключением районов отгонного овцеводства) не проводят.
7.2. В областях, краях и республиках (без областного деления) с ограниченным распространением бруцеллеза (за исключением районов со значительным распространением болезни) овец (коз) неблагополучных отар сдают на убой вместе с молодняком. В первую очередь сдают на убой животных отар (стад), в которых наблюдается острое течение инфекции. В хозяйствах поступают, как указано в пунктах 7.1 и 4.6.
Оздоровление неблагополучного поголовья овец (коз) в крупных хозяйствах допускается проводить методом систематических исследований животных в порядке, указанном ниже в подпунктах 7.2.1 - 7.2.5.
7.2.1. Овец (коз) исследуют серологически (РБП или РА, РСК (РДСК)) и аллергически 2 - 4 раза через каждые 30 дней. Нереагирующих животных осеменяют и отару (стадо) оставляют под контрольным наблюдением до окончания следующего окота. Реагирующих при исследовании животных подвергают убою.
При отсутствии клинических проявлений бруцеллеза у овец (коз) и при отрицательных результатах серологического исследования, проведенного по окончании окота, отару (стадо) считают оздоровленной от бруцеллеза.
7.2.2. Из ярок (козочек), полученных от овец (коз) оздоравливаемых отар, формируют самостоятельные отары. Через 1 - 2 месяца после отбивки от маток ярок исследуют серологически (РБП или РА и РСК (РДСК)) и аллергически и затем каждые 30 дней аллергическим методом до получения по отаре отрицательных результатов исследований. Нереагирующих животных осеменяют и оставляют под контрольным наблюдением до первого окота. При отсутствии клинических признаков болезни у овец (коз) и при отрицательных результатах серологического исследования на бруцеллез животных, проведенного по окончании окота, отару считают благополучной по бруцеллезу.
7.2.3. Баранчиков, полученных от овец неблагополучных отар, для воспроизводства не оставляют, их доращивают и сдают на убой.
7.2.4. При установлении бруцеллеза в отарах (группах) баранов-производителей или пробников всех животных сдают на убой или подвергают убою только реагирующих, а остальных животных исследуют через каждые 30 дней серологически (РБП или РА и РСК (РДСК)) и аллергически до получения двукратного подряд отрицательного результата по отаре (группе). После этого всю отару (группу) содержат обособленно и через 6 месяцев исследуют на бруцеллез теми же методами. При отсутствии у животных клинических признаков болезни и при отрицательных результатах исследований отару (группу) признают благополучной по бруцеллезу.
7.2.5. Овец и коз в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах осеменяют искусственно спермой здоровых производителей.
В отары для покрытия овец допускают здоровых баранов (козлов), которых после окончания случной кампании формируют в самостоятельные отары (группы). Через 30 - 45 дней после отбивки из маточных отар животных исследуют на бруцеллез серологически (РБП или РА и РСК (РДСК)) и аллергически два раза с интервалом в 30 дней. При отсутствии клинических проявлений бруцеллеза у животных и при двукратных подряд отрицательных результатах исследования отару (группу) считают благополучной по бруцеллезу и в дальнейшем баранов исследуют за 1 месяц до использования их в случной кампании.
Если у баранов при исследовании на бруцеллез будут получены положительные реакции, то с животными поступают, как указано в подпункте 7.2.4.
7.3. В районах со значительным распространением бруцеллеза мелкого рогатого скота, в том числе находящихся в составе областей (краев, республик, не имеющих областного деления) с ограниченным распространением этой болезни, оздоровление поголовья овец (коз) в неблагополучных пунктах проводят в порядке, как указано в пункте 7.2.
7.3.1. В таких районах, а также в областях (краях, республиках, не имеющих областного деления) со значительным распространением бруцеллеза мелкого рогатого скота и в районах отгонного овцеводства в борьбе с бруцеллезом допускается применять противобруцеллезные вакцины для иммунизации овец (коз). При использовании вакцин в хозяйствах и населенных пунктах осуществляют полный комплекс мер, предусмотренный настоящей Инструкцией.
7.3.2. В районах, где применяют вакцину из штамма Рев-1, этой вакциной иммунизируют только ярок (козочек).
В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах овец (коз) отар, где произошла острая вспышка бруцеллеза (аборты, массовое выделение реагирующих), сдают на убой, а животных других неблагополучных отар данного хозяйства реиммунизируют вакциной из штамма 19 за 2 месяца до осеменения, но не ранее чем через 2 года после иммунизации их вакциной из штамма Рев-1. Овец (коз) в дальнейшем прививают вакциной из штамма 19 ежегодно, перед прививкой и после нее на бруцеллез не исследуют, содержат обособленно и по мере хозяйственной выбраковки сдают на убой. Ярок в этих хозяйствах иммунизируют вакциной из штамма Рев-1 против бруцеллеза.
7.3.3. Противобруцеллезные вакцины используют, соблюдая условия, указанные в наставлениях по применению соответствующих вакцин.
7.4. Перед снятием ограничений с неблагополучной по бруцеллезу мелкого рогатого скота фермы (бригады, отделения хозяйства), населенного пункта исследуют серологическим методом всех овец и коз (в т.ч. подвергавшихся вакцинации против бруцеллеза), находящихся на территории хозяйства, населенного пункта. Ограничения снимают только после получения отрицательных результатов исследований мелкого рогатого скота всего хозяйства или хозяйственно обособленной части его (при снятии ограничений с отделения, бригады, фермы), населенного пункта и выполнения других мероприятий, предусмотренных Инструкцией (в т.ч. исследования приотарных собак и животных других видов, имевших контакт с овцами или козами неблагополучных отар). В хозяйствах, в которых проводили реиммунизацию взрослых овец (коз) вакциной из штамма 19, все такое поголовье должно быть сдано на убой.
В крупных овцеводческих хозяйствах (поголовье более 30 тыс.) перед снятием ограничений допускается проведение исследований на бруцеллез не менее 10% поголовья каждой отары, а также всех овцематок, оставшихся без ягнят, и баранов-производителей.
8. Оздоровление хозяйств, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту баранов
8.1. При установлении в племенном овцеводческом хозяйстве (на ферме), на станции или предприятии по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных заболевания баранов инфекционным эпидидимитом (ИЭ) ферму (станцию, предприятие) объявляют неблагополучной, животных неблагополучной отары (группы) содержат обособленно.
8.1.1. Баранов с клиническими признаками болезни (эпидидимит, орхит) изолируют, а остальных животных неблагополучной отары (группы) исследуют клинически и серологически (РДСК) 1 раз в месяц до получения двукратных подряд отрицательных результатов, затем оставляют под контрольным наблюдением на 6 месяцев, в течение которых животных исследуют 2 раза. Молодых баранов исследуют на ИЭ с 12-месячного возраста.
8.1.2. Баранов, имеющих клинические признаки болезни или положительно реагирующих при исследовании, сдают на убой.
8.1.3. При отсутствии в течение контрольного наблюдения клинического проявления болезни и при отрицательных результатах исследований отару (группу) баранов признают оздоровленной от инфекционного эпидидимита, животных допускают к использованию для воспроизводительных целей.
8.2. Если установлено заболевание инфекционным эпидидимитом баранчиков в ремонтных группах или среди отобранных к продаже для племенных целей, в племенных хозяйствах проводят исследование на это заболевание овцематок в отарах, в которых получены баранчики, а также в отарах, в которых использовались больные ИЭ бараны-производители.
8.2.1. Овцематок исследуют серологическим методом (РДСК) двукратно через 1 и 2 мес. после окота и за 2 - 4 недели до осеменения. Абортированные плоды направляют на бактериологическое исследование на ИЭ в ветеринарную лабораторию.
8.2.2. Овцематок, при исследовании сыворотки крови которых в РДСК или при бактериологическом исследовании абортированных плодов и патологического материала получен положительный результат, признают больными и сдают на убой, а отару объявляют неблагополучной по ИЭ.
8.2.3. Неблагополучную отару овцематок содержат изолированно от других отар хозяйства, овец исследуют серологическим методом в порядке, как указано выше, нереагирующих животных осеменяют искусственно спермой здоровых производителей и оставляют под наблюдением до следующего окота.
8.2.4. Отару овцематок признают оздоровленной, если у овец в течение двух лет наблюдения не было абортов, вызываемых возбудителем - бруцеллой овис, и при исследовании сыворотки крови животных получены отрицательные результаты, а при исследовании баранчиков предыдущего года рождения, выращенных от овец данной отары, среди них не выделены больные ИЭ животные.
8.2.5. В неблагополучные отары для покрытия овец допускают здоровых баранов, которых после окончания случной кампании через 1 - 2 мес. исследуют клинически и серологически на ИЭ. Использование этих баранов для воспроизводительных целей в других отарах хозяйства в этот период не разрешается.
8.2.6. Молодняк (баранчиков и ярок), родившийся от овец неблагополучной отары, содержат отдельной группой и в возрасте 12 мес. исследуют на ИЭ серологическим методом (РДСК), а баранчиков и клинически реагирующих (больных) выделяют. Вывод такого молодняка в другие хозяйства для племенных целей не разрешается.
9. Оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу буйволов, верблюдов, свиней, пушных зверей и лошадей
9.1. Неблагополучные по бруцеллезу буйволоводческие и верблюдоводческие фермы (стада) оздоравливают в таком же порядке, как и стада крупного рогатого скота (раздел 6). Прививкам вакцинами против бруцеллеза буйволов и верблюдов не подвергают.
9.2. В свинарнике, в котором установлено заболевание бруцеллезом, все поголовье, в том числе молодняк, полученный от маток данного свинарника, содержат изолированно, откармливают и сдают на убой. Супоросных маток сдают на убой после окончания опороса и отъема поросят.
После санации свинарника и территории и снятия ограничений завозят здоровых свиней.
9.3. В звероводческих хозяйствах в целях охраны от заноса возбудителя бруцеллеза выполняют ветеринарно-санитарные правила для этих хозяйств, утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР.
Особое внимание обращают на недопущение скармливания клеточным зверям мясных продуктов из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, без термической обработки.
9.3.1. В целях диагностики бруцеллеза у пушных зверей проводят бактериологическое исследование абортированных плодов, а в весенне-летний период - исследование серологическими методами (РА, РСК или РДСК) всех пропустовавших, абортировавших самок и неработавших самцов.
9.3.2. При установлении бруцеллеза всех пушных зверей хозяйства исследуют на бруцеллез (РА и РСК (РДСК)) с целью определения степени зараженности поголовья.
При значительном количестве реагирующих (более 10 процентов) все поголовье пушных зверей заменяют. После санации фермы и снятия ограничений завозят здоровых животных.
При незначительном проценте реагирующих пушных зверей исследуют на бруцеллез 1 раз в мес. (РА и РСК (РДСК)) до получения отрицательных результатов. Реагирующих самок вместе с пометом содержат в изоляторе до убоя на мех.
9.4. Лошадей исследуют на бруцеллез (РБП или РА и РСК (РДСК)) при выявлении у них признаков, дающих основание подозревать наличие болезни (бурсит, нагнет холки), а также перед снятием ограничений с хозяйств, оздоровленных от бруцеллеза крупного рогатого скота и овец (см. пункты 6.8 и 7.7). Положительно реагирующих подвергают убою.
10. Профилактика заболевания и оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу северных оленей
10.1. В целях предотвращения заноса бруцеллеза в оленеводческих хозяйствах выполняют соответствующие меры, указанные в разделе 4, и по недопущению контакта между благополучными и неблагополучными по бруцеллезу стадами.
Устанавливают маршруты движения стад в каждом хозяйстве (бригаде).
10.2. Для выявления очагов бруцеллеза северных оленей следят за их состоянием, проводят клинический осмотр и животных с признаками заболевания (аборты, орхиты, эпидидимиты, бурситы и др.) выделяют из стада. Их исследуют на бруцеллез серологическими методами (РБП или РА и РСК (РДСК)) и затем подвергают убою.
Кроме того, от взрослых оленей, поступивших на убой, берут кровь для серологического исследования, как указано выше.
10.3. При оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу стад все поголовье стада 1 раз в год исследуют серологическими методами и 1 раз в квартал подвергают клиническому осмотру. Транспортных оленей, кроме того, исследуют аллергическим методом не реже 2 раз в год. Самцов-производителей (хоров) при разделении стада перед отелом на плодовое и транспортное исследуют серологическими методами.
Животных, реагирующих при исследовании или имеющих клинические признаки болезни, подвергают убою.
В период отелов последы и абортированные плоды уничтожают, оленей перегоняют на свежие участки пастбища.
10.4. Хозяйство (стадо оленей) признают оздоровленным, если в течение последних двух лет в нем не было выявлено животных с клиническими признаками бруцеллеза, при серологическом исследовании получены отрицательные результаты, а в хозяйстве проведены необходимые ветеринарно-санитарные мероприятия.
11. Оздоровление от бруцеллеза животных в хозяйствах граждан
11.1. Ликвидацию бруцеллеза животных, принадлежащих населению, осуществляют по плану оздоровления неблагополучного населенного пункта в соответствии с разделом 3 настоящей Инструкции.
11.2. При установлении заболевания крупного рогатого скота, а также буйволов и верблюдов в отдельных хозяйствах граждан все поголовье животных, содержащихся в этих хозяйствах, подвергают систематическим исследованиям серологическими методами до получения двукратных отрицательных результатов. Транспортных оленей 1 раз в квартал исследуют серологическими или аллергическими методами. Реагирующих или имеющих клинические признаки болезни животных считают больными и подвергают убою.
Если заболевание установлено у крупного рогатого скота (буйволов, верблюдов), содержавшегося в общем стаде, все поголовье скота в данном населенном пункте исследуют на бруцеллез каждые 25 - 30 дней серологическими методами до получения двукратного подряд отрицательного результата по всему стаду и при отсутствии новых случаев заболевания животных стадо считают оздоровленным от бруцеллеза.
11.3. При выявлении больных бруцеллезом овец или коз все неблагополучное поголовье животных этих видов, принадлежащее отдельным владельцам, подлежит немедленному убою. В данном населенном пункте всех овец и коз, принадлежащих другим индивидуальным владельцам, каждые 25 - 30 дней исследуют на бруцеллез серологическими методами (РБП или РА и РСК (РДСК)) до получения двукратного подряд отрицательного результата и при отсутствии новых случаев заболевания поголовье животных считают благополучным по бруцеллезу.
11.4. При установлении бруцеллеза у свиней все неблагополучное свинопоголовье, содержащееся в хозяйстве данного владельца, подвергают убою.
11.5. В районах, областях, краях и республиках (без областного деления) со значительным распространением бруцеллеза крупный и мелкий рогатый скот, принадлежащий населению, в целях профилактики допускается иммунизировать противобруцеллезными вакцинами в порядке, предусмотренном наставлениями по применению соответствующих вакцин.
11.6. Ветеринарно-санитарные и другие мероприятия в населенных пунктах проводят в соответствии с настоящей Инструкцией. При этом содержание больных животных в общем стаде (отаре) и на участках, отведенных для выпаса стада (отары), запрещается.
12. Охрана людей от заражения бруцеллезом
12.1. Все работники, непосредственно обслуживающие животных неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, должны строго выполнять правила личной гигиены, с которыми их обязаны ознакомить медицинские и ветеринарные специалисты.
12.2. Все работники животноводства должны быть обеспечены спецодеждой и спецобувью. В каждом животноводческом помещении должны быть умывальники, мыло, полотенце и аптечки первой помощи, а также оборудованное помещение для хранения спецодежды и спецобуви.
12.3. К обслуживанию отар овец (коз), неблагополучных по бруцеллезу, допускают только лиц, вакцинированных против бруцеллеза.
12.4. С целью своевременного выявления заболевания бруцеллезом людей медицинские работники должны подвергать диспансеризации лиц, занятых обслуживанием животных.
12.5. На каждой ферме должны быть санитарные журналы для записи в них указаний и предложений медицинских и ветеринарных специалистов.
Утверждены
Главным управлением ветеринарии
Министерства сельского хозяйства СССР
30 декабря 1982 г. N 115-6а
УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.
Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (козье-овечий), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), овис (бараний), канис (собачий) и неотома (кустарниковых крыс).
Микроорганизмы первых трех видов вызывают бруцеллез; бруцеллы вида овис - заболевание, называемое инфекционным эпидидимитом баранов (ИЭ).
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологических, серологических и аллергических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.
1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида, однако бруцеллы видов мелитензис и абортус могут мигрировать и на животных других видов;
клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее частое клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов. При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез нередко сопровождается поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);
патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно (так называемый "миллиарный бруцеллез матки").
1.2.2. У баранов, больных инфекционным эпидидимитом, в семенниках и придатках обнаруживают воспалительно-некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенника.
1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое и серологическое) исследования материала и аллергические исследования животных в хозяйствах.
Плановые серологические и аллергические исследования являются основными методами выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.
Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
1.4. При отборе проб крови, молока и патологического материала, а также при проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
2.2. На бактериологическое исследование на бруцеллез в лабораторию направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее 3 плодов) или желудок плода с содержимым (желудок перевязывают со стороны пищевода и со стороны двенадцатиперстной кишки), а также кусочки печени и селезенки.
При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70-градусным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70-градусным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 - 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70-градусным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1-процентного спиртово-водного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
2.2.1. Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют: от баранов - семенники с придатками; от овцематок - абортированные плоды с плодовыми оболочками, выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта.
2.2.2. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в тот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь на серологическое исследование на бруцеллез.
Если в течение 24 - 30 часов взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30-процентным водным раствором химически чистого глицерина.
Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 - 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
2.3. На серологическое исследование в лабораторию направляют кровь (или сыворотку крови) и молоко.
2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из ушной или хвостовой, у лисиц и песцов - из бедренной вены, у норок - путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста) в стерильные пробирки по 5 - 7 мл (от пушных зверей по 1 - 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30 - 60 мин. при 20 - 30 °С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 - 10 °С. Через 20 - 24 часа отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки (лучше в пробирки Флоринского) и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.
Консервирование сывороток проводят:
добавлением 0,05 мл (1 капля) 5-процентного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании;
сухой борной кислотой (2 - 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов;
путем однократного замораживания.
Неконсервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 дней со дня взятия крови с сохранением ее при 4 - 8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней; замороженные сыворотки - в течение 3 дней после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу (10 - 15 мл) цельного свежего молока берут из одного удоя от коровы (буйволицы) в стерильную пробирку. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
При направлении молока на исследование в лабораторию каждую пробу консервируют добавлением одной капли 10-процентного раствора формалина на 5 - 10 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 - 3 суток. Перед исследованием его необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.
При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции следует проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), страдающих маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые 2 недели после родов.
2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание.
3.2. Бруцеллы обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.
3.3. Бактериоскопическое исследование.
Из доставленного на исследование патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные на пламени, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин (см. Приложение N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно кокко-бактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.
3.4. Бактериологическое исследование.
3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар (см. Приложение N 1, п. 2).
Культивирование возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-аминопептидном агарах, а также на сывороточно-декстрозном агаре (см. Приложение N 1, п. 2).
3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5-процентным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.
Из печенки и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 - 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.
Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.
При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений). Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3-процентным раствором гидроокиси калия на 30 минут. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5-процентного спиртового раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 мл среды.
Содержимое бурс, гигром высевают на 3 - 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.
Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 - 0,2 мл вносят на 3 - 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом, высевают на среды без бактериостатических веществ.
3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 - 38 °С.
При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек инкубируют в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 - 15%), другую - в обычных атмосферных условиях.
Для выделения возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) все посевы инкубируют в атмосфере, содержащей 10 - 15% углекислого газа.
Для создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа засеянные пробирки заливают парафином или помещают в эксикатор (микроанаэростат).
Перед парафинированием пробирки закрывают горящими ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 - 1 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.
Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;
внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25-процентного раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);
сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.
Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Приложение N 1, п. 3).
3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 - 38 °С в течение 30 дней. Первый просмотр посевов проводят через 18 - 24 часа. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, отбраковывают.
В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 - 4 дня визуально, при необходимости через лупу или при малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают конденсационной жидкостью.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов и делают пересев на чашку с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.
Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой.
При постановке реакции агглютинации на обезжиренное предметное стекло наносят каплю бруцеллезной сыворотки в разведении 1:50 и каплю той же сыворотки в разведении 1:2 (для выявления слабоагглютинабельных культур). В каждую каплю сыворотки бактериологической петлей вносят агаровую культуру и тщательно растирают ее. Одновременно ставят контроль с негативной сывороткой в тех же разведениях.
При положительной реакции через 1 - 3 мин. в капле позитивной сыворотки образуются хлопья или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В контроле наблюдается равномерное помутнение без образования хлопьев.
При отрицательной реакции агглютинации с культурой из одной колонии дополнительно исследуют не менее трех-четырех подозрительных колоний.
Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами и дающие положительную реакцию агглютинации с позитивной сывороткой, относят к бруцеллам.
Первичные культуры возбудителя инфекционного эпидидимита баранов подвергают серологической идентификации. Для этого проводят гипериммунизацию двух кроликов массой 2 - 3 кг путем двукратного с интервалом 7 - 8 дней внутривенного введения им по 2 мл взвеси двухсуточной исследуемой культуры, содержащей 3 - 4 млрд. микробных клеток в 1 мл физиологического раствора. Через 10 - 12 дней после второго введения от кроликов получают сыворотку крови и исследуют ее в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с овисным антигеном.
Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов вызывает образование антител в крови кроликов (положительная РДСК). Отрицательный результат РДСК с овисным антигеном означает, что изучаемая культура не относится к возбудителю инфекционного эпидидимита баранов.
3.5. Биологическое исследование.
3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 - 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием сыворотки их крови в РА с отрицательным результатом в разведении 1:5.
3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.
Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят подкожно с внутренней стороны бедра морской свинке в дозе 1 мл.
Из плаценты и плодовых оболочек (предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами) вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют их на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в дозе 1 мл.
Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в дозе 0,2 - 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.
Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 - 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.
3.5.3. На 15-й, 25-й и 40-й дни после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 - 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца - путем пункции и сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.
При положительной реакции агглютинации (в разведении 1:10 и выше) морских свинок убивают, в случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в 1 пробирку бульона и 2 пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.
При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают.
3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают.
3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.
При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез.
3.7. Сроки исследования:
бактериологического - до 1 месяца;
биологического - до 2 месяцев.
3.8. В районных и межрайонных ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атмосферах в течение 1 часа.
3.9. При необходимости определения вида бруцелл, а также в целях дифференциации полевых штаммов от вакцинных выделенные от животных культуры направляют в республиканские, областные, зональные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.
4. МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке коров - кольцевой реакции (КР).
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА и РСК и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);
раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения одновременно 10 сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли:
с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела антигена
осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком
встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и комочки,
а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный
"зонтик" (75% агглютинации);
++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен (50%
агглютинации);
+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен
слабо, при встряхивании заметно небольшое количество
хлопьев или комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не
наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших
микробов антигена, при легком встряхивании образуется
равномерная взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME, 1:200 - 200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного исследуют повторно через 3 - 4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах (например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более - "сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК).
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике инфекционного эпидидимита баранов.
4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение 50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре, указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);
комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4% борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N 2, п. 4).
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;
гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном. Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);
эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь эритроцитов;
физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Приложение N 2, п. 2).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
--------------------------+------------------------------------------------ ¦ Компоненты ¦ Проверка на: ¦ ¦ +-----------+-----------------------------------+ ¦ ¦антикомпле-¦ гемотоксичность ¦ ¦ ¦ментарность+-------+-------+--------+----------+ ¦ ¦ ¦компле-¦гемоли-¦антигена¦физиологи-¦ ¦ ¦ ¦мента ¦зина ¦ ¦ческого ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦раствора ¦ +-------------------------+-----------+-------+-------+--------+----------+ ¦Комплемент в разведении ¦0,2 ¦0,2 ¦- ¦- ¦- ¦ ¦1:20 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Гемолизин в рабочем титре¦0,2 ¦- ¦0,2 ¦- ¦- ¦ ¦Антиген в рабочем титре ¦0,4 ¦- ¦- ¦0,4 ¦- ¦ ¦Эритроциты (2,5% или 3%) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦Физиологический раствор ¦- ¦0,6 ¦0,6 ¦0,2 ¦0,8 ¦ ¦ водяная баня 10 минут при 37 - 38° ¦ +-------------------------------------------------------------------------+ ¦Результат: гемолиз полная задержка гемолиза ¦ ---------------------------------------------------------------------------
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента - сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных, которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего учитывают результат.
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной сыворотки) представлена в таблице 1.
Таблица 1
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА В БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ
--------------------+--------+-------------------------------------------------- ¦Компоненты реакции ¦Ряд про-¦ Номера пробирок ¦ ¦ ¦бирок в +----+----T----+----T----+----T----+----T----+----+ ¦ ¦штативе ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ +-------------------+--------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+ ¦Негативная ¦первый ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦сыворотка 1:5 ¦второй ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Антиген в рабочем ¦первый ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦титре ¦второй ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Физиологический ¦первый ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ¦раствор ¦второй ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Комплемент в разве-¦первый ¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦ ¦дении 1:20 ¦второй ¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Недостающее коли- ¦первый ¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦- ¦ ¦чество физиологи- ¦второй ¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦- ¦
¦ческого раствора ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Водяная баня 20 минут при 37 - 38° ¦ ¦ ¦ ¦Гемолитическая ¦первый ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦ ¦система ¦второй ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦ ¦ ¦ ¦ Водяная баня 20 минут при 37 - 38° ¦ ¦ ¦ ¦Примерный результат¦первый ¦НГ ¦НГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ ¦ ¦второй ¦НГ ¦НГ ¦ЧГ ¦ЧГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ --------------------+--------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----
Обозначения: ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, НГ - нет гемолиза.
Примечание. Для удобства в работе и более точной дозировки вначале рекомендуется приготовить необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах в отдельных пробирках. Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят комплемент, разведенный 1:20, в дозах 0,2; 0,4; 0,6 мл и т.д. до 2 мл, добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 мл количество физиологического раствора, то есть соответственно 1,8; 1,6; 1,4 мл и т.д. Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,2 мл жидкости в первые пробирки с сыворотками, взятыми для титрования, из второй пробирки - соответственно во вторые пробирки с сыворотками и т.д. Работу можно выполнять аппаратом Флоринского.
Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз взвести эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин. в водяной бане при 37 - 38°, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном.
Примечание. Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном отмечают задержку гемолиза более чем на один интервал по сравнению с этой же сывороткой без антигена, это означает, что для титрования была взята положительная сыворотка. В таких случаях определение титра комплемента проводят по ряду пробирок без антигена.
В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента в бактериолитической системе равен 0,1. Рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,02 больше, в данном случае 0,12.
Таблица 2
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА
---------------+--------+-------------------------------------------------- ¦ Сыворотки ¦ Ряды ¦ Номера пробирок и дозы комплемента ¦ ¦ ¦пробирок+----+----T----+----T----+----T----+----T----+----+ ¦ ¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ ¦ ¦ +----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+ ¦ ¦ ¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦ +--------------+--------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+ ¦Позит. ¦1 ¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦++++¦ ¦ ¦2 ¦++++¦+++ ¦+ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Негат. ¦1 ¦++++¦++ ¦+ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ¦ ¦2 ¦+++ ¦++ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Из опыта ¦1 ¦++++¦++++¦+++ ¦+++ ¦++ ¦+ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦ ¦ ¦2 ¦++++¦+++ ¦++ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦ ---------------+--------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----
Расчет количества неразведенного комплемента, необходимого для главного опыта, делают по формуле:
A x B
X = -----,
20
где:
X - количество неразведенного комплемента;
A - рабочий титр комплемента;
B - количество пробирок в опыте;
20 - основное разведение комплемента (1:20).
Пример:
0,12 x 100
X = ---------- = 0,6.
20
Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующееся для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2 х 100), то к 0,6 мл неразведенного комплемента следует добавить 19,4 мл физиологического раствора.
4.3.4. Проведение главного опыта.
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. таблицу 3).
Таблица 3
СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РСК
------------------------+------------------+------------------------------- ¦ Компоненты реакции ¦ При массовом ¦ Для повторного исследования ¦ ¦ ¦ исследовании +--------------------+---------+ ¦ +---------+--------+пробирки для каждой ¦контроль ¦ ¦ ¦пробирки ¦контроль¦испытуемой сыворотки¦гемолити-¦ ¦ ¦с испыту-¦гемоли- +------+------+------+ческой ¦ ¦ ¦емыми сы-¦тической¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦системы ¦ ¦ ¦воротками¦системы ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----------------------+---------+--------+------+------+------+---------+ ¦Испытуемая сыворотка ¦0,04 ¦- ¦0,04 ¦0,04 ¦0,02 ¦- ¦ ¦Физиологический раствор¦0,16 ¦0,6 ¦0,36 ¦0,16 ¦0,18 ¦0,6 ¦ ¦ ¦ ¦ Инактивирование сывороток ¦ ¦ ¦ ¦Антиген в рабочем титре¦0,2 ¦- ¦- ¦0,2 ¦0,2 ¦- ¦ ¦Комплемент в рабочем ¦0,2 ¦- ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦- ¦ ¦разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Водяная баня 37 - 38° - 20 минут ¦ ¦ ¦ ¦Гемолитическая система ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦ ¦ ¦ ¦ Водяная баня 37 - 38° - 20 минут ¦ ---------------------------------------------------------------------------
Примечание: Допускается смешивание перед разливом равных объемов антигена и комплемента.
Необходимые разведения сывороток рекомендуется готовить следующим образом.
При исследовании в одной пробирке берут 0,1 мл испытуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физиологического раствора (разведение 1:5), после тщательного перемешивания 0,3 мл разведенной сыворотки удаляют.
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное