Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методические указания. МУК 4.2.2008-05
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
17 октября 2005 года
Дата введения -
с момента утверждения
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян - руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзор России (Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация "Биозащита" (И.В. Панкин).
2. Рекомендован к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Законом Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей", Постановления Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", Постановления Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации", Постановления Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.
1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в том числе в продовольственном сырье.
2. Общие положения
Методические указания содержат описание метода определения ГМО
растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора
реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного
происхождения с применением ферментного анализа на биологическом
микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с
использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной
цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизацией
продуктов этой амПЦР с применением ферментного анализа на
биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие
или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных
рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S,
nos и ocs) и двух селективных (gus, nptII). Идентификация этих
последовательностей позволяет проводить предварительную проверку
пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения.
-12
Чувствительность метода - не менее 10 г (1пг) ДНК.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты.
3.1.1. Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с ТУ 9642-001-4648062-98.
3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.
3.1.3. Компьютерная программа "Аrrа" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001".
3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).
3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С ТУ 42-61961.
3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5.
3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая температуру минус 20 °С.
3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.
3.1.10. Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой
-1
вращения не менее 13000 мин.
3.1.11. Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость
-1
вращения 250 - 3000 мин. .
3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72.
3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5% - 10,0%, воспроизводимость 3% - 7%); 0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм, точность +/- 2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0 - 200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5% - 2,0%, воспроизводимость 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 - 10000 куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%).
3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84 или других видов.
Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы.
3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.
3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 куб. см, ГОСТ 12738-77.
3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.
3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 куб. см.
3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.
3.3. Реактивы и реагенты.
3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).
3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ 6-09-11-1721-83.
3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.
3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.
3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.
3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.
Примечание: Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
3.3.9. Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций.
3.3.10. Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г, лизирующий реагент - 60 куб. см (2 флакона), сорбент - 2 куб. см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 куб. см, экстракционный раствор - 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в 4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004 (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед., 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 куб. см, праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
- 35S_п 5' CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA (39 н.о.);
- 35S_o* 5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
- gus_ 5' АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33 н.о.);
- gus_o* 5' TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);
праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
- nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.);
- nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);
праймеры на маркерный ген nptII из транспазона Тn5 бактериального происхождения:
- npt_п 5' GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
- npt_o* 5' АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);
праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
- ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.);
- ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).
Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.
Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры, меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC - 50 куб. см; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1 пробирка.
Примечание: Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2 °С до +8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.
4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов
4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
В мерной колбе на 100 куб. см растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 куб. см дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года.
4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS.
Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года.
4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера.
Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным этиловым спиртом - до отметки 300 куб. см и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5 куб. см внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 °С в течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет 30 минут для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин. для зерна. Через каждые 10 - 15 минут гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).
6.2. К содержимому пробирки добавить 400 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °С 60 - 120 мин.
6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 куб. мм бидистиллированной воды и перемешать на вортексе.
6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
6.5. Добавить 20 куб. мм сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10 - 20 об./мин.).
6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
6.10. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
6.12. Подсушить осадок при 65 °С в течение 4 - 5 минут.
6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы.
6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 - 10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 °С.
6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин. при 5000 g.
6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.
Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции").
7. Амплификация
7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль".
7.2. Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.
7.3. Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.
7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 куб. мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 куб. мм раствора контрольной ДНК.
7.5. Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку).
7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.
Таблица 1
ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР
------------------+---------------+---------------+--------------- ¦ Шаг программы ¦Температура °С ¦ Время ¦ Количество ¦ ¦ ¦ ¦инкубации, сек.¦ циклов ¦ +-----------------+---------------+---------------+--------------+ ¦1. ¦94 ¦180 ¦1 ¦ +-----------------+---------------+---------------+--------------+ ¦2. ¦94 ¦30 ¦42 ¦ +-----------------+---------------+---------------+ ¦ ¦3. ¦62,5 ¦30 ¦ ¦ +-----------------+---------------+---------------+--------------+ ¦4. ¦72 ¦180 ¦1 ¦ ------------------+---------------+---------------+---------------
Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.
7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в случае его использования.
7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов.
8. Проведение ДНК гибридизации
8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC, 0,1% SDS; 0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора можно воспользоваться таблицей 2.
Таблица 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC
--------------------+-------------+----------------+-------------- ¦ Раствор ¦ 20хSSC ¦ 10%-ный SDS ¦ Н О дист. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦ +-------------------+-------------+----------------+-------------+ ¦2xSSC, 0,1% SDS ¦10 куб. см ¦1 куб. см ¦89 куб. см ¦ +-------------------+-------------+----------------+-------------+ ¦0,1хSSC ¦0,5 куб. см ¦- ¦99,5 куб. см ¦ +-------------------+-------------+----------------+-------------+ ¦0,1xSSC, 0,1% SDS ¦0,5 куб. см ¦1 куб. см ¦98,5 куб. см ¦ +-------------------+-------------+----------------+-------------+ ¦0,01хSSC ¦0,05 куб. см ¦- ¦99,95 куб. см¦ --------------------+-------------+----------------+--------------
8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 куб. мм 20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1 - 2 секунды. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 °С.
8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами:
- 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут;
- 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;
- 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте;
- 0,01хSSC в течение 10 секунд.
9. Проведение ферментного анализа
9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125 куб. мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб. мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм 1хSSC, а затем добавляют 0,75 куб. мм исходного конъюгата.
9.2. Нанести 25 - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре.
9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
9.4. Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.
9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 куб. см буфера 0,1хSSC, добавить 30 куб. мм 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.
9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата.
9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °С на 5 - 10 минут. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
10. Сканирование биологических микрочипов
10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом "ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе.
10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку.
10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.
10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение (Приложение 1 Б), присвоив файлу соответствующее имя.
10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
11. Анализ изображений биочипов
11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа "Аrrа".
11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы.
11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем - "Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.
11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять".
11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция "Настройки/Автоматическая подстройка".
11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты".
11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний (Приложение 2). Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем - "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".
12. Интерпретация результатов
12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Аrrа оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения.
12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1 H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
13. Организация рабочих мест
Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции".
Приложение 1
ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
А
--------------------------------------------------+--------------- ¦ 35S gus nos nрtII ocs ¦ М.П. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦K(-)¦ ¦K(-)¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ --------------------------------------------------+---------------
Б
--------------------------------------------------+--------------- ¦ 35S gus nos nрtII ocs ¦ М.П. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ОП ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ К- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ К+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ------ ------ ------ ------ ------ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ --------------------------------------------------+---------------
А - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного происхождения;
Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos.
Приложение 2
ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
Серия АБ N 0000000
N _________ от "__" __________ 200_ г.
Продукция ____________________________________________________
Производитель сырья или продукции ____________________________
Предъявитель сырья или продукции _____________________________
Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом
на соответствующую группу сырья или продукции ________________
Акт отбора проб и техническое задание на испытания N __ от ___
Испытания проведены на основании требований
Номер образца ________________________________________________
Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и
состояние упаковки, этикетки, штрих-кода)
в образцах N ____ отсутствует, а в образце N ____ присутствует
Маркировка: __________________________________________________
Годен до ________________ Штриховой код ______________________
Результаты испытаний
----------+------------------------------------------------------- ¦ Номер ¦ Трансгенные последовательности ¦ ¦ образца +------------+-----------+------------+--------+-------+ ¦ ¦ 35S ¦ gus ¦ nos ¦ nptII ¦ ocs ¦ +---------+------------+-----------+------------+--------+-------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ----------+------------+-----------+------------+--------+--------
Результаты анализа ___________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
Исполнители:
_____________________ _____________________
(подпись) (подпись)
_____________________ _____________________
(подпись) (подпись)
Руководитель испытательной лаборатории _______________________
(подпись)
М.П. _______________________
(Фамилия, инициалы)
Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.
НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей".
3. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
5. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".
6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 08.11.2000 N 14 "О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников".
7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМИ".
8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
9. ГОСТ 5904-82с "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб".
10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски". Технические условия".
11. ГОСТ 12292-2000 "Консервы рыбные с растительными гарнирами. Технические условия".
12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".
13. ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе".
14. ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб".
15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы отбора проб".
16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб".
18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
19. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб".
21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".
22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
23. ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические условия".
24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу".
25. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
26. ГОСТ 27853-88 "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор проб".
27. ГОСТ 28741-90 "Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы испытаний".
28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
29. ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках".
30. ГОСТ 15877-70 "Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия".
31. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические условия".
32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
33. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
34. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
35. ГОСТ Р 51926-2002 "Консервы. Икра овощная. Технические условия".
36. ГОСТ ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых продуктов".
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное