Приказ Минздрава СССР от 02.04.1986 N 450

О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией

При неблагополучной эпидемической ситуации следует создать медицинский штаб с участием советских органов для обеспечения проведения всех мероприятий и контроля за их выполнением.

6. Санитарно-просветительная работа

Санитарное просвещение должно быть направлено на разъяснение населению необходимости выполнения всех рекомендаций медицинских работников, включающих своевременное обращение и госпитализацию больных дифтерией, с подозрением на эту инфекцию, больных ангиной; проверку уровня антитоксического иммунитета у контактировавших с больными; проведения прививок.

При этом должны быть использованы все доступные методы: лекции, беседы в учреждениях и на дому, выступление по радио, телевидению, в местной печати, привлечение к санитарно-просветительной работе по дифтерии всех медицинских работников.

Необходимо также широко использовать в работе по ликвидации очага дифтерии санитарный актив.

Заместитель начальника Главного
управления карантинных инфекций
Минздрава СССР
М.И.НАРКЕВИЧ

Приложение 5
к Приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 2 апреля 1986 г. N 450

ИНСТРУКЦИЯ ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ И ЕГО ТОКСИНА

В настоящих инструктивных материалах представлены методики, позволяющие практическим бактериологам на современном этапе борьбы с дифтерийной инфекцией на качественно новом уровне выявлять и определять возбудителя этой инфекции и его токсин.

Проведение противоэпидемических мероприятий, специфического лечения с целью предупреждения летальных исходов диктуют необходимость осуществления своевременной бактериологической диагностики при дифтерийной инфекции. Выявление возбудителя при легко протекающих заболеваниях, отличающихся трудностью клинической диагностики, получение материалов, характеризующих интенсивность циркуляции возбудителя дифтерии среди населения в различных эпидемических и иммунологических условиях, изучение его биологических свойств - необходимый круг вопросов, решаемый в системе эпидемиологического надзора бактериологами.

Необходимо помнить, что постановка диагноза, определение необходимости введения противодифтерийной сыворотки больному осуществляются врачами лечебных учреждений, бактериологическое обследование в этих случаях может явиться дополнительным методом, позволяющим клиницисту поставить диагноз дифтерии, но не отвергать его только на основании отрицательной бактериологии. В этой связи бактериологам необходимо использовать все методы, ускоряющие бактериологический ответ и дающие возможность выдачи предварительного ответа на первом этапе бактериологического исследования.

Питательные среды, определяющие рост уже через 24 часа, МБС (микроскоп бинокулярный стереоскопический) для изучения колоний (даже мелких, через 24 часа), постановка пробы на токсигенность в первые сутки роста колоний на чашках с первичным посевом, ряд усовершенствованных ускоренных методик идентификации - вот тот неполный перечень условий, способствующих выдаче предварительного ответа уже на 1 - 2 сутки от начала исследования и окончательного ответа при выделении возбудителя дифтерии (токсигенных коринебактерий дифтерии) на третьи сутки исследования.

В последующие дни (4 - 5 сутки) могут быть добавлены сведения о биохимических свойствах возбудителя дифтерии или выдан бактериологический ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии. При изучении циркуляции возбудителя и его биологических свойств выдачи предварительного ответа не требуется и бактериологическое исследование занимает 3 - 5 суток. Отрицательный бактериологический ответ может быть выдан на 2-е или 4-е сутки от начала исследования.

Характеристика микроорганизмов рода Corynebacterium

К роду Corynebacterium относится много видов микроорганизмов, таксономическое положение некоторых из них очень близко к виду Corynebacterium diphtheriae. Известна гетерогенность вида C. diphtheriae, что заставляет некоторых исследователей делить этот вид на подвиды и даже выделять по некоторым признакам коринебактерий "новые" виды. В основном, таксономические споры касаются нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Отечественными и международными номенклатурными комитетами утвержден вид Corynebacterium diphtheriae, куда входят токсигенные (возбудитель дифтерии) и нетоксигенные коринебактерии дифтерии, которые заболеваний с клиническими проявлениями дифтерии не вызывают.

Два широко распространенных вида C. xerosis и C. pseudodiphtheriu (ложно-дифтерийная палочка Гофмана - C. hofmanui) часто обитают в организме человека. Многие дифтероиды - широко распространенные сапрофиты, поэтому ориентировочным критерием оценки качества работы бактериологов может служить умение выделять некоторые дифтероиды со слизистых человека. C. ulcerans - природный патоген крупного рогатого скота (вызывает маститы у коров). Возможность заражения человека C. ulcerans крайне низка. Однако известны случаи, когда при клинической картине заболевания, схожей с дифтерией, выделены C. ulcerans токсигенные, такие больные чаще проживали в сельской местности и имели контакт с больными животными. Представляют интерес данные по распространенности этого микроба на территории СССР.

Все микроорганизмы рода Corynebacterium являются грамположительными палочками, не образующими спор, обладающими различной степенью плеоморфизма (разнообразие форм), гетеротрофы, большинство видов растет лучше в аэробных условиях.

Обычно колонии из рода коринебактерий на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) окрашены в белый или желтоватый цвет, непрозрачны, имеют округлую форму, диаметр 1 - 3 мм. Чаще всего они бывают мягкой маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода коринебактерий могут образовывать хрупкие шероховатые R-колонии. Многие виды этого рода образуют яркие пигменты. Представители этого рода не отличаются высокой ферментативной активностью. C. diphtheriae растут при 37°, устойчивы к низкой температуре, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие вещества в обычных концентрациях (3 - 5%) убивают коринебактерии дифтерии (через 20 - 30 минут). Токсигенные C. diphtheriae более чувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможно появление устойчивых к антибиотикам штаммов. Широко определять чувствительность штаммов, выделенных от бактерионосителей, к антибиотикам не следует из-за несоответствия результатов лабораторной пробы с действием антибиотиков в организме человека на возбудителя дифтерии.

Для морфологии C. diphtheriae характерно: большое разнообразие в длине клеток - от коротких кокковидных до тонких булавовидных, плеоморфизм - клетки имеют форму булавы, сперматозоида, ракетки, овоида и т.д., беспорядочное расположение, напоминающее римские цифры X, Y, наличие гранул; возможна выраженная внутриклеточная исчерченность, что является, очевидно, скоплением зерен волютина. Описано средство волютина к метиленовому синему, и при обработке клеток этим красителем гранулы или полоски - скопления гранул - прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В "Инструкции" описаны методики приготовления красителей (синих) для окраски мазков. В бактериологической практике нецелесообразно красить по Граму или другими сложными методами для выявления волютина, так как непроявившиеся свойства могут неправильно трактоваться бактериологами.

Для C. ulcerans и C. hofmanni характерна особенность в расположении отдельных клеток - склонность к параллелизму. 24 - 48-часовые культуры этих видов имеют чаще всего кокковидную и овоидную формы.

По структуре колоний и некоторым биохимическим свойствам C. diphtheriae подразделяются на так называемые колониальные или культурально-биохимические варианты - gravis, mitis, intermedius.

Через 48 - 72 часа роста S-колонии обычно связаны с вариантом, гладкие, возвышенные, 1 - 2 мм; S-R колонии - вариант gravis обычно плоские, морщинистые, с приподнятым центром, диаметром 2 - 3 мм; мелкие колонии S типа - intermedius плоские, гладкие диаметром 0,5 - 1 мм. Описаны фильтрующиеся формы C. diphtheriae. В "Инструкции" описаны два культурально-биохимических варианта - gravis и mitis, так как intermedius встречается крайне редко и по способности ферментировать крахмал соответствует mitis варианту.

Необходимо отметить, что не существует корреляции между культурально-биохимическим вариантом gravis и mitis токсигенных штаммов и тяжестью клинических симптомов дифтерии. Более широкое распространение в последние годы C. diphtheriae биохимического варианта mitis у больных дифтерией, в том числе среди взрослых, не может служить причиной возникновения заболеваний дифтерией среди взрослого населения. Последнее связано с отсутствием противодифтерийного антитоксического иммунитета.

На кровяных теллуритовых средах через 48 час. роста колонии C. diphtheriae варианта gravis сходны с колониями C. ulcerans - черные, матовые, имеют радиальную исчерченность, у C. hofmanni появляется характерный светлый ободок. В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки (ее форму, окраску) при идентификации микроорганизмов рода коринебактерий не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гиподиагностики в 55% и 14,5% случаев гипердиагностики при идентификации только по морфологическим свойствам. При идентификации C. diphtheriae в бактериологической диагностике необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя заболевания. И хотя представители рода Corynebacterium не отличаются высокой ферментативной активностью, определение некоторых биохимических свойств облегчает их идентификацию (см. табл.).

ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОРИНЕБАКТЕРИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СИСТЕМЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ C. DIPHTHERIAE

---------------+---------------+---------------------------+---------------
¦     Вид      ¦  Токсигенные  ¦        Разложение         ¦Восстановление¦
¦коринебактерий¦   свойства    +----+----T-----+-----T-----+  нитратов в  ¦
¦              ¦(с противодифт.¦цис-¦глю-¦саха-¦крах-¦моче-¦   нитриты    ¦
¦              ¦антитоксической¦тина¦козы¦розы ¦мала ¦вины ¦              ¦
¦              ¦  сывороткой)  ¦    ¦    ¦     ¦     ¦     ¦              ¦
¦              ¦   in vitro    ¦    ¦    ¦     ¦     ¦     ¦              ¦
+--------------+---------------+----+----+-----+-----+-----+--------------+
¦C. diphtheriae¦+/-            ¦+   ¦+   ¦-    ¦+    ¦-    ¦+             ¦
¦вариант гравис¦               ¦    ¦    ¦     ¦     ¦     ¦              ¦
¦C. diphtheriae¦+/-            ¦+   ¦+   ¦-    ¦-    ¦-    ¦+/-           ¦
¦вариант митис ¦               ¦    ¦    ¦     ¦     ¦     ¦              ¦
¦C. ulcerans   ¦+/-            ¦+   ¦+   ¦-    ¦+    ¦+    ¦-             ¦
¦C. hofmanni   ¦-              ¦-   ¦-   ¦-    ¦-    ¦+    ¦+             ¦
¦C. xerosis    ¦-              ¦-   ¦+   ¦+    ¦-    ¦-    ¦+             ¦
---------------+---------------+----+----+-----+-----+-----+---------------

Определение токсигенных свойств является основной дифференциально-диагностической пробой при бактериологическом исследовании на дифтерию и проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала.

С целью выдачи предварительного бактериологического ответа в Инструкции предусмотрен ускоренный метод индикации токсина - реакция нейтрализации антител (РНАт) с коммерческим дифтерийным антигенным (анатоксинным) эритроцитарным диагностикумом (ДАгЭД). Предварительный бактериологический ответ способствует раннему (на несколько суток) введению противодифтерийной антитоксической сыворотки при необходимости больным дифтерией и своевременному проведению противоэпидемических мероприятий в очаге инфекции.

    Обязательным  является  иммуно-химический  тест  на  токсигенность  (in
vitro)   -   реакция  диффузионной  преципитации  в  агаре,  основанная  на
взаимодействии  дифтерийного  экзотоксина  и  антител из противодифтерийной
антитоксической  сыворотки.  Часто  бытующее  мнение среди бактериологов об
утрате   токсигенных  свойств  штаммами  коринебактерий  дифтерии  является
неверным,  хотя  приобретение  этих  свойств,  явление  фаговой  конверсии,
известно уже давно, но только при специальном экспериментальном воздействии
                                        +
на токсигенные штаммы конвертирующим tox  фагом, в эпидпроцессе это явление
не   показано.   В   бактериологической   практике,  когда  при  ангинах  с
наложениями,  леченных  антибиотиками,  при  первичном  посеве исследуемого
материала   выделяют   токсигенные,   а   при   повторных  обследованиях  -
нетоксигенные  коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при лечении
антибиотиками скорее исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные,
а нетоксигенные продолжают выделяться. Такое же положение может создаваться
и  при  санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно токсигенных и
нетоксигенных  коринебактерий дифтерии. Выделение у таких бактерионосителей
при  повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать
как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.

Для избежания ошибок в определении токсигенных свойств необходимо их изучение у максимального числа выросших колоний на чашках с первичным посевом. При соблюдении техники постановки пробы на токсигенность, описанной в данной Инструкции, на одной чашке можно изучить 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при множественном росте подозрительных колоний только в одной, двух бляшках.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается по 2-м тестам - определение фермента цистиназы и уреазы, в редких случаях, когда необходимо идентифицировать C. ulcerans, добавляется тест-восстановление нитратов в нитриды. Среды Гисса (пестрый ряд) используются в коротком варианте: глюкоза, сахароза, крахмал.

Таким образом, идентификация C. diphtheriae основывается на определении токсигенных свойств, некоторых биохимических свойств (расщепление глюкозы, крахмала, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) с учетом морфологии клетки (при необходимости) и колоний.

В Инструкции представлена методика по изучению серологических свойств коринебактерий дифтерии. Следует отметить, что в предшествующие годы на территории СССР были распространены токсигенные штаммы 2 сероварианта, некоторые нетоксигенные штаммы также принадлежали к этому сероварианту. Однако большинство нетоксигенных штаммов имели штаммовые различия по серологическим свойствам.

Для установления эпидемиологических связей в очаге дифтерийной инфекции между спорадическими и групповыми заболеваниями, а также выявление возможных случаев реинфекции целесообразно использовать метод определения серологических и фаговых вариантов коринебактерий дифтерии.

Организационно-методическая работа бактериологических лабораторий

Бактериологические лаборатории республиканских, краевых, областных и городских (в городах с районным делением) СЭС являются методическими центрами по бактериологической диагностике:

- организуют подготовку специалистов-бактериологов с высшим и средним медицинским образованием с обязательным использованием штаммов коринебактерий дифтерии и постановкой контрольных задач;

- осуществляют контроль за работой лабораторий по бактериологической диагностике дифтерийной инфекции в районах и городах;

- контролируют правильность идентификации штаммов коринебактерий дифтерии, полученных из лабораторий районов, городов;

- проводят бактериологический контроль всех серий коммерческих питательных сред и ингредиентов, а также контроль содержания аминного азота в средах, приготовленных в лабораторных условиях;

- в каждой лаборатории республики, края, области, района должен быть контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии.

Баклаборатории городских, районных СЭС, объединенных и больничных:

- организуют постоянное получение крови или кровяных смесей для работы, используя местные ресурсы;

- обучают специалистов больниц, поликлиник (терапевтов, отоларингологов, инфекционистов, хирургов, медицинских сестер процедурных кабинетов, инфекционных отделений) и работников СЭС, осуществляющих сбор материала, правильному взятию, а при необходимости и посеву исследуемого материала;

- контролируют наличие термостатов и холодильников в ЛПУ;

- осуществляют контроль за своевременным обновлением питательных сред, тампонов в ЛПУ, а также за правильностью доставки материала в лаборатории.

Бактериологическое исследование

Взятие и доставка материала

1. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала для исследования. От больных ангинами и с подозрением на дифтерию сбор материала необходимо проводить в течение 3 - 4 часов (не позднее 12 часов) с момента обращения в ЛПУ.

2. При исследовании на дифтерию обследуют носоглотку, при этом во всех случаях берут слизь и пленки с миндалин из зева и носа. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище), помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа.

3. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники.

При бактериологическом обследовании с диагностической целью материал для исследования берут работники ЛПУ. При обследовании по эпидемиологическим показаниям, при работе в очаге дифтерийной инфекции - работники СЭС или специально созданные и обученные бригады.

4. Для взятия материала используют стерильные ватные сухие тампоны. Материал с миндалин и из носа берут отдельными тампонами натощак или не ранее чем через 2 часа после еды при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют один тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.

При проведении курса лечения антибиотиками или другими антибактериальными препаратами материал следует брать не ранее чем через 3 дня после окончания лечения, чтобы исключить их бактериостатическое действие на возбудителя дифтерии.

5. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов после взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, в поликлиниках или стационарах, когда посев будет произведен позже 3-х часов с момента взятия материала, рекомендуют засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду. В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном на деревянной основе или на проволоке из нержавеющего металла, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Применение транспортной среды удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, но позволяет ставить РНАт для предварительного ответа.

    При  транспортировке  на дальние расстояния можно использовать тампоны,
предварительно смоченные  5-процентным  раствором  глицерина  (5-процентный
раствор глицерина готовят на физиологическом растворе, pH доводят до  7,6 с

помощью  20-процентного  раствора  Na HPO ).  Тампоны  перед  употреблением
                                     2   3
смачивают  из  общего  флакона  с  глицерином,  опуская  тампон во флакон и
отжимая лишнюю жидкость о стенки флакона. Тампоны,  смоченные  5-процентным
глицерином, можно стерилизовать только в автоклаве при  температуре 112°  в
течение 30 мин.

Материал, засеянный на чашки или в транспортную среду, доставляют в баклаборатории в осенне-зимнее время года в сумках с грелками.

6. В случае необходимости постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа. Учитывая, что дифтерия является токсикосептической инфекцией, нахождение возбудителя во внутренних органах крайне редко в отличие от других септических заболеваний.

7. Пробирки четко маркируют, указывая зев (з) и нос (н), скрепляют вместе от каждого лица и придают номер в соответствии с прилагаемым списком, где указываются фамилия, имя, происхождение материала (зев, нос или другая локализация), название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование и пр.), время взятия материала.

Ход исследования

Первый день

Посев материала

Материал для исследования из зева с миндалин, из носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом одну половину поверхности среды для посева из зева с миндалин, а вторую - для посева из носа. При посеве материала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 кв. см, а затем этим же тампоном засевают круговыми движениями, втирая в поверхность среды. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистую культуру) непосредственно с чашки для дальнейшей идентификации, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37°. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотные питательные среды тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Посев следует производить на среды, согретые при комнатной температуре или в термостате (15 - 20 мин.).

Второй день

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляют точно через 24 часа, т.е. тоже во второй половине дня) с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС, окуляр 6 и увеличение 2 объектива Галилеевой системы линз).

2. Чашки с подозрительными колониями на коринебактерии дифтерии отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии препаратов-мазков с подозрительных колоний можно не проводить. Подозрительные колонии на кровяно-теллуритовых средах через 24 часа светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями, вязкие, через 48 часов - серые с металлическим оттенком, с ровными или слегка изрезанными краями, вязкие или ломкие при прикосновении петли. На среде Бучина подозрительные колонии имеют синий цвет (с различными оттенками - от серовато-зеленоватого до фиолетового), а среда на месте их роста приобретает фиолетовый оттенок.

3. Из сомнительных колоний готовят препараты-мазки. Коринебактерии дифтерии, выросшие на средах с ингибиторами роста (теллурит калия, хинозол), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Морфологические признаки не позволяют установить видовую принадлежность микроорганизма, но дают возможность предположительно отнести их к роду коринебактерий. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбираются для дальнейшей идентификации по всем тестам.

Обнаружение при микроскопии чистых культур кокков, дрожжей, споровых палочек и т.д. позволяет прекратить дальнейшее изучение колоний.

При работе должны пользоваться бактериологической петлей диаметром 1 - 2 мм.

4. В случае роста подозрительных однотипных колоний необходимо сразу же приступить к изучению их по ряду тестов идентификации (токсигенные свойства, определение цистиназы) и выделить чистую культуру на скошенный сывороточный агар. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности необожженной петлей на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку со скошенным вывороточным агаром для размножения и сохранения этой культуры. Учитывая, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности коринебактерий дифтерии, рекомендуется при множественном росте подозрительных колоний изучать токсигенные свойства по возможности у максимального числа колоний (10 - 20 колоний, смешивая 5 - 6 колоний в одну бляшку).

5. При проведении диагностических исследований в случае множественного роста подозрительных колоний с целью выдачи предварительного ответа можно поставить РНАт, дополнительную пробу Заксе (3 - 5 однотипных колоний, учет через 30 минут инкубации) и пробу Пизу (5 - 6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации). При характерной для коринебактерий дифтерии морфологии колоний в МБС, морфологии культуры, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, выявлении токсина в РНАт можно выдать предварительный ответ через 24 часа (или через 48 часов) с момента первичного посева исследуемого материала об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии.

6. Если вырастает только одна колония, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, - в столбик среды для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации материал можно брать с бляшками через 48 часов роста или через 24 часа при выявленных токсигенных свойствах культуры.

7. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно.

Третий день

1. Через 24 часа при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ.

При отсутствии специальных линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 часа.

2. Культуру, выделенную на скошенный сывороточный агар (после определения ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают повторно через 36 - 38 часов инкубации в термостате с помощью МБС. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При наличии подозрительных колоний проводят идентификацию культуры, определяют токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенный сывороточный агар (см. п. 1 второго дня исследования).

4. При отсутствии подозрительных колоний выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не обнаружены.

Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 часа пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ (см. п. 1 третьего дня исследования).

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре (выделенную с чашки в случае 48-часового роста), после определения ее чистоты засевают на среды для определения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, бульон с мочевиной или проба Заксе).

3. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной на 2-й день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности, поставленных в 3-й день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов постановки токсигенности, но при положительной пробе на цистиназу, глюкозу, отрицательной пробе на уреазу и сахарозу культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные с указанием биохимического варианта.

При выделении токсигенных коринебактерий дифтерии дополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 часа или 96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).

Бактериологическое заключение

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отсутствие гидролиза мочевины (проба на уреазу), характерные культуральные и другие биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал) позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отсутствие гидролиза мочевины, характерные культурные и другие биохимические свойства позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При наличии линий преципитации, идентичных (сливающихся) специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии положительных проб на уреазу, на цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствие ферментации сахарозы, редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, токсигенный вариант. Эти штаммы следует направлять в головное учреждение для дальнейшего изучения.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для коринебактерий ульцеранс, выделенную культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, но бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При идентификации культуры как коринебактерий Гофмана или других дифтероидов бактериологический ответ считают отрицательным.

Схема бактериологического исследования

Первый день

Посев исследуемого материала на одну из питательных сред, рекомендованных инструкций, и инкубирование в термостате при 37°.

Второй день (24 часа)

1. Изучение выросших колоний, постановка пробы на токсигенность и цистиназу, выделение культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При диагностическом обследовании и по эпидемиологическим показаниям в случае необходимости проводят исследования для выдачи предварительного ответа об обнаружении коринебактерий дифтерии (или токсина в РНАт).

Третий день (48 часов)

1. Учет результатов токсигенности и пробы на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 часов) чашек первичного посева (от 1-го дня исследования) с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и выделение чистой культуры на скошенный сывороточный агар. При диагностических исследованиях и по эпидемиологическим показаниям может быть выдан предварительный ответ об обнаружении коринебактерий дифтерии (или токсина в РНАт).

4. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

Четвертый день (72 часа)

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3-й день исследования через 48 часов роста первичного посева, и выдача документированного ответа о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Посев выделенной культуры для определения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной и нетоксигенной), выделенной во второй день исследования через 24 часа роста первичного посева.

Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

Пятый день (96 часов)

Выдача бактериологического ответа о выделении через 48 часов роста первичного посева токсигенных и нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта.

Методики идентификации коринебактерий

1. Методика определения токсигенных свойств

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (in vitro) лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит в плотных питательных средах в местах оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого коринебактериями дифтерии, диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. В тех участках агара, где токсин встречается с антитоксином, выпадает преципитат в виде белых линий, "стрел" или "усов".

Следует строго следить за плотностью среды, установлением pH, режимом стерилизации, прозрачностью, точным соблюдением целого ряда технических условий постановки пробы.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные и смесь колоний или со скошенного агарового косяка). Культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этих случаях преципитатов в агаровом челе опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном диаметром 10 см; питательную среду - агар на бульоне Мартена или сухую среду НИ питательных сред МЗ СССР (г. Махачкала) - ОТДМ; стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 1,5 х 8,0 см; нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота; противодифтерийную антитоксическую сыворотку или ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (однозональная сыворотка); контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии 24 - 48-часового роста (пересевается в условиях лаборатории каждые сутки, чтобы осуществлять пробу).

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность

При небольшом объеме работы питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). Питательный агар, разлитый во флаконы, требует многократного расплавления, а длительное термическое воздействие значительно ухудшает его качество. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90°, тотчас же вынимают из бани, остужают до 50° и добавляют 20% сыворотки крови лошади (1,5-процентный агар) или 30% сыворотки крови крупного рогатого скота (1,8-процентный агар). Так, к питательному агару, разлитому по 10 мл в пробирки, добавляют 2 мл сыворотки лошади или 3 мл сыворотки крупного рогатого скота, обжигают края пробирки и выливают (соблюдая правила асептики) в стерильную чашку Петри, равномерно распределяя по дну чашки осторожным покачиванием, не вспенивая среды. На середину поверхности застывшего агара обожженным пинцетом накладывают фильтровальную бумажку, предварительно смоченную антитоксической противодифтерийной сывороткой или ферментированным и очищенным специфической сорбцией дифтерийным антитоксином. Чашки подсушивают в термостате при 37° в течение 15 - 20 мин., повернув вверх дном чашку и крышку.

Чашки со средой для определения токсигенности без фильтровальной бумажки можно хранить в условиях холодильника одни сутки.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером 1,5 х 8,0 см, заворачивают по 2 - 4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 30 мин. Сохраняют пакетики с бумажными полосками в стерильной чашке Петри до 3 недель.

Смачивание фильтровальных бумажек производят в стерильной чашке Петри, для этого их переносят из пакетика обожженным пинцетом и смачивают 0,25 мл противодифтерийной антитоксической сыворотки или очищенным специфической сорбцией дифтерийным антитоксином, содержащим 500 МЕ в 1 мл. Чтобы не было излишков сыворотки на бумажке при переносе на агар обожженным пинцетом, ее слегка встряхивают или прикладывают к стерильной крышке чашки Петри.

Разведение противодифтерийной антитоксической сыворотки

Противодифтерийную антитоксическую сыворотку или ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин переливают из ампул в стерильную пробирку, соблюдая все правила обращения со стерильными препаратами. На пробирку наносят все данные этикетки с указанием срока хранения. Хранят сыворотку в условиях холодильника.

Сыворотки должны быть разведены стерильным физиологическим раствором до содержания 500 МЕ в мл. Коммерческий препарат - противодифтерийная антитоксическая сыворотка может содержать разное количество МЕ в ампуле (500 МЕ, 10000 МЕ, 20000 МЕ и др.) и в разных объемах.

Примеры разведения сыворотки

1. Ампула противодифтерийной антитоксической сыворотки содержит 1000 МЕ в объеме 4,8 мл (это указано на коробке, в которую вложены ампулы с сывороткой). В данном случае можно принять общий объем сыворотки за 5,0 мл. Следовательно, в 1,0 мл сыворотки содержится 1000 МЕ : 5 = 2000 МЕ. Чтобы получить 500 МЕ в мл, следует каждый мл развести в 4 раза, т.е. 1 мл сыворотки + 3 мл стерильного физиологического раствора. В зависимости от необходимости сыворотку можно развести в меньших объемах. Например: 0,1 мл сыворотки + 0,3 мл физиологического раствора; 0,2 мл сыворотки + 0,6 мл физиологического раствора; 0,3 мл сыворотки + 0,9 мл физиологического раствора и т.д.

2. Разведение сыворотки можно сделать другим способом. Если ампула содержит 5000 МЕ в 2,5 мл, следовательно, 500 МЕ содержится в 0,25 мл. К этому объему добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора и тогда 500 МЕ будет содержаться в 1,0 мл. Если ампула содержит 10000 МЕ (20000 МЕ) в 5 мл (10 мл), то 5000 МЕ будет содержаться в 2,5 мл как в первом, так и во втором случаях. Таким образом, из ампулы берут 0,25 мл сыворотки, добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора, в результате 1,0 мл сыворотки будет содержать 500 МЕ. На смачивание полоски из фильтровальной бумаги требуется 0,25 мл сыворотки (100 - 125 МЕ). Разведенную противодифтерийную антитоксическую сыворотку можно хранить в условиях холодильника до 7 дней.

Ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (однозональная сыворотка) разведения не требует, т.к. в каждом мл препарата содержится 450 МЕ - 500 МЕ.

Нормальные сыворотки животных

При приготовлении питательной среды для определения токсигенности используют нормальные сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Сыворотки непригодны при наличии мути, большого гемолиза (красного, бурого цвета), обозначения "для технических целей". Такие сыворотки можно использовать для приготовления скошенного сывороточного агара или транспортной среды. Рекомендуется осуществлять предварительный контроль всех вновь поступающих в лаборатории серий сыворотки лошади или крупного рогатого скота с токсигенным контрольным штаммом на проверенной среде на токсигенность и контроль на отсутствие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотках лошади в РПГА с коммерческим дифтерийным антигенным диагностикумом (см. Инструкцию к препарату).

Засев пробы

Культуру засевают в виде "бляшки" диаметром 0,7 - 0,8 см с расстояния 0,7 - 0,8 см между "бляшками" и на расстоянии 0,5 см от края полости фильтровальной бумаги.

При исследовании на токсигенность 1/2 колонии и смеси 2 - 6 колоний посев производят двумя "бляшками" по обе стороны фильтровальной бумаги. Половина колонии (отдельной изолированной или по половине от двух колоний) помещают на одной стороне чашки, а с другой - смеси колоний. На одну чашку следует помещать не более 10 "бляшек", при этом 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4 - контрольного штамма (см. схему).

Контролем служит токсигенный штамм 24 - 48-часового роста. Чашки с посевом помещают в термостат при 37°.

Учет результатов

Результат учитывают через 18 - 24 часа и 48 часов роста.

При использовании антитоксической противодифтерийной сыворотки следует учитывать, что появление преципитатов в агаровом геле у коринебактерий возможно не только за счет взаимодействия токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и за счет взаимодействия бактериальных антител с соответствующими антигенами микробной клетки (неспецифические преципитаты по токсину). Это зависит от того, что изготовляемые сыворотки не являются моновалентными препаратами, кроме ферментированного и очищенного специфической сорбцией дифтерийного антитоксина. Помимо антител к дифтерийному экзотоксину, в них содержатся в различных количественных соотношениях и антитела к бактериальному компоненту коринебактерий дифтерии.

Неспецифические преципитаты могут образовываться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Эти преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48 - 72 часа, но у некоторых штаммов - и на 1-е сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма с линиями контрольного (токсигенного штамма). В тех случаях, когда у контрольного штамма появляется несколько линий преципитации, специфическими следует считать наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся преципитаты. Наблюдаются следующие варианты в образовании преципитатов.

1. Испытуемые коринебактерии дифтерии, у которых образуются преципитаты, считаются токсигенными, если эти линии преципитации сливаются с соответствующими специфическими линиями токсигенного штамма или идут на смыкание с ними.

2. Испытуемые коринебактерии дифтерии считаются нетоксигенными:

а) если линии преципитации у испытуемой культуры отсутствуют при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;

б) если линии преципитации располагаются так, что концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма, а идут наперекрест с ним (неидентичны);

в) линии преципитации испытуемого штамма сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;

г) линии преципитации испытуемого штамма перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Иногда отмечается появление множественных неспецифических линий преципитации.

Хранение штаммов в условиях лаборатории

1. Штаммы, в том числе и контрольный, культивируют в условиях лаборатории на 10-процентном сывороточном агаре.

2. Хранить штаммы, в том числе и контрольный, можно:

а) на 10-процентном сывороточном агаре в условиях холодильника (пересев каждые 14 дней);

б) 0,1-процентном полужидком агаре, приготовленном на мартеновском бульоне (pH - 7,6) при комнатной температуре (пересев один раз в 2 - 3 месяца). Полужидкий агар разливают по 8 мл в пробирки - 0,5 мл или 1,0 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота.

Контрольный штамм получают в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, НИИВСах, НИИЭМах, в лабораториях городских и областных СЭС. Нельзя использовать производственный штамм PW-8 и его варианты. Контрольный штамм необходимо периодически засевать на кровяной агар (берут 1 пробирку с агаром для определения токсигенности + 10% крови).

2. Определение фермента цистиназы

Коринебактерии дифтерии и некоторые коринебактерии ульцеранс обладают ферментом - цистиназой, ложнодифтерийные бактерии и другие дифтероиды этого фермента не имеют.

В среду, разлитую в узкие пробирки столбиком не менее 3-х см (лучше 4 см), засевают культуру уколом. При росте коринебактерий дифтерии благодаря ферменту цистиназе расщепляют находящийся в среде цистин, а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксуснокислым свинцом, находящимся в среде, последний переходит в сернокислый свинец - соединение темно-коричневого цвета. Гипосульфит натрия, входящий в состав модифицированной среды, ускоряет образование и индикацию цистиназы. При посеве уколом коринебактерии дифтерии вызывают не только почернение среды по ходу посева (укола), но и образуют вокруг него облачко темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Результаты учитывают через 24 часа. Для получения предварительного ответа (через 3 часа) необходимо в среду внести много культуры (5 - 6 колоний). Рекомендуется одновременно ставить контроль среды - в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм.

3. Определение фермента уреазы

Ложнодифтерийные бактерии, коринебактерии ульцеранс и часть дифтероидов имеют фермент уреазу, который способен расщеплять мочевину с образованием аммиака и углекислоты. Коринебактерии дифтерии этим ферментом не обладают.

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе:

а) в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 2 - 3 мл, засевают чистую культуру коринебактерий дифтерии и ставят в термостат. Результаты учитывают через 18 - 24 часа;

б) для определения уреазы по методу Заксе ex tempore смешивают реактив А (1 часть) и реактив В (19 частей). Смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл и вносят испытуемые культуры в количестве нескольких петель. Нельзя брать конденсационную воду, т.к. она имеет щелочную реакцию и может изменить pH среды, а следовательно, и цвет индикатора. Пробирки помещают в термостат при 37° на 30 минут.

Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты, изменяет pH среды и происходит ее покраснение. При отсутствии фермента уреазы изменения цвета среды не происходит. Рекомендуется одновременно ставить контроль среды - в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный дифтерийный штамм.

4. Определение сахаролитических ферментов

Для определения сахаролитической активности коринебактерий дифтерии используют среды с углеводами (сахароза, глюкоза) и растворимый крахмал.

Культуру вносят в каждую пробирку со средой, обожженной на огне петлей. Результаты учитывают через 24 часа, а при отрицательном крахмальном признаке - через 48 часов пребывания посевов в термостате.

При сбраживании того или иного углевода, т.е. при кислотообразовании, наблюдается восстановление обесцвеченного фуксина, и среда приобретает малиновый цвет. Рекомендуется одновременно ставить пробы с контрольным дифтерийным токсигенным штаммом варианта гравис.

5. Восстановление нитратов в нитриты

Способность коринебактерий дифтерии восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим дифференцировать коринебактерии ульцеранс.

Если нитрат восстановлен в нитрит, то при добавлении соответствующего реактива к засеянному нитратному бульону появляется красное окрашивание. Этот метод рекомендуется для головных бактериологических лабораторий, где возможно собирать и регистрировать распространение штаммов коринебактерий ульцеранс.

6. Серологическая идентификация и определение серологического варианта

При серологическом изучении токсигенных коринебактерий дифтерии пользуются классификацией, утвержденной 30.12.1960 МЗ СССР. Согласно этой классификации коринебактерии дифтерии подразделяют на 7 основных (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) и 4 дополнительных (8, 9, 10, 11) серологических вариантов, обозначенных арабскими цифрами.

Агглютинирующие сыворотки выпускают неадсорбированные сухие к каждому серологическому варианту и к смеси серологических вариантов (поливариантная). Перед употреблением сухую сыворотку следует растворить в стерильной дистиллированной воде из расчета 1 мл на 1 ампулу. Сухая сыворотка должна растворяться при комнатной температуре в течение 2 - 3 минут. Титр растворенной сыворотки соответствует титру, указанному на этикетке.

В случае если растворенная сыворотка не может быть сразу использована, она должна быть перелита из ампулы в пробирку с ватной пробкой, с соблюдением всех правил обращения со стерильными препаратами. В таком виде сыворотка может сохраняться при температуре 6 +/- 2° в холодильнике до 2-х недель.

Поливариантная дифтерийная агглютинирующая сыворотка применяется для дифференциации коринебактерий дифтерии от других представителей рода коринебактерий в реакции агглютинации на стекле. Сыворотку разводят до рабочего разведения 1:10 3-процентным солевым раствором (см. рецепт приготовления).

Для реакции агглютинации на стекле используют суточную чистую культуру коринебактерий дифтерии, выросшую на 10-процентном сывороточном агаре. Сначала ставят контроль в капле 3-процентного солевого раствора, спонтанно агглютинирующиеся культуры дальше не изучают. Культуру тщательно растирают петлей на предметном стекле и постепенно смешивают с каплей сыворотки. В случае некоторой негомогенности культуры рекомендуется для постановки реакции агглютинации на стекле использовать густой смыв ее, профильтрованный через вату, накрученную на кончик пастеровской пипетки.

Положительная реакция характеризуется появлением агглютината (2 - 3 минуты). При оценке интенсивности агглютинации лучше пользоваться вогнутым зеркалом.

При необходимости определения серологического варианта можно проводить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с вариантными сыворотками в разведении 1:25 - 1:50. Окончательно серологический вариант определяют в линейной реакции агглютинации объемным или капельным методом.

При постановке линейной реакции агглютинации сыворотку последовательно двукратно разводят 3-процентным солевым раствором в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:100 и до титра, указанного на этикетке. В качестве антигена используют суточную культуру коринебактерий дифтерии, выращенную на 10-процентном сывороточном агаре. Взвесь культуры (1 млрд. микробных клеток в 1 мл в 3-процентном солевом растворе) набирают стерильной пипеткой через ватный фильтр (вата, накрученная на конце пипетки). При такой методике получают гомогенную взвесь культуры в 3-процентном солевом растворе. К разведенной сыворотке прибавляют по 0,5 мл бактериальной взвеси. Пробирки помещают в термостат при температуре 37° до следующего дня. Результат реакции учитывают невооруженным глазом по характеру выпавшего агглютината "зонтика" и степени просветления надосадочной жидкости без встряхивания. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, при которой плотный осадок "зонтиком" и полное просветление жидкости над ним. При отчетливом осадке "зонтиком" и слегка опалесцирующей жидкости реакцию оценивают на 3 плюса. Титром антител испытуемой сыворотки считают последнее разведение сыворотки, дающее агглютинацию на 3 плюса. Изучаемую культуру относят к тому серологическому варианту, с сывороткой которого отмечена положительная реакция в разведении не меньшем чем половина титра сыворотки, указанного на этикетке.

Контролями служат:

1. Наименьшее разведение сыворотки по 0,5 мл (2 пробирки), в которые не добавляют бактериальную взвесь.

2. 3-процентный солевой раствор без сыворотки по 0,5 мл (2 пробирки), в которые добавляют бактериальную взвесь (1 млрд. микробных клеток в мл) по 0,5 мл.

В контролях должна отсутствовать спонтанная агглютинация. В пробирках с бактериальной взвесью осадок должен быть в виде "бляшки" с ровными краями без просветления надосадочной жидкости.

Для установления серологического варианта изучаемой культуры реакцию агглютинации следует ставить сначала с сыворотками основных серологических вариантов, а затем при отрицательных результатах - с сыворотками дополнительных серологических вариантов.

Сухие агглютинирующие сыворотки можно хранить при комнатной температуре.

7. Методика индикации дифтерийного токсина (в реакции нейтрализации антител (РНАт))

В целях раннего выявления дифтерийного токсина - для получения предварительного ответа - ставят реакцию нейтрализации антител.

РНАт основана на феномене пассивной гемагглютинации. Для ее постановки нужны все те же ингредиенты, которыми пользуются при обнаружении антител в сыворотке крови (см. "Инструкцию" к коммерческим эритроцитарным дифтерийным диагностикумам для РПГА).

РНАт в отличие от РПГА 3-компонентна. В ней исследуют ряд двукратных разведений токсина (или анатоксина) - возбудителя дифтерии, взаимодействующих с двумя гемагглютинирующими единицами (ГЕ) стандартных противодифтерийной антитоксической сыворотки.

В результате соединения токсина с антисывороткой образуются серологически инертные комплексы (АГ + АТ), не склеивающие эритроциты дифтерийного антигенного эритроцитарного диагностикума (ДАгЭД). По мере уменьшения содержания токсина в ряду разведений от большего к меньшему перестают образовываться комплексы (АГ + АТ) и оставшиеся свободными антитела агглютинируют ДАгЭД.

Если в РПГА в низких разведениях испытуемых или стандартной сывороток наблюдается агглютинация эритроцитов с постепенным уменьшением ее интенсивности - от "+" к "-", в РНАт положительный результат заключается в предотвращении агглютинации, т.е. от "-" к "+". В РПГА чем выше титр сыворотки, тем длиннее ряд агглютинации (плюс эффект), в РНАт чем больше токсина в испытуемом материале, тем длиннее ряд без агглютинации (минус эффект).

Объекты исследования в РНАт:

1. Чистые или смешанные культуры на дифференциально-диагностических средах (колонии на чашке первичного посева или сывороточно-агаровом косяке).

2. Материал на тампонах из зева и носа в транспортной среде (лучше бульоне).

3. Экстракты органов (постмортальные исследования).

4. Токсин (анатоксин) возбудителя дифтерии при изучении интенсивности токсинообразования у коринебактерий дифтерии в лабораторных условиях, в контроле динамики токсинообразования в производстве.

Если имеется материал из зева и носа на тампонах, засеянный в транспортную среду (лучше в жидкий рыбный бульон), то через 20 - 24 часа подращивания в термостате при 37° после засева материала на плотную питательную среду (см. методику посева материала из транспортной среды) можно также поставить РНАт для выдачи предварительного ответа по токсину. В случае засева материала из зева и носа сразу на плотные питательные среды при бактериологическом исследовании постановку РНАт можно осуществить через 24 часа при наличии роста подозрительных колоний на чашках первичного посева или с агарового косяка, если предварительно исследуемая культура была посеяна на косяк (т.е. РНАт ставят одновременно с пробой на токсигенность в плотной питательной среде). В последнем случае исследуемый материал (1 - 3 колонии с плотной питательной среды с чашек Петри первичного посева или одна петля с косяка) засевают в пробирки с рыбным бульоном (см. пропись транспортной среды) и инкубируют в термостате при 37° 24 часа (если позволяют условия, то достаточно подращивания 6 часов). Из пробирок с жидкой средой берут часть материала (приблизительно 0,5 мл), добавляют 0,05 мл (1 каплю) цельного формалина, встряхивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Оставшийся материал продолжают инкубировать при 37° в течение 24 часов для повторного испытания в РНАт, чтобы повысить эффективность обнаружения токсина коринебактерий дифтерии.

Непосредственно перед постановкой РНАт (или накануне) в РПГА определяют активность эритроцитарного диагностикума (ДАгЭД) со стандартной противодифтерийной антитоксической сывороткой (СПС). Методика постановки и учета РПГА описаны в "Инструкциях", приложенных к коммерческим ДАгЭД. Предельное разведение СПС, в котором еще регистрируется полноценная гемагглютинация, называют 1 гемагглютинирующей единицей (1 ГЕ) антител, 2 ГЕ - это разведение, предшествующее 1 ГЕ. Например, предельное разведение СПС (титрование начато с 1 МЕ в мл, двукратное), в котором регистрируется полноценная гемагглютинация с коммерческим ДАгЭД, равно титру 1:512, тогда 2 ГЕ будут содержаться, если СПС (1 МЕ в мл) развести 1:256. Это будет рабочее разведение СПС.

На все контроли потребуется приблизительно 0,5 мл рабочего разведения СПС, на каждый испытуемый ряд (пробу) - 0,2 мл (микрометод). Таким образом, для изучения одной пробы потребуется 0,7 мл рабочего раствора СПС, а для изучения, например, 10 проб - 2,5 мл СПС.

Следовательно, чтобы приготовить рабочий раствор СПС, содержащий 2 ГЕ (т.е. разведение 1:256) в объеме не менее 2,5 мл для 10 проб, необходимо взять СПС, содержащую 1 МЕ в мл, большой петлей микротитратора (0,05 мл) и внести в 12,75 мл раствора для постановки РПГА (1-процентная нормальная кроличья сыворотка). Оставшаяся после постановки РНАт разведенная (1:256) сыворотка (СПС) не хранится.

Техника постановки РНАт

При макрометоде используют полистироловые пластины или пробирки, мерные стеклянные пипетки или шприцы-дозаторы. При микрометоде пользуются полистироловыми пластинами Такачи или отечественными (Москва, Ленинград) с лунками (8 х 12) объемом 0,2 мл, капельницами с дозированным объемом (0,025 мл и 0,05 мл), пластиковыми разовыми или стеклянными (Такачи) с насадкой, а также термостойкими петлями для титрования (Такачи).

В лунки полистироловой пластинки или пробирки наливают по 0,2 мл раствора для реакции (макрометод) или 0,025 мл раствора (микрометод). В первую лунку добавляют 0,2 мл (0,025 мл) испытуемого источника дифтерийного антигена (токсина, анатоксина). Пипеткой или шприцом-дозатором (макрометод) или петлей от микротитратора Такачи (0,025 мл) осуществляют взятие и перенос из каждой лунки в последующую по 0,2 мл (0,025 мл) смеси антигена с раствором. Таким образом, получается ряд двукратных разведений с объемом каждого по 0,2 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод).

Предварительно установленная активность стандартной сыворотки с данной серией дифтерийного диагностикума служит основанием для выбора рабочей дозы. Она равна 2 ГЕ в объеме 0,2 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод), которую приливают в каждую лунку с раститрованным источником испытуемого антигена. Так же титруют контрольный токсигенный штамм и добавляют в каждую лунку 2 ГЕ стандартной сыворотки. Смеси инкубируют при 37° 30 мин., затем в каждую лунку добавляют ДАгЭД по 0,05 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод), учет результатов производят по тем же критериям и в те же сроки, что и для РПГА.

Обязательные контроли РНАт

Контроли с положительным результатом

1. На отсутствие спонтанной агглютинации опытного и контрольного диагностикумов в растворе для реакции (см. "Инструкцию" по применению коммерческих диагностикумов дифтерийных эритроцитарных для РПГА).

2. На отсутствие гетерогемагглютининов к бараньим эритроцитам в исследуемом материале. Может быть поставлен как с контрольными эритроцитами, так и с опытными.

3. На отсутствие гетерогемагглютининов к бараньим эритроцитам и спонтанной агглютинации опытного диагностикума в жидкой среде подращивания без любого материала.

Контроли с положительным результатом

1. На подтверждение количества 2 гемагглютинирующих единиц антител в рабочем разведении стандартом сыворотки, примененной в РНАт. Этот же контроль служит подтверждением специфической активности опытного диагностикума (ДАгЭД) относительно стандартной сыворотки.

Рабочий раствор стандартной сыворотки, где определено 2 ГЕ, титруется в 3 - 4 пробирках или лунках: 0,4 мл; 0,3 мл; 0,2 мл; 0,1 мл (макрометод).

Последние три лунки доводят до равного объема с первой (0,4 мл) раствором для реакции, т.е. в 4-ую лунку добавляют 0,3 мл раствора, в 3-ю - 0,2 мл, во 2-ю - 0,1 мл. В каждую из лунок прибавляют 0,05 мл 3-процентной концентрации ДАгЭД.

При микрометоде только в первую и вторую лунки помещают по 0,025 мл рабочего раствора стандартной сыворотки, во вторую, третью и четвертую лунки вносят по 0,025 мл раствора для реакции: из 2-й лунки в 3-ю термостойкой петлей переносят по 0,025 мл, так же из 3-й лунки в 4-ую. Из 4-й лунки 0,025 мл выливают. Во все 4 лунки закапывают по 0,025 мл 0,3-процентной концентрации ДАгЭД.

При таком контролировании в первой лунке положительная реакция учитывается для 2-х ГЕ, во второй - для 1 ГЕ, а в 3-ей - для 0,5 ГЕ РНАт может быть учтена, если в рабочем растворе стандартной сыворотки подтверждено присутствие 2 ГЕ антител, т.е. гемагглютинация должна регистрироваться в 1-й и во 2-й пробирках (лунках).

2. Контрольный токсигенный штамм подращивают в жидкой среде (лучше 20 - 24 часа). Его токсин должен нейтрализовать 2 ГЕ антител СПС в разведении не менее 1:8. В противном случае следует определить причины низкой активности токсинообразования у контрольного токсигенного штамма (качество среды подращивания, срок культивирования, соблюдение температурного режима, качество ингредиентов реакции и соблюдения условий ее подстановки).

Интерпретация результатов применения РНАт для выявления дифтерийного токсина

В случае выявления дифтерийного токсина, когда РНАт в испытуемом материале имеет минус эффект даже в разведении 1:2 - 1:4 (при всех отрицательных контролях) выдается предварительный ответ о нахождении токсина возбудителя дифтерии, окончательный ответ выдают, когда выделен возбудитель дифтерии и определены его токсигенные свойства при бактериологическом исследовании. При невыявлении дифтерийного токсина в РНАт предварительный и окончательные ответы выдают по общепринятой методике (см. методику бактериологического исследования на дифтерию).

Питательные среды

Качество питательной среды является важнейшим условием при любом бактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальной всхожести и высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала, необходимо создать оптимальные условия для роста и размножения этих бактерий, сохранение их биологических свойств и условий для ингибиции сопутствующей флоры.

В настоящее время в качестве основы для питательных сред используют сухие коммерческие питательные агары. Лучшим для высеваемости коринебактерий дифтерии является сухой питательный агар "Д" (дрожжевой), несколько хуже - сухой питательный агар "КД" (кормовые дрожжи), можно использовать сухие питательные агары, предназначенные для выращивания других микроорганизмов, например, эритритагар. Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь, теллурит калия по прописи приготовления кровяных теллуритовых сред, которые являются элективными, дифференциально-диагностическими средами для выделения коринебактерий дифтерии, так как содержат до 10 - 15% крови и теллурит калия - лучший ингибитор роста другой микрофлоры. Если при контроле на всхожесть титрованным количеством коринебактерий дифтерии среды не будут удовлетворять требованиям контроля, то питательные агаровые основы нужно готовить на бульонах (коммерческий сухой рыбный бульон; перевар Хоттингера, 1-процентная пептонная вода, приготовляемые в лабораториях с содержанием аминного азота 150 - 180 мг %). До 1985 года отечественной промышленностью изготавливался для нужд лечебной медицины аминопептид, представлявший собой ферментативный гидролизат крови животных и содержавший полноценный набор аминокислот и простейших пептидов. Аминопептид выпускался в стерильном виде в стеклянных флаконах по 450 мл. Препарат изготавливался в соответствии с требованиями фармакопейной статьи (ФС 42-630-72), что обеспечивало его высокую стандартность. Целесообразно использовать такой аминопептид (с истекшим сроком годности), а также "Аминопептид для микробиологических питательных сред", выпуск которого планируется на 1986 год, для приготовления кровяных теллуритовых сред. Прописи приготовления питательной основы на аминопептиде для кровяной теллуритовой среды, для среды Клауберг П и прописи приготовления этих сред приведены в данной Инструкции.

Промышленность выпускает сухую Хинозольную дифференциально-диагностическую среду Бучина для выделения коринебактерий дифтерии, которая готовится по прописи на этикетке с добавлением 5% крови.

При бактериологическом исследовании материалов на дифтерию наибольшей диагностической эффективностью при выявлении возбудителя дифтерии обладают кровяно-теллуритовые среды: Клауберг П и кровяно-теллуритовый агар. Эти среды следует использовать при обследовании всех категорий населения и особенно при массовых обследованиях по эпидпоказаниям. Среда Бучина уступает кровяно-теллуритовым средам в ингибирующей активности, кроме того, сроки формирования колоний коринебактерий дифтерии на разных сериях сред могут запаздывать на сутки в сравнении с кровяно-теллуритовыми средами.

Промышленность выпускает сухую среду для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии (ОТДМ), кроме этой среды в данной Инструкции приводится пропись приготовления мартеновского агара для определения токсигенных свойств и фермента цистиназы, а также модифицированная среда для определения фермента цистиназы на сухом питательном агаре (лучше агаре "Д"), прописи приготовления сред для определения сахаролитических свойств.

В качестве среды для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии пользуются сывороточной агаровой средой. Применение свернутой сыворотки нецелесообразно.

Методы приготовления питательных сред

Транспортная среда

В качестве питательной основы используют 0,1-процентный агар на переваре Хоттингера или 0,1-процентный агар на рыбном бульоне (из сухого коммерческого препарата). Можно использовать сухие питательные коммерческие агары. В последнем случае варят среду из расчета 0,2 или 0,3 г сухого питательного агара (в зависимости от прописи на этикетке) на 100 мл перевара Хоттингера или рыбного бульона. Содержание аминного азота - 150 - 180 мг % и pH - 7,6.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: