Приказ Минздрава СССР от 02.04.1986 N 450

О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией

Полужидкую среду разливают в пробирки по 5,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 120° (1 атм.) в течение 20 мин. или при 110° (0,5 атм.) - 30 мин. Срок годности - до 1 месяца при 4° (в холодильнике) или в течение 10 дней при комнатной температуре. Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 0,5 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Затем в каждую пробирку закапывают по 0,05 мл (1 капля) 2-процентного раствора теллурита калия. Среду выборочно контролируют на стерильность в термостате при 37° в течение 48 часов. Срок годности среды - 10 дней при условии хранения в холодильнике и 3 дня - при комнатной температуре.

Для постановки РНАт с целью индикации дифтерийного токсина материал из зева и носа или выросшую культуру лучше засевать в бульоны (Хонттингера, Мартена, рыбный). Рыбный бульон готовят из сухого коммерческого препарата по прописи на этикетке. Бульон разливают в пробирки по 3,0 мл. Стерилизуют в автоклаве при 120° (1 атм.) в течение 20 мин. или при 110° (0,5 атм.) - 30 мин. Содержание аминного азота - 150 - 180 мг %, строго следят за pH = 7,6. Срок годности - до 1 месяца при 4° (в холодильнике) или в течение 10 дней при комнатной температуре.

Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 1,0 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Затем в каждую пробирку закапывают 0,05 мл (1 капля) 2-процентного раствора теллурита калия. Среду на бульоне контролируют и хранят так же как и 0,1-процентную агаровую среду.

Среды для первичного посева исследуемого материала

1. Среда Клауберга П

К 100 мл 3-процентного питательного агара pH = 7,6 (от 5,2 г до 7,5 г сухого питательного агара - рассчитать в зависимости от прописи на этикетке - на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50°, добавляют 3 мл 2-процентного раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл "лаковой" крови.

Приготовление глицериновой смеси

К 40 мл дефибринированной крови (или разбитых в физиологическом растворе сгустков, эритроцитарной массы) добавить 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуется при температуре 110° в течение 30 мин.). Если используемая кровь, сгустки или эритроцитарная масса были нестерильны, то кровяную глицериновую смесь необходимо выдержать в холодильнике при температуре от 4 до 10° в течение 3 недель. Сохраняют в условиях холодильника до 4-х месяцев.

Приготовление "лаковой" крови

К 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 16 мл дефибринированной крови (или разбитых в физиологическом растворе сгустков).

Состав агаровой основы на аминопептиде для среды Клауберга П (расчет на 1 литр)

1. Аминопептид - 0,35 л.

2. Дистиллированная вода - 0,65 л.

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 5,0 г.

4. Натрий хлористый - 4,0 г.

5. Агар-агар - 30,0 г.

6. Л-цистин солянокислый - 0,01 г (1-процентный раствор - 1 мл).

7. Активированный уголь - 3,0 г.

На этой питательной основе среда Клауберга П готовится по выше указанной прописи.

2. Кровяной теллуритовый агар

К 100 мл 2-процентного питательного агара pH 7,6 (3,5 или 5 г сухого питательного агара (см. пропись на этикетке) на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50°, добавляют 2 мл 2-процентного раствора теллурита калия и 10 - 15 мл гемолизированной крови (или кровяной смеси).

Приготовление гемолизированной крови

На каждые 10 мл дефибринированной крови добавить 2 мл стерильной дистиллированной воды.

Возможно использование кровяной теллуритовой смеси, составленной из гемоглобина сгустков крови или эритроцитарной массы с добавлением дистиллированной воды (или физраствора или сыворотки крупного рогатого скота) и теллурита калия (см. методику приготовления крови). На 100 мл питательного агара берут 12 мл (можно 11 - 16 мл) кровяной теллуритовой смеси и добавляют 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия.

Состав агаровой основы для кровяной теллуритовой среды (расчет на 1 литр)

1. Аминопептид - 0,25 л.

2. Дистиллированная вода - 0,75 л.

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 5,0 г.

4. Натрий хлористый - 4,0 г.

5. Агар-агар - 20,0 г.

6. Л-цистин солянокислый - 0,01 г (1-процентный раствор 1 мл).

7. Активированный уголь - 3,0 г.

На этой питательной основе кровяная теллуритовая среда готовится так же, но добавляется кровь дефибринированная гемолизированная или кровяная смесь в количестве 5 мл.

Приготовление питательных агаровых основ на аминопептиде для среды Клауберга П и кровяной теллуритовой среды

Аминопептид разводят дистиллированной водой, добавляют натрий хлористый (NaCl) и агар-агар, кипятят до расплавления. Добавляют ЭКД, размешивают до его полного растворения, устанавливают pH = 7,7 - 7,8 20-процентным раствором едкого натра (NaOH) и кипятят 5 минут. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой, добавляют необходимое количество 1-процентного раствора Л-цистина. В случае отсутствия солянокислого цистина, хорошо растворимого в воде, можно использовать Л-цистин, растворимый в 0,1 N растворе едкого натра. Обязательным условием является полное растворение цистина. После Л-цистина добавляют уголь активированный из расчета 3,0 на 1 литр.

Питательные агаровые основы разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110 - 112° (0,5 атм.) в течение 30 мин. с предварительным прогревом текучим паром при 100° в течение 3 мин. Сохраняются питательные агаровые основы в холодильнике в течение 2-х месяцев.

Сухая хинозольная индикаторная среда Бучина

К 100 мл дистиллированной воды или различных бульонов добавляют 7 - 8 г (согласно прописи на этикетке) порошка сухой хинозольной среды, тщательно размешивают и нагревают на слабом огне до полного растворения агара. Среду кипятят в течение 2 - 3 мин., не допуская пригорания агара до образования крупнопузырчатой, быстрооседающей пены. К охлажденной до 50° среде добавляют 5 мл стерильной дефибринированной крови. Не допускается применение среды без крови, с сывороткой.

Все питательные среды разливают по чашкам Петри слоем 3 - 4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при температуре от 4 до 10°.

Среда для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии - сывороточный агар

Сывороточный агар может быть приготовлен на любой питательной основе, применяемой для культивирования коринебактерий дифтерии.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 50° питательного агара (pH 7,6) стерильно добавляют 10 мл лошадиной или бычьей сыворотки. После перемешивания среду разливают в стерильные пробирки по 3 - 4 мл, которые укладывают в наклонном положении для образования скоса. Каждая партия сывороточного агара проверяется на стерильность: несколько пробирок из этой партии помещают на сутки в термостат. В случае прорастания среды уничтожаются все пробирки с сывороточным агаром. Пробирки со скошенным сывороточным агаром хранятся в условиях холодильника не больше 2-х недель.

Среды для определения токсигенности

1. Приготовление мартеновского агара с мясной водой двойной концентрации

Приготовление мартеновского пептона

Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью, отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают в бутылки емкостью 3 - 5 литров и заливают подогретой до 40 - 50° водопроводной водой из расчета на 1 литр воды 300 - 500 г измельченной массы. Температура должна быть 40°. Туда же прибавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат: 1) либо на 15 - 18 часов (или более) при 37 - 40°; 2) либо при наличии отдельного термостата при 42 - 45° на 18 часов (или более). В течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1,0 - 1,5 час), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутылки лежит небольшой слой мелкого темного осадка. Полноту осаждения балластных белков можно проверить путем добавления к 5 мл профильтрованного пептона 1 - 2 капли 10-процентного NaOH, муть не должна появляться.

Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80°, устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с препаратом. Нагревание продолжается в течение 10 мин. Для этой цели можно использовать аппарат Коха или автоклав. Бутыли тщательно взбалтывают, закрывают ватно-марлевой пробкой с бумажным колпачком и ставят в прохладное сухое помещение для отстаивания при температуре не выше 12°. Пептон годен к употреблению не ранее чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.

Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде может храниться без стерилизации при комнатной температуре.

Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды двойной концентрации желательно пользоваться свежим незамороженным мясом средней упитанности нестарого животного. Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды на 1 кг фарша и оставляют на ночь в холодильнике (от 4 до 10°), утром смесь кипятят на асбестовой сетке в течение 15 - 20 минут с момента закипания. Готовый настой фильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают в стерильные бутыли по 250 - 500 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Хранить по возможности в холодильнике.

Приготовление мартеновского агара

Мартеновский пептон - 0,5 л, мясная вода - 0,5 л, агар-агар - 15 - 18 г (1,5% - 1,8%), (1,5-процентный агар используют при добавлении 20% лошадиной сыворотки, 1,8-процентный - при добавлении 30% сыворотки крупного рогатого скота), уксуснокислый натрий - 5 г, мальтоза - 3 г.

15 или 18 г агара промывают в течение рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 мясной воды). Устанавливают pH 7,8 - 8,0 путем подщелачивания бульона 20-процентным раствором NaOH по бумажке с индикатором крезоловый красный, которая при этой реакции изменяет желтый цвет в розово-малиновый. Бульон кипятят в течение 10 мин., считая с момента закипания, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксуснокислого натрия, 0,3 мальтозы (3 г на 1 л), проверяют pH и, если нужно, снова доводят до 7,8 - 8,0, кипятят в течение 15 минут, дают отстояться в теплом месте (в аппарате Коха, термостате) 2 - 3 часа и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70 - 80 мл) при большом объеме работы для одноразового использования или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут.

Приготовление бумажек с индикатором крезоловый красный

0,1 г крезолового красного растворяют в 100 мл 95-процентного спирта и оставляют при температуре 37° на 24 часа, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтрованной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

Сухой питательный агар для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии

Для приготовления среды сухой порошок растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно размешивают на слабом огне при постоянном помешивании, нагревают до полного расплавления агара, кипятят в течение 5 - 7 минут с закрытой ватной пробкой, фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70 - 80 мл) при большом объеме работы для одноразового использования или пробирки (10 мл), стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут. Перед разливом в чашки Петри к расплавленной и охлажденной до 50° среде добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота.

Среды для определения биохимических свойств

1. Среда Пизу для определения фермента цистиназы на мартеновском агаре

    К  90  мл расплавленного 1,5-процентного только мартеновского агара (не
допускается  использование  агара  Хоттингера),  pH  7,6,  добавляют  2  мл
1-процентного раствора цистина, приготовленного  на  0,1 N  растворе  H SO
                                                                       2  4
(или N HCl),  тщательно  перемешивают  и  добавляют  такой  же  объем 0,1 N
раствора   NaOH.  Раствор   NaOH   добавляют  к  среде  для   нейтрализации
соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны  быть
взаимно    оттитрованы,    можно   использовать   фиксаналы,    выпускаемые
предприятиями химической промышленности.

Среду стерилизуют при температуре 112° в течение 30 минут, можно сохранять один месяц в холодильнике.

Агар с цистином расплавляют при 90° (не кипятят) для сохранения цистина. К охлажденной до 40 - 45° среде добавляют 1 мл 10-процентного раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота с соблюдением правил асептики и разливают по пробиркам любого диаметра (лучше агглютинационным) столбиком высотой 3 - 4 см.

Необходимо учитывать, что при 50° сыворотка в присутствии уксуснокислого свинца свертывается, и среда приобретает молочный цвет, что затрудняет учет реакции.

Среда Пизу для определения фермента цистиназы (модификация Ю.М. Фельдмана)

В 90 мл дистиллированной воды растворить 3 г сухого питательного агара (лучше агара "Д" или эритритагара) и прокипятить. (Навеска сухого питательного агара рассчитывается исходя из прописи на этикетке, чтобы плотность его составляла 1,5%.) Добавить 2 мл 1-процентного раствора цистина в 0,1 N растворе соляной кислоты (HCl) с последующим подведением pH среды до 7,6, 2 мл 0,1 N раствора NaOH (как указано выше). Мутные или окрашенные серии агара не используют. Среда стерилизуется 10 - 15 мин. при 112°.

К расплавленной и охлажденной до 40 - 45° среде добавляют 1 мл 10-процентного раствора уксуснокислого свинца, 2 мл стерильного 10-процентного раствора гипосульфита натрия, приготовленного ex tempore на дистиллированной воде, 10 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Далее разливают, как в предыдущем рецепте.

Раствор 10-процентного уксуснокислого свинца и 10-процентного гипосульфита натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане при 80 - 90° 30 мин.

2. Среды для определения фермента уреазы

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе.

Бульон с мочевиной для определения уреазы

К 100 мл стерильного мясо-пептонного или бульона Хоттингера (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6-процентного спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают над огнем по 2 - 3 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин. Результаты учитывают через 20 - 24 часа после выдерживания в термостате при 37°.

Приготовление реактивов для определения уреазы по методу Заксе

Готовится 2 реактива: А и В.

Реактив А

Мочевина - 2 г.

96° этиловый спирт - 2 мл.

Дистиллированная вода - 4 мл.

Реактив В

0,2-процентный раствор фенолрот - 1 мл.

    Однозамещенный фосфат калия (KH PO ) - 0,1 г.
                                   2  4
    Двузамещенный фосфат калия (K HPO ) - 0,1 г.
                                 2   4

Хлористый натрий (NaCl) - 0,5 г.

Дистиллированная вода - 100 мл.

Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре от +4° до + 10°. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.

Для работы оба реактива смешиваются ex tempore из расчета 1 часть реактива А и 19 частей реактива В, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл. Результат учитывают через 30 мин., после выдерживания в термостате при 37°.

Среды для изучения сахаролитических свойств

Для определения сахаролитической способности рекомендуется использовать среды на 1-процентной пептонной воде.

К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г химически чистой поверенной соли, после чего добавляют 1,0 мл индикатора Андреде. Устанавливают pH 7,4, кипятят 5 минут, фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют один из перечисленных углеводов (сахароза, глюкоза) в количестве 0,5 г, крахмал (растворимый) - 0,5 г.

Среды разливают в пробирки по 2 - 3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 минут или при 0,5 атм. 30 минут. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветны или имеют слегка розоватый оттенок.

Приготовление индикатора Андреде

Посуда должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой. На 100 мл дистиллированной воды добавляют:

0,5 г кислого фуксина;

16,4 мл 4-процентного раствора NaOH.

Раствор на сутки ставят в термостат при 37°, периодически встряхивают, 2-е суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный раствор имеет соломенно-желтый цвет или слегка розовый оттенок, который исчезает в процессе хранения. Интенсивно розовый цвет индикатора указывает на необходимость увеличения щелочи в процессе приготовления до 1 мл.

Среда для восстановления нитрата в нитриты

    К  питательному бульону pH 7,3 - 7,5, свободному от нитритов (проверить
реактивом  Грисса), прибавляют  0,1% свободной от нитритов калийной селитры
(0,1 г KNO  на 100 мл питательного бульона), проверив еще раз на содержание
          3
нитритов,  разливают  по 5 мл в пробирки, предварительно тщательно промытые
проточной  водой.  Среды  стерилизуют  15 мин. при 120°. Пробирки со средой
засевают  изучаемой культурой и инкубируют в термостате при 37° в течение 5
дней. Для контроля инкубируют пробирку со средой, не засеянной культурой.

Приготовление реактива Грисса

Раствор N 1 - 0,8-процентная сульфаниловая кислота в 5 N уксусной кислоте. Раствор N 2 - 0,6-процентный диметил-альфа-нафталамин в 5 N уксусной кислоте.

Перед производством реакции смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2, добавляют эту смесь по 3 капли в каждую пробирку с засеянным изучаемой культурой нитратным бульоном после 5 дней инкубации в термостате и 3 капли в контрольную пробирку.

Реактив годен в течение 15 мин., бесцветен, при появлении розового окрашивания непригоден. При редукции нитратов появляется красное окрашивание. Среда в контрольной пробирке цвета не изменяет.

Приготовление 3-процентного солевого раствора

    К  100  мл дистиллированной воды прибавляют 3 г NaCl и устанавливают pH
7,6 путем прибавления 3-процентного раствора Na HPO .
                                               2   4

Солевой раствор стерилизуют трехкратно текучим паром.

Методика бактериологического контроля питательных сред

В практических лабораториях каждая новая партия приготовленной питательной среды, особенно при использовании новых питательных основ (промышленного или лабораторного изготовления) или новых ингредиентов, входящих в состав среды, подлежит бактериологическому контролю ввиду возможной нестандартности основ и ингредиентов, используемых при изготовлении этих сред.

Бактериологическому контролю подлежат среды для первичного посева материала и среды для определения токсигенных, биохимических и сахаролитических свойств. При изготовлении сред важным моментом является предварительный контроль основы среды на содержание аминного азота.

1. Контроль качества сред Клауберг П, кровяно-теллуритового агара и среды Бучина устанавливают путем определения:

а) всхожести коринебактерий дифтерии;

б) ингибирующей активности в отношении сопутствующей флоры;

в) времени формирования колоний.

При этом используют контрольный токсигенный штамм или местные свежевыделенные токсигенные культуры коринебактерий дифтерии с типичными культурально-морфологическими свойствами. Оценка ингибирующей активности проводится с помощью штамма стафилококка (музейного или местного свежевыделенного).

Односуточную культуру дифтерии и стафилококка (18 - 20-часового роста), выращенную на сывороточно-агаровой среде, смывают физиологическим раствором и подводят под оптический стандарт мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, соответствующий 10 ед. мутности - условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси. Из исходной стандартной взвеси в стерильных пробирках готовят 10-кратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл физиологического раствора, тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага".

СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА

---------+-----------------------+-------------------+----------------
¦    N   ¦Кол-во физиологического¦   Объем вносимой  ¦  Количество   ¦
¦пробирок¦    раствора (в мл)    ¦  культуры (в мл)  ¦микробов в 1 мл¦
+--------+-----------------------+-------------------+---------------+
¦Исходное разведение - 1 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического ¦
¦                       раствора (1000000000)                        ¦
+--------+-----------------------+-------------------+---------------+
¦1       ¦1,0                    ¦1,0 исходной взвеси¦500000000      ¦
¦2       ¦4,5                    ¦0,5 из 1-й пробирки¦50000000       ¦
¦3       ¦4,5                    ¦0,5 из 2-й пробирки¦5000000        ¦
¦4       ¦4,5                    ¦6,5 из 3-й пробирки¦500000         ¦
¦5       ¦4,5                    ¦0,5 из 4-й пробирки¦50000          ¦
¦6       ¦4,5                    ¦0,5 из 5-й пробирки¦5000           ¦
¦7       ¦2,0                    ¦0,5 из 6-й пробирки¦1000           ¦
---------+-----------------------+-------------------+----------------

Из двух последних разведений (6-го и 7-го) по 0,1 мл взвеси (соответственно 500 и 100 микр. кл.) вносят в 2 хорошо подсушенные чашки, досуха растирают шпателем (для каждой чашки новый шпатель). На 2 другие чашки с испытуемой средой производят таким же способом высев стафилококка. Учет результатов производят через 24 - 48 часов.

Среда признается годной к применению, если колонии коринебактерий дифтерии формируются на поверхности испытуемой среды через 24 часа (в среде Бучина - до 48 часов) инкубации в виде изолированных колоний. При посеве 100 высеянных микробных клеток - не менее 3 - 5 колоний при отсутствии роста стафилококка на всех засеянных чашках. При отсутствии роста коринебактерий дифтерии при посеве 500 и 100 м.к. опыт необходимо повторить. Если результат будет таким же, то среда не годится к употреблению.

2. Контроль среды для определения токсигенности коринебактерий дифтерии.

Данный контроль осуществляется путем приготовления среды для определения токсигенности и испытания ее контрольным дифтерийным штаммом, соблюдая все этапы методики определения токсигенных свойств на плотных питательных средах. Критериями оценки качества среды являются наличие преципитатов и время их образования. Пригодными для работы считаются те серии среды, при использовании которых у токсигенного контрольного штамма интенсивные преципитаты образуются через 24 часа после посева "бляшками". Среды (или новые ингредиенты) не могут быть использованы и подлежат замене в случае отсутствия преципитатов или появления их в более поздние сроки.

3. Бактериологический контроль сред для определения биохимических и сахаролитических свойств проводят путем определения степени выраженности и времени формирования данного признака. В среду Пизу, бульон с мочевиной (или реактивы А и В), в среды Гисса засевают петлей контрольный дифтерийный штамм; при проверке сред Гисса контрольный дифтерийный штамм должен быть биохимического типа гравис.

Методика количественного определения аминного азота <*>

--------------------------------

<*> В соответствии с Методическими указаниями МЗ СССР по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М. 1977. Можно определять аминный азот и другими методами.

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH = 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы:

1. Едкий натр 0,1 N раствор.

2. Соляная кислота 0,1 N раствор.

3. Формалин (40-процентный раствор формальдегида). Перед каждым определением pH формалина доводят до 7,0.

Ход определения

Для анализа используют определенный объем "В" жидкого образца. "В" равно для жидких гидролизатов низкой степени расщепления (0,1 - 0,2% аминного азота) - 3 мл; средней степени расщепления (0,3 - 0,6% аминного азота) - 1 мл; высокой степени расщепления (0,7 - 1,3% аминного азота) - 0,5 мл; для жидких питательных сред (0,08 - 0,14% аминного азота) - 3 мл; для жидких экстрактов (0,02 - 0,04% аминного азота) - 10 мл.

В стакан емкостью 50 мл наливают объем "В" анализируемого раствора образца и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до 7,0 с помощью 0,1 N раствора NaOH или 0,1 N раствора соляной кислоты. Во время определения электроды должны оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое 0,1 N раствором едкого натра до pH 9,1. При титровании следует использовать микробюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом образце в %, (X) вычисляют по формуле:

                              А х К х 1,4 х 100
                          X = -----------------,
                                  В х 1000

где:

А - количество 0,1 N раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование испытуемой пробы;

К - поправка к титру 0,1 N раствора NaOH;

1,4 - количество аминного азота в мг, эквивалентное 1 мл 0,1 N раствора NaOH;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

В - количество жидкого образца в мл, взятое на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мг в г.

Методика приготовления крови, кровяных и кровяно-теллуритовых смесей

Используют самые разнообразные источники получения крови и кровяных смесей. Лучшей кровью является дефибринированная кровь скота (крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец), полученная на мясокомбинатах или бойнях, дефибринированная кровь лабораторных животных - кроликов. Эту кровь забирают в стерильные бутыли с бусами стерильным полым ножом, монтируя специальные системы с соблюдением всех правил асептики. В отдельных случаях кровь собирают, не монтируя специальных систем, сливая первые порции крови вне бутыли.

Можно использовать кровь человека со станций переливания крови (цитратную и с консервантами), приготовляя из нее специальные кровяные смеси. Необходимым условием является сбрасывание жидкой отстоявшейся части крови с цитратом или другими консервантами. В оставшуюся эритроцитарную массу нужно добавить столько же, сколько слили жидкой части крови, стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора, или сыворотки крупного рогатого скота (без консерванта) и теллурита калия. Вместо слитой жидкой части при приготовлении среды Клауберга можно добавлять глицерин.

Хорошим сырьем для получения кровяной смеси служат отходы гамма-глобулинового производства. Эритроцитарная масса (нестерильная) после нескольких центрифугирований (по производственной технологии) сбрасывается в гамма-глобулиновом производстве. Эти отходы заливают стерильной дистиллированной водой или глицерином из расчета 1/4 - 1/5 объема эритроцитарной массы и добавляют теллурит калия.

Можно использовать кровяные сгустки после отсасывания сыворотки для производства гамма-глобулина, сгустки плацентарной крови, полученной непосредственно от рожениц, сгустки абортной крови и сгустки после отрицательных серологических реакций. Сгустки собирают в стерильные бутыли со стеклянными бусами или битым стеклом и разбивают их. В случае когда не удается разбить бусами, сгустки замораживают и оттаивают (бутыль со сгустками помещают на сутки в морозильную камеру, после чего они легко разрушаются). Эту манипуляцию можно повторить 2 - 3 раза. Затем добавляют стерильный физиологический раствор или дистиллированную воду 1/5 - 1/4 объема сгустков и теллурит калия.

Для лучшего сохранения крови или кровяной смеси (дефибринированной, отходов гамма-глобулинового производства или сгустков) к каждой порции в 10 - 15 мл, добавляемой на 100 мл агара, приливают 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия. Такую кровяную теллуритовую смесь можно сохранять в холодильнике до 2-х месяцев.

При приготовлении кровяной теллуритовой среды на каждые 100 мл растопленного питательного агара добавляют от 11 до 16 мл кровяной теллуритовой смеси и 1,0 мл 2-процентного раствора теллурита калия. Пример расчета: к 200 мл эритроцитарной массы со станции переливания крови после того, как слили 30 мл жидкой отстоявшейся части крови с консервантом, добавили столько же - 30 мл сыворотки крупного рогатого скота (без консерванта) или дистиллированной воды, или физиологического раствора. Таким образом, получили 230 мл кровяной смеси, что составляет, примерно, 21 добавку к агару, если добавлять по 11 мл этой кровяной смеси к каждым 100 мл агара. Для консервирования 230 мл кровяной смеси необходимо добавить половину порции теллурита калия, следовательно, 21 мл. В дальнейшем готовить кровяные теллуритовые среды нужно следующим образом - к 100 мл агара добавить 12 мл кровяной теллуритовой смеси и 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия.

Приготовление и стерилизация тампонов

Для приготовления тампонов используют деревянные или металлические палочки (для транспортной среды из неокисляющегося металла), на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватными пробками так, чтобы тампон не касался дна пробирки.

Стерилизовать тампоны можно в сушильном шкафу при температуре 140 - 150° в течение часа или в автоклаве при температуре 112° в течение 30 минут.

Рецепты красок

1. Щелочная метиленовая синь Леффлера:

Дистиллированная вода - 99 мл.

1-процентный раствор едкого калия (KOH) - 1 мл.

Профильтрованный спиртовой раствор метиленовой сини (3 г метиленовой сини на 30 мл спирта) - 30 мл.

Окрашивать в течение 1 - 2 мин.

2. Уксуснокислая толуидиновая синь:

Толуидиновая синь - 0,25 - 0,5 г.

Ледяная уксусная кислота - 2 мл.

96° этиловый спирт - 5 мл.

Дистиллированная вода - 100 мл.

Окрашивать в течение 3 - 5 мин.

3. Метил-виолет или кристалл-виолет:

Метил-виолет или кристалл-виолет - 0,25 г.

5-процентный раствор уксусной кислоты - 100 мл.

Профильтровать.

Окрашивать в течение 5 - 10 мин.

4. Катионный синий - О (бензтиазоловый азокраситель).

5. Метиленовый голубой технический (тиазиновый краситель).

Для 4 и 5 красителей рецепт приготовления одинаков:

Дистиллированная вода - 100 мл.

Профильтрованный спиртовой раствор 4-го или 5-го красителя (1 г красителя на 10 мл спирта находится в термостате при 37° в течение суток) - 10 мл.

Окрашивать в течение 1 - 3 минут.

При приготовлении красок по любому из вышеуказанных методов следует помнить, что краски при длительном хранении в разведенном состоянии могут утрачивать свои свойства, поэтому их следует хранить не более месяца в темном месте во флаконах темного стекла.

    Приготовление теллурита калия (K TeO )
                                    2   3

Для приготовления теллуритовых сред используют готовый 2-процентный раствор теллурита калия в 40-процентном растворе глицерина, выпускаемый салициловым предприятием Московского химфармообъединения им. Семашко в стеклянных ампулах.

В случае отсутствия готового раствора теллурита калия его готовят следующим образом. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют нагреванием в кипящей бане в течение 30 мин. и сохраняют при комнатной температуре. В случае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане до полного растворения осадка. При плохой растворимости порошкообразного теллурита готовят 1-процентный раствор, но соответственно добавляют его к средам в двойном объеме. Порошкообразный теллурит калия необходимо хранить в банке темного стекла с притертой пробкой, учитывая его гигроскопичность. Раствор проверяют, приготовив среды, титрованным количеством коринебактерий дифтерии и стафилококка в соответствии с описанной методикой.

Заместитель начальника Главного
управления карантинных инфекций
Минздрава СССР
М.И.НАРКЕВИЧ

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: