Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции. Методические указания. МУК 4.2.1902-04
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения
с момента утверждения
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян - руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, О.В. Анисимова); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н. Беляев, И.В. Брагина, Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова, Т.Ф. Авдеенко, С.Ю. Терехова, М.В. Зароченцев); Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Н.Н. Филатов, И.И. Пискарева, Н.Я. Салова, Е.В. Сизых); Московской медицинской академией им. Сеченова Минздрава России (Б.П. Суханов); Центром "Биоинженерия" РАН (К.Г. Скрябин, Д.Б. Дорохов, Б.Б. Кузнецов, Ю.Е. Асадова); МГУ прикладной биотехнологии Минобразования России (И.А. Рогов, Н.Г. Кроха, А.Ф. Валихов).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации и введены в действие 06.03.04.
3. Введены впервые.
1. Введение
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевой продукции.
1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов на наличие генетически модифицированных источников и применяются на этапах поставки на производство, гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого методического подхода для идентификации генетически модифицированных источников в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых и биологически активных добавках к пище.
2. Область применения
Методические указания содержат описание методов определения ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах, основанных на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на выявление регуляторных последовательностей: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens. Идентификация этих регуляторных последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевой продукции на наличие ГМИ, но не определяет примененную генетическую конструкцию или конкретную линию растения (трансформационное событие), а также не может применяться при проведении количественного анализа содержания ГМИ. Окончательная идентификация ГМИ, разрешенных для реализации населению и использования в пищевой промышленности в Российской Федерации, проводится с применением протоколов исследований для конкретных трансформационных событий, которые представляются разработчиком в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы. В Методических указаниях описаны методы идентификации генетических конструкций для наиболее часто встречаемых на мировом и внутреннем продовольственных рынках генетически модифицированных растений.
Методы, применяемые при отборе проб пищевых продуктов, выделения ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза, документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы организации рабочего места, являются обязательными к исполнению при проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.
С целью выявления наличия сои и кукурузы как традиционных, так и генно-модифицированных сортов в исследуемом пищевом продукте, а также проверки качества выделяемых из исследуемых образцов препаратов ДНК приведены методы идентификации последовательностей ДНК, специфичных для всех линий сои и кукурузы.
Все представленные методы являются качественными и состоят из следующих этапов: выделение ДНК из пищевого продукта, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты
Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью
нагрева/охлаждения активного элемента не менее
1,5 °C/с
Прибор для горизонтального электрофореза типа
"Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет
и гребенок
Источник напряжения типа "Power Рас 300"
с диапазоном регулируемого напряжения
50 - 300 В
ТМ
Видеосистема типа "Gel Doc 2000 ",
предназначенная для ввода в компьютер,
анализа и документирования изображений
люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных
бромистым этидием:
диапазон излучения 300 - 400 нм,
чувствительность - не менее 10 нг ДНК
(по бромистому этидию)
Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678
Камера морозильная, обеспечивающая температуру
минус 20 °C
Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф
-1
(частота вращения не менее 13000 мин. )
Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа
Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон
температур от 15 до 120 °C, количество гнезд -
не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры - 0,2 °C, разность температур
между соседними ячейками - не более 0,5 °C
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс",
-1
скорость вращения 250 - 3000 мин.
Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)
Весы лабораторные общего назначения
2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г ГОСТ 24104
Анализатор потенциометрический, погрешность
измерений рН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа
"Стомайкер" или других моделей
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 1,2%;
0,5 - 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
2 - 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
20 - 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью
+/- 0,6%;
100 - 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью
+/- 3%;
2 - 10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью
+/- 0,5%
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с техническими характеристиками не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76 Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 мл ГОСТ 12738-77 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 мл ГОСТ 1770-74 Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл Наконечники с фильтром для дозаторов с
переменным объемом дозирования до: 10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см
3.3. Реактивы
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77 Кислота борная, хч ГОСТ 9656-75 Натрия гидроокись, чда ГОСТ 4328-77 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч ТУ 6-09-11-1721-83 Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882 Трис (оксиметил) аминометан, хч ТУ 6-09-4292-76 Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287 Этидий бромистый, хч ТУ 6-09-13-452-75 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00 Спирт изопропиловый, хч ТУ 6-09-402-85 Масло вазелиновое медицинское ГОСТ 3164-78 Хлороформ, хч ГОСТ 20015-88 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Вода деионизированная ОСТ 11.029.003-80 2-меркаптоэтанол, хч ТУ 6-09-08-1024-81 Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 - 72 °C. Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 1806 Буфер для ПЦР с MgCl2. Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 2192 Агароза для электрофореза (тип П). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N А 6877 Маркер молекулярной массы ДНК. Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 1473 Стандартный образец состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0). Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 53198 Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5). Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386 Нуклеотиды: - 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788 - 2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913 - 2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038 - 2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656 Праймеры на промотор 35S, терминатор NOS, сою линии 40-3-2, кукурузу линий MON 810 и Bt-176, ген cry III (картофель), ген лектина (соя), ген зеина (кукуруза). ЗАО "Синтол" (Россия) http://www.syntol.ru
Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
4. Подготовка к анализу
4.1. Приготовление растворов
Приготовление 1М Трис - HCl (рН 7,5)
В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды, довести рН концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20 °C не более года.
Приготовление 5М NaCl
Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовление 30%-ной NaOH
Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды.
Приготовление 0,5М ЭДТА (рН 8,0)
В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121 °C 15 - 20 мин. или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.
Приготовление хлороформа, насыщенного водой
Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 6 мес.
Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта
Смешать 70 мл 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 2 мес.
Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл)
Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.
Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °C - не более 6 мес.
Приготовление лизирующего буфера (2%-ного "СТАВ")
Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавить 2,5 мл 1М Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 6 мес., допустимо образование осадка.
Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °C до полного растворения осадка.
Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см лизирующего буфера и перемешивают.
При проведении электрофореза использовать один из нижеперечисленных буферов.
Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза
В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Срок хранения 1x раствора - 10 дней, обычно готовят 10x и перед употреблением разбавляют до 1x, используют максимум три раза.
Приготовление 1x ТАЕ буфера для электрофореза
В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованной водой до метки. Полученный 50x раствор перед употреблением развести в 50 раз. Использовать для проведения электрофореза не более двух раз.
Приготовление раствора бромистого этидия - C21H20N3Br (10 мг/мл)
Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды. Срок хранения в посуде темного стекла - обязательно при температуре от 4 до 5 °C - не более 12 мес.
Приготовление 2%-ного агарозного геля, см. п. 8
Допускается хранение готового геля в 1х буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5 °C - не более 2 сут.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312.1-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид)
Подготовка пробы (раствора ДНК)
Навеску исследуемого продукта массой 70 - 80 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Добавить 200 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, тщательно растереть пробу в пробирке пестиком.
Добавить еще 600 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
Инкубировать при 65 °C 40 - 60 мин., перемешать на аппарате для встряхивания, центрифугировать 7 мин. на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13000 об./мин.
Перенести супернатант в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Добавить 400 мкл хлороформа, предварительно насыщенного водой.
Перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до образования суспензии.
Центрифугировать 7 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом повторить.
Центрифугировать 7 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа.
Добавить 600 мкл изопропилового спирта, взятого из морозильной камеры (минус 20 °C), перемешать.
Поместить пробирку в морозильную камеру (минус 20 °C) на 30 мин., не менее. В морозильной камере можно оставить на ночь.
Центрифугировать 6 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Тщательно удалить верхний слой.
Осадок промыть 200 мкл 70%-ного этилового спирта (2 - 3 раза), каждый раз перемешивая на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугировать 6 мин. при частоте вращения 12000 об./мин. (суспендированный в 70%-ном этаноле образец можно оставить на ночь в морозильной камере при минус 20 °C).
Последний раз тщательно до последней капли удалить спирт.
Подсушить осадок 5 мин. при 65 °C для удаления капель спирта.
Растворить осадок в 50 - 100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая.
Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при минус 20 °C (допустимо неполное растворение осадка).
7. Амплификация
Общие требования к постановке идентификационной ПЦР.
При проведении идентификации ГМИ обязательно готовят следующие пробы:
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к специфичному для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к специфичному для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к специфичному для вида пищевого зерна гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- безматричные контроли ПЦР для всех праймерных систем, участвующих в анализе.
7.1. Метод идентификации промотора 35S [1]
Праймеры для идентификации промотора 35S:
1 - GCT CCT ACA AAT GCC ATC A
2 - GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 1.
Таблица 1
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+------------------------+-----------------+------------------ ¦ N ¦ Реактивы ¦Объем реакционной¦Объем реакционной¦ ¦п/п¦ ¦ смеси 25 мкл ¦ смеси 50 мкл ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦169 мкл ¦338 мкл ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной ¦29 мкл ¦58 мкл ¦ ¦ ¦цепной реакции с MgCl2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦(10x) ¦ ¦ ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦3 ¦Раствор БСА (20 ¦29 мкл ¦58 мкл ¦ ¦ ¦мкг/мл) ¦ ¦ ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦4 ¦Смесь нуклеотидов ¦14 мкл ¦28 мкл ¦ ¦ ¦(4 млМ) ¦ ¦ ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦5 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦7 мкл ¦14 мкл ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦6 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦7 мкл ¦14 мкл ¦ +---+------------------------+-----------------+-----------------+ ¦7 ¦Taq-полимераза ¦1,5 мкл ¦3,0 мкл ¦ ¦ ¦(5 ед./мкл) ¦ ¦ ¦ ----+------------------------+-----------------+------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 2.
Таблица 2
-------------------------+---------------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +--------------------------+------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ Trio ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4 ¦ ¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./94 °C ¦3 мин./94 °C¦
+------------------------+--------------------------+------------+ ¦Амплификация ¦20 с/94 °C ¦30 с/95 °C ¦ ¦ ¦40 с/54 °C ¦40 с/54 °C ¦ ¦ ¦60 с/72 °C ¦40 с/72 °C ¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Количество циклов ¦40 ¦40 ¦ ¦амплификации ¦ ¦ ¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦3 мин./72 °C¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Фаза остывания ¦1 мин./4 °C ¦1 мин./4 °C ¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Скорость нагрева ¦0,77 °C/с ¦1 °C/с ¦ +------------------------+--------------------------+------------+ ¦Скорость остывания ¦3,15 °C/с ¦1 °C/с ¦ -------------------------+--------------------------+-------------
------------------------------------
<*> В табл. 2 указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, Прилож. 1.
7.2. Метод идентификации терминатора NOS [1]
Праймеры для идентификации терминатора NOS:
1 - GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG
2 - TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 3.
Таблица 3
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦169 мкл ¦338 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦29 мкл ¦58 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Раствор БСА (20 мкг/мл) ¦29 мкл ¦58 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦14 мкл ¦28 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦7 мкл ¦14 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦7 мкл ¦14 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦7 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,5 мкл ¦3,0 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 4.
Таблица 4
--------------------------+--------------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +------------------------+-------------+ ¦ ¦Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ Trio ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4 ¦ ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./94 °C ¦3 мин./94 °C ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Амплификация ¦20 с/94 °C ¦30 с/95 °C ¦ ¦ ¦40 с/54 °C ¦40 с/54 °C ¦ ¦ ¦60 с/72 °C ¦40 с/72 °C ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Количество циклов ¦40 ¦40 ¦ ¦амплификации ¦ ¦ ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦3 мин./72 °C ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Фаза остывания ¦1 мин./4 °C ¦1 мин./4 °C ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Скорость нагрева ¦0,77 °C/с ¦1 °C/с ¦ +-------------------------+------------------------+-------------+ ¦Скорость остывания ¦3,15 °C/с ¦1 °C/с ¦ --------------------------+------------------------+--------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 180 пар нуклеотидов, Прилож. 2.
7.3. Метод идентификации сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату [2]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд. Оба раунда проводятся в течение одного рабочего дня.
Внешние праймеры:
1 - CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG
2 - CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 5.
Таблица 5
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦188,7 мкл ¦377,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 6.
Таблица 6
--------------------------------+--------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +--------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМ-ПЛИ-4, Trio ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Амплификация ¦30 с/95 °C ¦ ¦ ¦30 с/60 °C ¦ ¦ ¦40 с/72 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦25 ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ --------------------------------+---------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA
4 - TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 7.
Таблица 7
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦193,7 мкл ¦387,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 8.
Таблица 8
----------------------------------+------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Амплификация ¦30 с/95 °C ¦ ¦ ¦30 с/60 °C ¦ ¦ ¦40 с/72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦35 ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ ----------------------------------+-------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 169 пар нуклеотидов, Прилож. 3.
7.4. Метод идентификации кукурузы линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку [3]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C
2 - TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 9.
Таблица 9
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦188,7 мкл ¦377,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 10.
Таблица 10
---------------------------------+-------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +-------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +--------------------------------+-------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +--------------------------------+-------------------------------+ ¦Амплификация ¦45 с/95 °C ¦ ¦ ¦50 с/60 °C ¦ ¦ ¦50 с/72 °C ¦ +--------------------------------+-------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦35 ¦ +--------------------------------+-------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +--------------------------------+-------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ ---------------------------------+--------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCTC
4 - GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 11.
Таблица 11
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦193,7 мкл ¦387,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 12.
Таблица 12
-------------------------------+---------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +---------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +------------------------------+---------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +------------------------------+---------------------------------+ ¦Амплификация ¦45 с/95 °C ¦ ¦ ¦50 с/60 °C ¦ ¦ ¦50 с/72 °C ¦ +------------------------------+---------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации¦40 ¦ +------------------------------+---------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +------------------------------+---------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ -------------------------------+----------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, Прилож. 4.
7.5. Метод идентификации кукурузы линии Bt-176, устойчивой к стеблевому мотыльку [4]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - CGG CCC CGA GTT CAC CTT
2 - CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 13.
Таблица 13
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦188,7 мкл ¦377,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 14.
Таблица 14
--------------------------------+--------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +--------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Амплификация ¦40 с/95 °C ¦ ¦ ¦40 с/60 °C ¦ ¦ ¦40 с/72 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦25 ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +-------------------------------+--------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ --------------------------------+---------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - CCG CAC CCT GAG CAG CAC
4 - GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 15.
Таблица 15
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦193,7 мкл ¦387,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦25 мкл ¦50 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Смесь нуклеотидов (4 млМ) ¦12,5 мкл ¦25 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦6,25 мкл ¦12,5 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,3 мкл ¦2,5 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использования амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 16.
Таблица 16
----------------------------------+------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Денатурация ¦3 мин./95 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Амплификация ¦40 с/95 °C ¦ ¦ ¦40 с/60 °C ¦ ¦ ¦40 с/72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦35 ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ ----------------------------------+-------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 189 пар нуклеотидов, Прилож. 5.
7.6. Идентификация картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (ген cry III A) [5]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
2 - ATG CAC TCA CGT AGT CCT CC.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 17.
Таблица 17
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦161,3 мкл ¦322,6 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦33 мкл ¦66 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Раствор БСА (20 мкг/мл) ¦33 мкл ¦66 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Смесь нуклеотидов (10 млМ) ¦6,2 мкл ¦12,4 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦2,5 мкл ¦5,0 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦2,5 мкл ¦5,0 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦7 ¦Taq-полимераза (5 ед./мкл) ¦1,5 мкл ¦3,0 мкл ¦ ----+----------------------------------+------------+-------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 18.
Таблица 18
----------------------------------+------------------------------- ¦ Стадия ¦ Тип амплификатора <*> ¦ ¦ +------------------------------+ ¦ ¦ Gene Amp 2700; Био-Рад; ¦ ¦ ¦ Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Денатурация ¦2 мин./98 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Амплификация ¦30 с/95 °C ¦ ¦ ¦30 с/60 °C ¦ ¦ ¦40 с/72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Количество циклов амплификации ¦20 ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Конечное удлинение ¦3 мин./72 °C ¦ +---------------------------------+------------------------------+ ¦Фаза остывания ¦4 °C ¦ ----------------------------------+-------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
3 - TTG TAT AGA AGC TCA CGA GG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 19.
Таблица 19
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----+----------------------------------+------------+------------- ¦ N ¦ Реактивы ¦ Объем ¦ Объем ¦ ¦п/п¦ ¦реакционной ¦реакционной ¦ ¦ ¦ ¦смеси 25 мкл¦смеси 50 мкл¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦1 ¦Деионизированная вода ¦164,8 мкл ¦329,6 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦2 ¦Буфер для полимеразной цепной ¦33 мкл ¦66 мкл ¦ ¦ ¦реакции с MgCl2 (10x) ¦ ¦ ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦3 ¦Раствор БСА (20 мкг/мл) ¦33 мкл ¦66 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦4 ¦Смесь нуклеотидов (10 млМ) ¦6,2 мкл ¦12,4 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦5 ¦Праймер 1 (20 мкМ) ¦2,5 мкл ¦5,0 мкл ¦ +---+----------------------------------+------------+------------+ ¦6 ¦Праймер 2 (20 мкМ) ¦2,5 мкл ¦5,0 мкл ¦
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное