- Законы
- Кодексы
- Форум
Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. Методические указания. МУК 2.3.2.970-00
¦ ¦результате отделения воды и жира, ¦ ¦ ¦сокращения объема изделий ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Критическая концентра- ¦определяет уровень введения в продукт ¦ ¦ция гелеобразования ¦белковых препаратов, обеспечивающий ¦ ¦ ¦требуемый комплекс структурно - механи- ¦ ¦ ¦ческих характеристик готового продукта ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Эмульсионная ¦определяет уровень введения в продукт ¦ ¦стабильность ¦белковых препаратов, обеспечивающий ¦ ¦ ¦получение устойчивых жировых эмульсий, ¦ ¦ ¦препятствующий отделению жира в процессе¦ ¦ ¦технологической обработки ¦ ------------------------+-----------------------------------------
В настоящее время отсутствуют стандартизованные методы определения функциональных свойств и результаты измерений должны носить сравнительный характер по отношению к препаратам или коммерческим продуктам, произведенным из немодифицированного пищевого сырья.
Основные методы определения функциональных свойств препаратов приведены в следующей таблице.
---------------------------+------------------------+------------- ¦ Показатель ¦ Метод определения ¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ источник ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Идентификация состава ¦Гистологический метод ¦51 ¦ ¦продуктов ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Растворимость ¦Спектрофотометрия ¦50 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Водоудерживающая ¦Метод центрифугирования ¦46 ¦ ¦способность ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Эмульсионная стабильность ¦Метод центрифугирования ¦47 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Критическая концентрация ¦Метод термотропного ¦48 ¦ ¦гелеобразования ¦гелеобразования ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Жироудерживающая способ- ¦Метод центрифугирования ¦49 ¦ ¦ность ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Конформационная ¦Микрокалориметрия ¦38 - 40 ¦ ¦стабильность ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Идентификация аминокислот-¦Метод ионопарной ВЖХ ¦45 ¦ ¦ных остатков ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Термодинамические свойства¦Метод дифференциальной ¦39 ¦ ¦ ¦сканирующей микрокало- ¦ ¦ ¦ ¦риметрии ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Интегральная гидрофобность¦Микрокалориметрия ¦40, 41, 42, ¦ ¦ ¦ ¦43, 44 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Реологические свойства ¦Вискозиметрия ¦52 ¦ ¦водных дисперсий ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Аминокислотный состав ¦ВЖХ ¦45 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Органолептические свойства¦Квалиметрия ¦53 ¦ ¦жиров: цвет, запах, ¦ ¦ ¦ ¦прозрачность ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Показатель преломления ¦Рефрактометрия ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Плотность жиров ¦Денситометрия, ¦53 ¦ ¦ ¦гравиметрия ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Вязкость жиров ¦Вискозиметрия ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Жирно - кислотный состав ¦ГЖХ ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Йодное число ¦Волюмометрия ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Кислотное число ¦Волюмометрия ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Число омыления ¦Волюмометрия ¦53 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Температура клейстеризации¦Вискозиметрия ¦54 ¦ ¦крахмала ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Размер крахмальных зерен ¦Оптическая микроскопия ¦54 ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Водоудерживающая ¦Гравиметрия ¦54 ¦ ¦способность крахмала ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Реологические свойства ¦Вискозиметрия ¦54 ¦ ¦водных дисперсий крахмала ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Набухание крахмальных ¦Оптическая микроскопия ¦54 ¦ ¦зерен ¦ ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Критическая концентрация ¦Метод термотропного ¦54 ¦ ¦гелеобразования крахмала ¦гелеобразования ¦ ¦ +--------------------------+------------------------+------------+ ¦Содержание амилозы и ¦Спектрофотометрия ¦54 ¦ ¦амилопектина ¦ ¦ ¦ ---------------------------+------------------------+-------------
7. Медико - биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников
7.1. Санитарно - химические показатели
Необходимость проведения тех или иных санитарно - химических исследований для каждого вида пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, определяется экспертом на основании требований, изложенных в "Гигиенических требованиях к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96, Москва, 1997, и с учетом химического состава исходной аналогичной продукции, полученной традиционным способом без использования генной инженерии [1, 2].
7.1.1. Показатели безопасности
-----------------+-------------------+--------------+------------- ¦ Показатель ¦ Метод определения ¦ Предел ¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ обнаружения ¦ источник ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Цинк, медь, ¦Атомно - ¦1 мкг/кг ¦3 ¦ ¦свинец, кадмий, ¦абсорбционный ¦ ¦ ¦ ¦олово, железо ¦ ¦ ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Ртуть ¦Колориметрический ¦10 мкг/кг ¦4 ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Мышьяк ¦Колориметрический ¦100 мкг/кг ¦5 ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Пестициды ¦Газожидкостная ¦1 мкг/кг ¦6 ¦ ¦ ¦хроматография ¦ ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Углеводороды ¦Оптические и хрома-¦100 мкг/кг ¦7 ¦ ¦ ¦тографические мето-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ды (ГЖХ, ВЭЖХ, ХМС)¦ ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Патулин ¦Хроматографический ¦10 мкг/кг ¦8 ¦ ¦ ¦(ТСХ) ¦ ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Афлатоксин М 1 ¦Хроматографические ¦0,3 мкг/кг ¦9 ¦ ¦ ¦ТСХ, ВЭЖХ ¦0,02 мкг/кг ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Афлатоксин В 1 ¦Хроматографические ¦1 мкг/кг ¦9 ¦ ¦ ¦ТСХ, ВЭЖХ ¦0,15 мкг/кг ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Зеараленон ¦Хроматографический ¦100 мкг/кг ¦10 ¦ ¦ ¦ТСХ, ВЭЖХ ¦5 мкг/кг ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Дезоксиниваленол¦Хроматографический ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ТСХ ¦200 мкг/кг ¦10 ¦ ¦ ¦ВЭЖХ ¦50 мкг/кг ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Т-2 токсин ¦Хроматографический ¦50 мкг/кг ¦11 ¦ ¦ ¦ГЖХ ¦ ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Нитриты ¦Титрометрический ¦10 мг/кг ¦12 ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Нитрозамины ¦Флюориметрический ¦1 мкг/кг ¦13 ¦ ¦ ¦хемилюминисцентный ¦0,1 мкг/кг ¦ ¦ +----------------+-------------------+--------------+------------+ ¦Остаточные коли-¦Микробиологический ¦0,01 - ¦14 ¦ ¦чества антибио- ¦ ¦0,5 ЕД/г ¦ ¦ ¦тиков ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------+-------------------+--------------+-------------
7.1.2. Показатели качества
---------------------+------------------------------+------------- ¦ Показатель ¦ Метод ¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ источник ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Общий белок ¦Определение азота по ¦15, 16 ¦ ¦ ¦Кьельдалючс пересчетом ¦ ¦ ¦ ¦на белок ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Фракционный состав ¦Молекулярно - ситовая ¦15 ¦ ¦белков ¦хроматография ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Аминокислотный ¦Аминокислотный анализатор ¦17 ¦ ¦состав белков ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Общие липиды ¦Гравиметрический ¦15, 18 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Жирно - кислотный ¦ГЖХ-жирных кислот ¦19 ¦ ¦состав общих липидов¦ ¦ ¦ ¦и фракций ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Фосфолипиды ¦ВЭЖХ ¦20 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Стерины и эфиры ¦Хромато - масс - спектромет- ¦21 ¦ ¦стеринов ¦рическое ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Углеводы ¦ВЭЖХ ¦22 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Крахмал ¦Поляриметрический ¦15, 16 ¦ ¦ ¦ферментативный ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Гемицеллюлоза, ¦ВЭЖХ ¦15, 16, 22 ¦ ¦клетчатка, пектин ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин А и кароти- ¦ВЭЖХ ¦23 ¦ ¦ноиды ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин Е ¦ВЭЖХ ¦23 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин Д ¦ВЭЖХ ¦23 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин С (аскорби- ¦Метод визуального титрования ¦24 ¦ ¦новая кислота) ¦2,6 дихлорфенолиндофенолом ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин B1 ¦Флуориметрический тиохромный ¦24 ¦ ¦ ¦метод ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+
¦Витамин B2 ¦Флуориметрический (титрование ¦25 ¦ ¦ ¦рибофлавинсвязывающим ¦ ¦ ¦ ¦апобелком) ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин PP ¦Флуориметрический метод ¦24 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин B6 ¦ВЭЖХ ¦23 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Витамин B12 ¦Радиоиммунологический ¦24 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Фолиевая кислота ¦Радиоиммунологический метод ¦24 ¦ ¦ ¦конкурентного связывания ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Кальций ¦Визуальное титрование ¦24 ¦ ¦ ¦с кальцеином ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Фосфор неорганичес- ¦Колориметрический ¦24 ¦ ¦кий ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Натрий, калий, ¦Атомно - абсорбционный ¦15 ¦ ¦магний, железо, ¦ ¦ ¦ ¦цинк, медь, хром, ¦ ¦ ¦ ¦молибден ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Селен ¦Спектрофлюориметрический ¦26 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Нуклеиновые кислоты ¦Спектрофотометрический ¦27 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Флаваноиды ¦ВЭЖХ хроматофотометрический ¦28, 29, 30, ¦ ¦ ¦ ¦31 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Эфирные масла ¦ГЖХ, ВЭЖХ ¦32, 33 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Соланин ¦Спектрофотометрический ¦34 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Биогенные амины ¦ВЭЖХ ¦35 ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Дубильные вещества ¦Титрометрический, ¦36, 32 ¦ ¦ ¦колориметрический ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Цианогенные глико- ¦Титрометрический ¦37 ¦ ¦зиды ¦ ¦ ¦ +--------------------+------------------------------+------------+ ¦Фенолкарбоновые ¦Спектрофотометрический ¦36, 30 ¦ ¦кислоты ¦ ¦ ¦ ---------------------+------------------------------+-------------
7.2. Радиологические показатели безопасности
Согласно "Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96 для продуктов, в состав которых входит растительное сырье, определяются радиологические показатели безопасности.
----------------------+-----------------------------+------------- ¦ Показатель ¦Допустимый уровень (не более)¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ источник ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦Цезий-137 ¦200 Бк/кг ¦55 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦Стронций-90 ¦100 Бк/кг ¦56 ¦ ----------------------+-----------------------------+-------------
Радиационная безопасность БАД к пище, загрязненной другими радионуклидами, определяется соответствием ее нормативам ГН 2.6.1.054-96 "Нормы радиационной безопасности (НРБ-96)".
7.3. Оценка безопасности пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, на лабораторных животных
7.3.1. Схема проведения эксперимента
------------------------+----------------------------------------- ¦ Вид животных ¦ Линейные или беспородные белые крысы ¦ ¦ ¦ самцы (дополнительно - крысы самки) ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Продолжительность ¦не менее 6 месяцев для крыс ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Количество групп ¦3 ¦ ¦животных ¦ ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Описание эксперимен- ¦1-ая (контроль - 1) крысы на протяжении ¦ ¦тальных групп ¦эксперимента находятся на общевиварном ¦ ¦ ¦или полусинтетическом рационе ¦ ¦ ¦2-ая (контроль - 2) - крысам в рацион ¦ ¦ ¦включается в агравированном количестве ¦ ¦ ¦изучаемая продукция, полученная традици-¦ ¦ ¦онным способом ¦ ¦ ¦3-я (опыт) - крысам в рацион включается ¦ ¦ ¦в агравированном количестве изучаемая ¦ ¦ ¦продукция, полученная из генно - модифи-¦ ¦ ¦цированного источника ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Содержание животных ¦по 5 в клетке ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Количество забоев ¦2 (через 1 и 6 месяцев от начала экспе- ¦ ¦ ¦римента) ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Количество крыс в ¦ориентировочно с учетом возможной гибели¦ ¦группе на начало ¦36 ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Исходная масса крыс ¦60 - 80 г ¦ ¦ ¦при формировании групп разница средней ¦ ¦ ¦массы крыс не должна превышать 3 г ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦Количество крыс в груп-¦8 ¦ ¦пе, взятых на исследо- ¦ ¦ ¦вание на забое ¦ ¦
------------------------+-----------------------------------------
7.3.2. Экспериментальные рационы
Питание и поение животных вволю.
Общевиварный рацион крыс (на 1 крысу массой 130 - 240 г)
(Приказ министра здравоохранения СССР N 1179 от 10.10.83)
---------------------+--------+--------+------+-----------+------- ¦ Ингредиент ¦Масса, г¦Белок, г¦Жир, г¦Углеводы, г¦ Ккал ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦подсолнечник ¦ 3,7 ¦ 0,76 ¦ 1,9 ¦ 0,114 ¦22,1 ¦ ¦(семена) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦овес ¦ 10,3 ¦ 1,03 ¦ 0,63 ¦ 4,9 ¦25,8 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦хлеб 2 сорта ¦ 4 ¦ 0,34 ¦ 0,05 ¦ 1,83 ¦ 9,32 ¦ ¦пшеничный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦каша пшенная ¦ 2,5 ¦ 0,27 ¦ 0,34 ¦ 1,56 ¦10,5 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦творог нежирный ¦ 2 ¦ 0,36 ¦ 0,012¦ 0,036 ¦ 1,76 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦рыбная мука ¦ 0,5 ¦ 0,23 ¦ 0,027¦ 0 ¦ 1,17 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦мясо II к. ¦ 4 ¦ 0,8 ¦ 0,39 ¦ 0 ¦ 6,72 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦морковь ¦ 8 ¦ 0,104 ¦ 0,008¦ 0,67 ¦ 2,4 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦зелень (салат) ¦ 8 ¦ 0,12 ¦ 0,016¦ 0,25 ¦ 1,36 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦рыбий жир ¦ 0,1 ¦ 0 ¦ 0,099¦ 0 ¦ 0,9 ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦дрожжи ¦ 0,1 ¦ 0,05 ¦ 0,01 ¦ 0,083 ¦ 0,085¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦NaCl ¦ 0,15 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------------+--------+--------+------+-----------+------+ ¦ИТОГО ¦ 43,35 ¦ 4,06 ¦ 3,48 ¦ 9,44 ¦82,12 ¦ ---------------------+--------+--------+------+-----------+-------
Рацион, рекомендованный Институтом питания РАМН
--------------+-------+------------------------------------------- ¦ Продукты ¦Вес ¦ Вес крыс в граммах ¦ ¦ ¦продук-¦ ¦ ¦ ¦тов в г+------+-----T-----+-----T-----+-----T-----+ ¦ ¦на 100 ¦ 40 - ¦60 - ¦90 - ¦120 -¦200 -¦280 -¦свыше¦ ¦ ¦г смеси¦ 60 ¦ 90 ¦ 120 ¦ 200 ¦ 280 ¦ 330 ¦ ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦казеин ¦ 24 ¦ 2,4 ¦ 3,15¦ 3,58¦ 4,8 ¦ 5,1 ¦ 6,0 ¦ 7,0 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦дрожжи <*> ¦ 6 ¦ 0,6 ¦ 0,78¦ 0,89¦ 1,2 ¦ 1,27¦ 1,5 ¦ 1,5 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦крахмал ¦ 56 ¦ 5,6 ¦ 7,38¦ 8,35¦11,2 ¦11,9 ¦14,0 ¦16,0 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦масло раст. ¦ 5 ¦ 0,5 ¦ 0,65¦ 0,74¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,2 ¦ 1,5 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦лярд ¦ 5 ¦ 0,5 ¦ 0,65¦ 0,74¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,2 ¦ 1,5 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦солевая ¦ 4 ¦ 0,4 ¦ 0,52¦ 0,59¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ ¦смесь <**> ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦витамины ¦ 1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,12¦ 0,15¦ 0,18¦ 0,19¦ 0,19¦ ¦ж/р <***> ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦целлюлоза ¦ 2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ +-------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+ ¦отруби ¦ 8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ 0,8 ¦ --------------+-------+------+-----+-----+-----+-----+-----+------
Вместо дрожжей можно использовать витаминную смесь (см. следующую табл.).
<*> Состав витаминной смеси на 100 г смеси
-------------------------------------+---------------------------- ¦ Витамины ¦ Количество ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦B1 (тиамида - бромид) ¦500 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦B2 (рибофлавин) ¦500 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦B6 (пиродоксин) ¦500 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦Пантотенат кальция ¦2 г 800 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦Никотиновая кислота ¦2 г ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦Фолиевая кислота ¦20 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦B12 (на кончике скальпеля) ¦4 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦Викасол ¦100 мг ¦ +------------------------------------+---------------------------+ ¦Глюкоза (или сахароза, или фруктоза)¦93,600 мг (до 100 г) ¦ -------------------------------------+----------------------------
Водорастворимые витамины 0,1% от количества сухих веществ рациона.
<**> Состав солевой смеси
----+-----------------------------+----------------------+-------- ¦ N ¦ Название солей ¦ Формула ¦ г ¦ ¦п/п¦ ¦ ¦ ¦
+---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 1 ¦Хлористый натрий ¦NaCl ¦ 58,5 ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 2 ¦Фосфорнокислый калий одноза- ¦KHPO4 ¦163,3 ¦ ¦ ¦мещенный ¦ ¦ ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 3 ¦Сернокислый магний ¦MgSO4 x 7H2O ¦ 24,1 ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 4 ¦Углекислый кальций ¦CaCO3 ¦160,2 ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 5 ¦Сернокислое железо (закисное)¦FeSO4 x H2O ¦ 11,1 ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 6 ¦Йодистый калий ¦KI ¦ 0,322¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 7 ¦Сернокислый марганец ¦MnSO4 x 2H2O ¦ 1,87 ¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 8 ¦Сернокислый цинк ¦ZnSO4 x 7H2O ¦ 0,230¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ 9 ¦Сернокислая медь ¦CuSO4 x 5H2O ¦ 0,200¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦10 ¦Хлористый кобальт ¦CoCl2 x 6H2O ¦ 0,010¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦11 ¦Фтористый натрий ¦NaF ¦ 0,210¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦12 ¦Алюмокалиевые квасцы ¦KAl(SO4)2 x 12H2O ¦ 0,047¦ +---+-----------------------------+----------------------+-------+ ¦ ¦Итого: ¦ ¦420,089¦ ----+-----------------------------+----------------------+--------
<***> Приготовление жирорастворимых витаминов
---------------------------------------------+---------+---------- ¦ Витамины ¦На 100 мл¦На 500 мл¦ +--------------------------------------------+---------+---------+ ¦E (токоферол - 50 мг/мл) ¦10 мл ¦50 мл ¦ +--------------------------------------------+---------+---------+ ¦A (ретинол - 100000 и.е./мл) ¦0,8 мл ¦4 мл ¦ +--------------------------------------------+---------+---------+ ¦(оргокальциферол - 50000 и.е./мл) ¦1,4 мл ¦7 мл ¦ +--------------------------------------------+---------+---------+ ¦Подсолнечное масло довести ¦87,8 мл ¦439 мл ¦ ---------------------------------------------+---------+----------
7.3.3. Исследуемые показатели
Интегральные показатели
Общее состояние животных (ежедневные наблюдения).
Для контроля за массой тела животных взвешивают в первый месяц опыта - 1 раз в неделю, в дальнейшем 1 - 2 раза в месяц и перед забоем.
На забое определяют абсолютную массу внутренних органов и рассчитывают относительную массу внутренних органов [57].
Биохимические показатели
Биохимические показатели определяются при забое животных.
----------------------+-----------------------------+------------- ¦ Показатель ¦ Метод ¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ источник ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦ Сыворотка крови ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦общий белок ¦Унифицированный метод ¦58 ¦ ¦ ¦по биуретовой реакции ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦альбумин ¦Унифицированный метод ¦59 ¦ ¦ ¦по реакции с бромкрезоловым ¦ ¦ ¦ ¦зеленым ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦белковые фракции ¦Унифицированный метод элект- ¦60 ¦ ¦ ¦рофоретического разделения ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦глюкоза ¦Глюкозооксидазные методы ¦61 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦мочевина ¦Унифицированный метод ¦62 - 63 ¦ ¦ ¦по цветной реакции с диаце- ¦ ¦ ¦ ¦тилмонооксимом ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦креатинин ¦Унифицированный метод ¦63 - 64 ¦ ¦ ¦по цветной реакции Яффе ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦общие липиды ¦Турбидиметрический ¦65 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦холестерин ¦Унифицированные методы ¦66 - 67 ¦ ¦ ¦по реакции с уксусным ангид- ¦ ¦ ¦ ¦ридом или с хлорным железом ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦триглицериды ¦Спектрофотометрические ¦68 - 69 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦минеральный состав ¦Атомно - абсорбционный ¦70 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦аланинаминотрансфе- ¦Спектрофотометрические ¦71 - 72 ¦ ¦раза ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦аспартатаминотрансфе-¦Спектрофотометрические ¦71 - 72 ¦ ¦раза ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦щелочная фосфатаза ¦Спектрофотометрические ¦73 - 74 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦глутатионредуктаза ¦Спектрофотометрические ¦75, ¦ ¦глутатионпероксидаза ¦ ¦150 - 155 ¦
¦супероксиддисмутаза ¦ ¦ ¦ ¦каталаза ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦продукты ПОЛ ¦Спектрофотометрические ¦76, ¦ ¦(малоновый диальде- ¦ ¦146 - 149 ¦ ¦гид, диеновые ¦ ¦ ¦ ¦конъюгаты) ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦альфа-амилаза ¦Спектрофотометрические ¦77 - 78 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦ Моча ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦pH, относительная ¦Общепринятые ¦79 ¦ ¦плотность, суточный ¦ ¦ ¦ ¦диурез ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦белок ¦Биуретовый метод ¦80 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦глюкоза ¦Унифицированные методы ¦81 ¦ ¦ ¦обнаружения глюкозы в моче ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦креатинин ¦Унифицированный метод ¦63 - 64 ¦ ¦ ¦по цветной реакции Яффе ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦ Печень ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦цитохром P-450 ¦Спектрофотометрический ¦82 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦цитохром b5, ¦Спектрофотометрический ¦82 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦N-деметилирование ¦Спектрофотометрический ¦84 ¦ ¦амидопирина ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦O-деметилирования ¦Спектрофотометрический ¦85 ¦ ¦p-нитроанизола ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦гидроксилирование ¦Спектрофлюориметрический ¦86 ¦ ¦3,4 бензпирена ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦O-деэтилирование ¦Спектрофлюориметрический ¦87 ¦ ¦7-этоксикумарина ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦O-деэтилирование ¦Спектрофлюориметрический ¦88 ¦ ¦7-этоксирезофурина ¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦бета-галактозидаза, ¦Спектрофотометрический, ¦89 ¦ ¦бета-глюкуронидаза, ¦спектрофлюориметрический ¦ ¦ ¦арилсульфатазы A и B,¦ ¦ ¦ ¦альфа-маннозидаза, ¦ ¦ ¦ ¦бета-N- ¦ ¦ ¦ ¦ацетилглюкозаминидаза¦ ¦ ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦эпоксидгидролаза ¦Спектрофлюориметрический ¦90 ¦ +---------------------+-----------------------------+------------+ ¦УДР- ¦Спектрофотометрический и ¦91 ¦ ¦глюкуронозилтрансфе- ¦спектрофлюориметрический ¦ ¦ ¦раза ¦ ¦ ¦ ----------------------+-----------------------------+-------------
Гематологические показатели
---------------------+--------------------------------+----------- ¦ Показатель ¦ Метод ¦Литера- ¦ ¦ ¦ ¦турный ¦ ¦ ¦ ¦источник ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦концентрация гемог- ¦гемиглобинцианидный ¦92 ¦ ¦лобина ¦ ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦общее количество ¦унифицированный метод ¦93 ¦ ¦эритроцитов ¦подсчета в счетной камере ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦гематокритная ¦унифицированный микрометод ¦94 ¦ ¦величина ¦(модификация И. Тодорова) ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦среднее содержание ¦расчетный ¦94 ¦ ¦гемоглобина в эрит- ¦ конц. гемоглобина г% x 10 ¦ ¦ ¦роците (ССЭ) (пг) ¦ССЭ = ------------------------- ¦ ¦ ¦ ¦ эритроцитыв. млн. ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦средняя концентрация¦расчетный ¦94 ¦ ¦гемоглобина в эрит- ¦ конц. гемоглобина г% ¦ ¦ ¦роците (СКЭ) (%) ¦СКЭ = ------------------- x 100¦ ¦ ¦ ¦ гематокритн. ¦ ¦ ¦ ¦ величина об% ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦средний объем одного¦расчетный ¦94 ¦ ¦эритроцита (СОЭ) ¦ гематокритн. величина x 10¦ ¦ ¦(мю) ¦СОЭ = --------------------------¦ ¦ ¦ ¦ эритроциты в млн. ¦ ¦ +--------------------+--------------------------------+----------+ ¦общее количество ¦- унифицированный метод под- ¦94 ¦ ¦лейкоцитов, лейкоци-¦счета в счетной камере; ¦ ¦ ¦тарная формула ¦- унифицированный метод мор- ¦ ¦ ¦ ¦фологического исследования ¦ ¦ ¦ ¦форменных элементов крови с ¦ ¦ ¦ ¦дифференцированным подсчетом ¦ ¦ ¦ ¦лейкоцитарной формулы; ¦ ¦ ¦ ¦- приготовление мазков крови ¦ ¦ ¦ ¦унифицированным методом, фик- ¦ ¦ ¦ ¦сация и окраска мазков унифи- ¦ ¦ ¦ ¦цированным методом ¦ ¦ ---------------------+--------------------------------+-----------
Морфологические исследования
Все животные, погибшие в ходе эксперимента, вскрываются и составляется протокол вскрытия. На забое проводятся морфологические исследования, изложенные в таблице.
-------------------+--------------------------------+------------- ¦Исследуемые органы¦ Методы ¦Литературный¦ ¦ ¦ ¦ источник ¦ +------------------+--------------------------------+------------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ +------------------+--------------------------------+------------+ ¦все внутренние ¦макроскопические исследования ¦ ¦ ¦органы ¦при вскрытии на забое ¦ ¦ +------------------+--------------------------------+------------+ ¦печень ¦1. Обзорные гистологические ¦95, 96, 97 ¦ ¦почки ¦исследования, окраска срезов ¦ ¦ ¦селезенка ¦органов, полученных с парафино- ¦ ¦ ¦желудок ¦вых блоков, гематоксилином и ¦ ¦ ¦тонкий кишечник ¦эозином ¦ ¦ ¦семенники ¦2. Дополнительные специальные ¦ ¦ ¦поджелудочная ¦морфологические исследования: ¦ ¦ ¦железа ¦- изучение жировых включений в ¦ ¦ ¦сердце ¦клетке, окраска суданом; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление жирных кислот с ¦ ¦ ¦ ¦помощью сульфата нильского ¦ ¦ ¦ ¦голубого; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление холестерина; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление в клетках РНК окра- ¦ ¦ ¦ ¦шиванием пиронином и метиловым ¦ ¦ ¦ ¦зеленым; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление липофусцина в клет- ¦ ¦ ¦ ¦ках; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление коллагеновых волокон¦ ¦ ¦ ¦в соединительной ткани; ¦ ¦ ¦ ¦- выявление эластических волокон¦ ¦ ¦ ¦в соединительной ткани; ¦ ¦ ¦ ¦- морфометрический метод иссле- ¦ ¦ ¦ ¦дований размеров площади гисто- ¦ ¦ ¦ ¦логических структур и их колеба-¦ ¦ ¦ ¦ний в патологии ¦ ¦ -------------------+--------------------------------+-------------
7.4. Специальные методы исследования
Необходимость проведения тех или иных специальных методов исследования определяется экспертом Института питания РАМН.
7.4.1. Изучение влияния продуктов, полученных из генетически модифицированных источников, на функцию воспроизводства с выявлением возможного эмбриотоксического, гонадотоксического и тератогенного действия
Условия проведения эксперимента
Исследования проводятся на белых линейных крысах. Животные разбиваются на 3 группы, в каждой группе 10 самцов и 25 самок. Исходная масса самок не менее 180 г, исходная масса самцов не менее 200 г. 1-ая контрольная группа крыс (самцы и самки) получает на протяжении всего эксперимента общевиварный или полусинтетический рацион (см. п. 7.3); 2-ая контрольная группа (самцы и самки) получает общевиварный или полусинтетический рацион с включением исследуемого продукта, полученного традиционным способом в агравированном количестве; опытная группа крыс (самцы и самки) получает общевиварный или полусинтетический рацион с включением аналогичного продукта, полученного из генетически модифицированных источников в том же количестве, что и крысы 2-ой контрольной группы. Животные находятся на этих рационах 30 дней до спаривания, во время спаривания, беременности, лактации. Полученное потомство находится на этих рационах до момента половой зрелости. Исследуются 5 поколений крыс.
Изучение влияния продукта, полученного из генетически модифицированных источников, на пренатальное развитие потомства
Для спаривания в клетку к двум самкам подсаживают вечером одного самца, утром осуществляют микроскопирование влагалищных мазков. Первый день беременности определяют по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. По 10 беременных самок из каждой группы забивают на 20-ый день беременности. Плоды извлекают из рогов матки и обследуют визуально для обнаружения видимых аномалий развития, после этого плоды взвешивают. После наружного осмотра плоды каждого помета делят на 2 группы. Одну фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов. Другую фиксируют в 96-процентном этаноле и используют для изучения состояния скелета (2 - 3 плода от приплода) [98]. Подсчитывают количество желтых тел, количество живых эмбрионов, количество погибших эмбрионов (мест резорбции). Вычисляют общую эмбриональную смертность, смертность эмбрионов до и после имплантации [99].
Изучение влияния продукта, полученного из генетически модифицированных источников, на постнатальное развитие потомства
По 15 беременных самок в каждой группе оставляют до родов и проводят изучение потомства: количество крысят, родившихся у одной самки, их внешний вид, фиксируют количество мертворожденных животных, потомство взвешивают при рождении, затем еженедельно. Учитывают следующие показатели физиологического развития крысят: сроки отлипания ушных раковин, открытия глаз, прорезывания резцов, покрытия шерстью, пол животных [100]. Наблюдения за потомством осуществляют ежедневно. Рассчитывают выживаемость потомства на 30-ый день.
7.4.2. Исследование возможного мутагенного действия
Выявление мутагенного действия испытуемых продуктов на соматических и половых клетках проводится на лабораторных животных, а изучение генных мутаций на микроорганизмах или дрозофиле.
Продукт скармливается лабораторным животным в различных количествах в качестве составной части диеты в разные сроки в зависимости от характера опыта.
На подопытных и контрольных животных проводятся исследования:
- цитогенетические исследования метафазным методом в соматических клетках (костный мозг, лимфоциты крови животных);
- изучение генетических изменений в половых клетках методом выявления доминантных летальных мутаций;
- изучение генных мутаций производится по выбору на микроорганизмах или дрозофиле; микробиологические методы используются для первичной оценки на мутагенность. Для этих целей чаще всего используют штаммы микроорганизмов Salmonella thyphimurium [140 - 142].
В зависимости от характера опыта используются следующие животные:
- линейные мыши (С57 В1/6 или другие чувствительные к мутагенам), самцы, вес 18 - 20 г;
- гибридные мыши, самки, вес 18 - 20 г.
Для оценки мутагенного действия испытуемого продукта изучают хромосомные аберрации в клетках костного мозга и доминантные летальные мутации (ДЛМ) в половых клетках подопытных и контрольных животных. Цитогенетические исследования проводят метафазным методом. Согласно методу животных, получавших испытуемый и контрольный продукт, через 24 часа после последнего скармливания забивают (предварительно за 2 часа до забоя вводят внутрибрюшинно колхицин для накопления метафаз) и берут костный мозг из 2-х бедренных костей. После гипотенизации клеток в термостате с помощью 0,5-процентного раствора KCl и фиксации смесью этанол + уксусная кислота готовят цитогенетические препараты. От каждого животного анализируют 70 - 100 клеток на стадии метафазы деления ядра. В опытах используют мышей - самцов линии С57 В1/6 в возрасте 2 месяца, весом около 20 г. Считается, что животные этой линии наиболее чувствительны к мутагенам [101].
Генетические изменения в половых клетках изучают методом выявления доминантных летальных мутаций у мышей - самцов С57 В1/6 [101 - 102]. Проведение эксперимента сводится к следующему: подопытным и контрольным животным скармливают испытуемый продукт в течение 30 дней. После периода скармливания 15 подопытных и 13 контрольных самцов ссаживают с интактными виргинными самками линии СВА в соотношении 1:2 с целью их скрещивания. Подсадка самок к подопытным самцам производится еженедельно на протяжении 3-х недель, что дает возможность оценить действие испытуемого продукта на половые клетки в постмейотическом периоде - сперматиды и зрелые спермии. Отсаженных беременных самок убивают методом смещения шейных позвонков на 15 - 17 день беременности, вскрывают, подсчитывают число желтых тел, количество живых и мертвых эмбрионов. По этим данным рассчитывают индексы мутагенности: доимплантационную, постимплантационную смертность, индуцированную летальность.
В случае необходимости рекомендуется проводить исследования на генные мутации на дрозофиле или микроорганизмах.
Метод исследования генных мутаций в зародышевых клетках дрозофилы, основанный на определении в х-хромосоме самцов дикого типа (Д 32) рецессивных летальных мутаций, передающихся через дочерей самкам второго поколения [103 - 104].
Метод выявления на микроорганизмах мутагенной активности трансгенного продукта, подвергнутого метаболическим процессам в организме млекопитающих (тест Эймса и метод промежуточного хозяина) [105 - 106].
7.4.3. Оценка потенциальной аллергенности пищевых продуктов, получаемых из генетически модифицированных источников
Для оценки потенциальной аллергенности продукции, получаемой из генетически модифицированных источников в Институте питания РАМН, разработана экспериментальная модель системной анафилаксии, возникающей у лабораторных животных (крыс) при их внутрибрюшинной сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы гомологичного белкового антигена внутривенно.
Метод исследования заключается в количественной оценке изменений тяжести протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов JgG1 + JgG4) у крыс, получающих в составе рациона тестируемый продукт, полученный из генетически модифицированных источников, в сравнении с животными, получающими аналогичный продукт, изготовленный из традиционных источников.
Принцип метода
Метод основан на количественной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс самцов линии ВИСТАР пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка внутривенно.
Определение включает следующие этапы:
- в/б сенсибилизация крыс антигеном - ОВА, адсорбированном на корпускулярном носителе - гидроксиде алюминия;
- одновременное с процессом сенсибилизации кормление животных рационами, содержащими тестируемый и контрольный продукт;
- взятие крови для определения антител и в/в введение разрешающей дозы ОВА, количественная оценка тяжести развивающегося анафилактического шока;
- иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА;
- математическая обработка результатов исследования и составление заключения о потенциальной аллергенности исследуемого продукта.
Животные
Исследования выполняют на крысах самцах линии ВИСТАР с исходной массой 150 - 180 г. Животных содержат на стандартном рационе вивария, не содержащем яичного белка, в течение 7 - 10 дней перед началом эксперимента по 5 - 6 животных в клетке. Контролируют массу тела крыс, отстающих в приросте массы тела в течение периода адаптации удаляют.
В течение периода кормления экспериментальным рационом (всего 29 дней) животные получают в составе рациона тестируемый и контрольный продукт в квоте, не превышающей 20% общей калорийности рациона.
Формируют 2 группы крыс по 25 животных в каждой. Животные 1-й группы получают тестируемый продукт, а животные 2-й группы - контрольный продукт в составе своих рационов. На 1-й, 3-й, 45-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента. Далее крыс помещают в домики для в/в манипуляций и вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.
Примечание. В случае, если тестируемые продукты имеют жидкую консистенцию (молочные продукты, напитки), вместо добавления в диету допускается вводить их животным ежедневно внутрижелудочно через зонд, снабженный гладкой оливой диаметром не более 2 мм.
Материалы и оборудование
Овальбумин куриного яйца, ОВА, 5-кратно перекристаллизованный лиофилизированный препарат.
Раствор хлорида натрия 0,15 моль/л (физиологический раствор).
Шприц инъекционный "Рекорд" на 1,0 мл с иглой для в/б инъекций.
Шприц инъекционный "Рекорд" на 20 мл с зондом для в/ж введения.
Алюмокалиевые квасцы K[Al(SO4)2] x 12H2O, препарат квалификации ч.д.а.
Гидроксид натрия NaOH, препарат квалификации ч.д.а.
Центрифуга лабораторная с горизонтальным ротором ОПН-3.
Универсальный индикатор.
Домики для в/в манипуляций на крысах, из оргстекла или дерева.
Шприц инъекционный "туберкулиновый" с иглой для в/в введений.
Комплект реактивов и оборудования для иммуноферментного анализа.
Приготовление антигена и сенсибилизация
Навеску 10 мг ОВА растворяют в 1,0 мл физиологического раствора (ФР) и добавляют 1,0 мл 10-процентного водного раствора алюмокалиевых квасцов. На этой стадии раствор должен оставаться прозрачным. После этого добавляют по каплям при перемешивании 0,6 мл водного раствора NaOH 1 моль/л до образования плотного белого осадка. Проверяют pH по универсальному индикатору: pH = 5 +/- 1. Осадок отделяют центрифугированием 5 мин. при 3000 об./мин. Супернатант декантируют, а осадок промывают 10 мл ФР. Центрифугирование и промывку повторяют 3 раза. Окончательно осадок гидроксида алюминия с адсорбированным ОВА диспергируют в 20 мл ФР.
Полученную дисперсию антигена вводят крысам строго внутрибрюшинно в количестве 0,2 мл (по 100 мкг ОВА в 1 дозе).
Для проведения "бустерной" инъекции готовят антиген по той же схеме, за исключением того, что исходная навеска ОВА уменьшается в 10 раз (1,0 мг).
Введение разрешающей дозы и оценка тяжести реакции системной анафилаксии
Перед введением разрешающей дозы ОВА крыс помещают в домики для в/в манипуляций. Хвост животного погружают на 10 - 15 мин. в воду с температурой 37 +/- 1 град. C.
С помощью иглы для в/в введений и шприца типа "туберкулиновый" отбирают 0,2 - 0,3 мл крови для определения антител. После этого строго в/в вводят разрешающую дозу 5 мг ОВА в 0,5 мл ФР (10 мг/мл ОВА). Внимание! Подкожное попадание раствора белка не допускается!
Симптомы системной анафилаксии развиваются у крыс, обычно, на протяжении первых 2 - 5 мин. после введения разрешающей дозы. Тяжесть реакции оценивают в баллах в соответствии со шкалой (см. таблицу).
------------------------+----------------------------------------- ¦Тяжесть реакции (баллы)¦ Симптоматика ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦ 0 ¦отсутствует ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦ 1 ¦вялость, озноб, одышка ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦ 2 ¦атаксия, цианоз, парез задних ¦ ¦ ¦конечностей ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦ 3 ¦судороги, паралич ¦ +-----------------------+----------------------------------------+ ¦ 4 ¦летальный исход ¦ ------------------------+-----------------------------------------
Окончательный подсчет числа летальных исходов осуществляют на протяжении первых 24 часов после введения разрешающей дозы.
Иммуноферментное определение специфических антител
В основу метода анализа антител к ОВА у крыс положен принцип непрямого твердофазного иммуноферментного теста на полистероле (indirect ELISA).
В лунки полистерольных планшет вносят по 1,0 мкг ОВА в 0,1М Na-бикарбонатном буфере pH 9,7 +/- 0,1 и оставляют на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляют путем промывки 0,01М Na-фосфатным буфером pH 7,3 +/- 0,1 с 0,15М NaCl и 0,1% Твин-20 (Твин-PBS). В лунки на 30 мин. вносят по 200 мкл 1-процентного раствора желатины в Твин-PBS. Отмывку повторяют, после чего вносят в лунки по 100 мкл стандартов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполняют на PBS с 0,2-процентного бычьего сывороточного альбумина (DSA-PBS). Планшеты инкубируют 90 мин. при 22 град. C со встряхиванием, после чего 5-кратно отмывают Твин-PBS и вносят по 100 мкл кроличьих антител к JgG крысы, конъюгированных с пероксидазой, в разведении 1:1000 в BSA-PBS. Инкубацию и отмывку повторяют, после чего проводят реакцию со 100 мкл субстрата 0,04-процентного о-фенилендиамина и 0,04-процентного H2O2 в 0,1 М Na-цитрат - фосфатном буфере pH 6,00 +/- 0,05 в течение 10 мин. при 37 град. C. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 М H2SO4. Оптическую плотность измеряют при длине волны 492 нм на фотометре АКИ-Ц-01.
Концентрацию антител определяют по стандартному графику в полулогарифмических координатах методом линейной интерполяции на ЭВМ.
Математическая обработка результатов эксперимента и оценка результата
Тяжесть реакции анафилактического шока в каждой из групп животных оценивают следующими показателями:
- процентом летальных реакций анафилаксии;
- анафилактическим индексом, рассчитанным по формуле:
N
АИ = (1 / N) x SUM ri,
где
N - число крыс в группе;
i - номер крысы;
r - тяжесть реакции анафилаксии в баллах.
Достоверность различия тяжести реакции анафилаксии между двумя группами определяют в соответствии с U-тестом углового преображения Фишера. Для этого для каждого из указанных безразмерных показателей (выраженных в долях единицы) рассчитывают преобразованную долю выработки по формуле:
__
фи = 2 x arcsin \/p ,
где
p - долевой показатель;
arcsin - определяется в радианах.
Далее для двух сравниваемых групп N 1 и 2 рассчитывают величину U-критерия по формуле:
____________________
U = |фи1 - фи2| x \/ N1 x N2 / (N1 + N2).
Различие по данному показателю признается достоверным (нуль гипотеза отклоняется, P < 0,04), если U >= 1,96.
Различие в тяжести реакции анафилаксии между двумя группами в целом признается достоверным, если достоверно различие хотя бы по одному, из двух вышеуказанных, показателю.
Достоверность различий средних значений и дисперсий уровней антител к ОВА в двух группах определяют, соответственно, с использованием T-теста Стьюдента и F-теста на остаточную дисперсию Фишера. Анализу подвергают показатели оптической плотности (D492) концентрации антител (мг/мл) и десятичного логарифма концентрации антител.
Все расчеты выполняют на ЭВМ с использованием стандартного пакета программ EXCEL5.0a.
7.4.4. Иммунологические исследования
7.4.4.1. Исследования на крысах
Исследования проводятся по схеме хронического эксперимента при тех же условиях кормления и содержания. Через 1 месяц и через 6 месяцев от начала эксперимента определяют следующие показатели:
----------------------------------------------------+------------- ¦ Изучаемые показатели ¦Литературный¦ ¦ ¦ источник ¦ +----------------+----------------------------------+------------+ ¦Показатели гумо-¦Суммарный уровень иммуноглобули- ¦107 - 109 ¦ ¦рального иммуни-¦нов и количество иммуноглобулинов ¦ ¦ ¦тета ¦различных классов ¦ ¦ +----------------+----------------------------------+------------+ ¦Показатели кле- ¦Реакция бласттрансформации лимфо- ¦110 - 111 ¦ ¦точного иммуни- ¦цитов in vitro ¦ ¦
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное