Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве (Методические указания)

Одобрены
Главным управлением ветеринарии
Госагропрома СССР
12 июля 1989 года

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве подготовлена научными сотрудниками ВНИИ незаразных болезней животных, Центральной ветеринарной лабораторией ГУВ СССР, ведущими специалистами ГУВ СССР.

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве предназначена для ветеринарных и зоотехнических специалистов птицеводческих хозяйств.

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности одобрена Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 12 июля 1989 года.

В настоящее время в промышленном птицеводстве редко встречаются болезни A-витаминной недостаточности с характерными патологоморфологическими изменениями. Чаще в птицеводческих хозяйствах диагностируют гипервитаминозы A, для которых характерны те же патологоморфологические изменения, что и для дефицита витамина A (ломкость перьев, кожные дерматиты, кератоконъюнктивиты и гиперкератоз слизистых оболочек).

Лабораторная диагностика A-витаминной обеспеченности организма птиц наиболее достоверна при использовании спектрофотометрического метода.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА A И КАРОТИНОИДОВ В ПЕЧЕНИ И ЯЙЦЕ

Принцип метода. Метод основан на щелочном гидролизе и экстракции витамина A и каротиноидов из измельченной ткани при помощи малолетучих растворителей и последующем спектрофотометрическом измерении поглощения света раствором до и после разрушения витамина A ультрафиолетовыми лучами при длине волны 328 нм и 460 нм для каротиноидов.

Реактивы. 96-процентный этиловый спирт, ксилол или о-ксилол (ч), октан х.ч., калий едкий, 1 н раствор едкого калия в 96-процентном этиловом спирте. К 1 объему 11 н раствора едкого калия добавить 10 объемов этилового спирта. Раствор готовится в день проведения анализов, 11 н раствор едкого калия: 617,16 г едкого калия доводят дистиллированной водой в колбе на 1 л, ксилоло-октановая смесь (1:1). Готовят в день проведения анализов.

Оборудование. Спектрофотометр, ультрафиолетовая лампа ПРК-4, центрифуга, водяная баня, вентилятор настольный, пробирки из стекла пирекс, пропускающие ультрафиолетовые лучи, 55 х 8 мм, центрифужные пробирки, пипетки градуированные на 1, 5, 10 мл, стеклянные палочки.

Ход определения. Для исследования используют свежую или хранившуюся в замороженном состоянии печень. Пробу печени тщательно растирают в фарфоровой ступке, затем взвешивают 0,5 г полученной гомогенной массы (таким же образом готовят для анализа пробу желтка, только желток в количестве 1 г отвешивают непосредственно в центрифужную пробирку).

Навеску печени количественно переносят в центрифужную пробирку и приливают 2 мл 1 н спиртового раствора едкого калия. Перемешивают стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза на водяную баню при температуре 60 °C на 30 минут. После этого пробирки охлаждают в холодной воде в течение 5 - 10 минут и добавляют в каждую 8 мл ксилоло-октановой смеси. Пробирки закрывают пробками и сильно встряхивают в течение 2 мин., после чего центрифугируют 5 мин. при 1500 об./мин. Верхний слой центрифугата переносят пипеткой в кварцевую кювету спектрофотометра и калориметрируют: каротиноиды определяют при длине волны 460 нм, витамин A путем двукратного измерения, до и после облучения проб ультрафиолетовыми лучами, при длине волны 328 нм. Для этого исследуемые пробы переносят из кювет в пробирки из стекла пирекс и облучают 45 - 60 мин. лампой ПРК-4 на расстоянии 15 - 19 см. Для того чтобы пробирки не нагревались, во время облучения их охлаждают с помощью настольного вентилятора. Концентрацию витамина A определяют по разности отсчетов при спектрофотометрировании до и после облучения.

Расчет. Содержание каротиноидов определяют по формуле:

Х = 4,8 х Е х 2 х п,

где:

Х - искомое содержание каротиноидов в мкг/г;

4,8 - коэффициент по Бессею для каротина;

Е - оптическая плотность пробы при 460 нм;

2 - коэффициент пересчета на 1 грамм печени;

п - разведение (количество мл ксилоло-октановой смеси).

Определение содержания витамина A производят по формуле:

                       Х = 6,37 х (Е  - Е ) х 2 х п,
                                    1    2

    где:
    Х - содержание витамина A в мкг/г;
    6,37 - коэффициент для витамина A по Бессею;
    Е  - оптическая плотность раствора витамина A до облучения при 328 нм;
     1
    Е   -  оптическая плотность раствора витамина A после облучения при 328
     2
нм;
    2 - коэффициент пересчета на 1 грамм печени;
    п - разведение.

При высоком содержании витамина A в печени нужно проводить дополнительное разведение. Это дополнительное разведение учитывают в формуле расчета.

Диагностика E-гиповитаминоза. Болезни E-витаминной недостаточности у молодняка птиц проявляются большим разнообразием клинических признаков и патологоанатомических изменений (энцефаломаляция, экссудативный диатез, беломышечная болезнь и токсическая дистрофия печени).

Диагностируют болезни E-витаминной недостаточности комплексно по результатам патологоанатомических, гистологических и биохимических методов исследования.

Патологоанатомические изменения.

а) энцефаломаляция - восприимчив молодняк птиц 3 - 6-недельного возраста. Изменения локализуются преимущественно в мозжечке и проявляются кровоизлияниями, разрушением клеток мозговой ткани с последующим образованием очагов некроза, застойными явлениями.

В отдельных случаях морфологические изменения обнаруживают в скелетной мускулатуре и миокарде;

б) экссудативный диатез - восприимчив молодняк птиц 3 - 7-недельного возраста. Основным патологоанатомическим признаком этого заболевания являются обширные подкожные инфильтраты соломенного цвета в области головы, шеи, груди, конечностей. Иногда студневидные отеки наблюдаются в межтканевых пространствах внутренних органов и головном мозге. Кроме отеков в подкожной клетчатке, обнаруживаются изменения в миокарде (дистрофия) и в поджелудочной железе (очаговые некрозы);

в) беломышечная болезнь (миодистрофия) - восприимчив молодняк птиц 2 - 4-недельного возраста. Довольно часто изменения, характерные для беломышечной болезни, диагностируются у 24 - 25-суточных эмбрионов индюшат, гусят и утят.

У индюшат патологоанатомические изменения обнаруживаются постоянно в мышечном желудке, значительно реже в миокарде и скелетной мускулатуре. Мышечный желудок уменьшен в объеме, несколько сплюснут, слегка упругой консистенции. На разрезе желудка обнаруживаются серо-белые участки пораженной мышечной ткани, придающие ему мозаичный рисунок. Сердечная мышца дряблая, иногда на фоне темно-розового цвета обнаруживаются серо-белые полоски и тяжи.

У цыплят и гусят морфологические изменения локализуются в скелетной мускулатуре грудной кости, конечностей. Пораженные участки мускулатуры имеют вид вареного мяса.

Большим разнообразием морфологических изменений характеризуется беломышечная болезнь утят. Так, в одних хозяйствах у больных утят поражается только мышечный желудок, у других - скелетная мускулатура, а у третьих - печень;

г) токсическая дистрофия печени утят - одна из форм проявления беломышечной болезни. Печень резко увеличена, заполняет всю брюшную полость, полнокровная, темно-вишневого цвета дряблой, мажущейся консистенции. Капсула снимается легко. Сердечная мышца дряблая грушевидной формы и пронизана тонкими серо-белыми полосками.

Лабораторная диагностика E-витаминной обеспеченности организма птиц

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА E В ПЕЧЕНИ И ЯЙЦЕ

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции витамина E с железодипиридиловым реактивом.

Реактивы. Ацетон, петролейный эфир (40 - 60°), 85-процентная серная кислота, 2-процентный гидроксид калия, железодипиридиловый реактив. Готовится следующим образом: 250 мг хлорного железа и 500 мг 2,2'-дипиридила растворяют в 1 л ледяной уксусной кислоты, реактив стабилизируется на 7 - 10 день. Хранить при комнатной температуре в посуде из темного стекла, бензол.

Посуда и оборудование. Ступка фарфоровая с пестиком, делительная воронка на 250 - 500 мл, колба на 50 мл, центрифужные пробирки, центрифуга, фотоэлектроколориметр, водяная баня, баллон с газообразным азотом.

Ход определения. Навеску печени или желтка в 2 г тщательно измельчают и растирают в ступке, заливают 30 мл ацетона, снова растирают, дают отстояться и верхний слой декантируют в делительную воронку, одновременно фильтруя через бумажный фильтр. Повторно витамин экстрагируют 30 мл смеси (ацетон 15 мл + 15 мл петролейного эфира), третий раз смесью 10 мл ацетона + 20 мл петролейного эфира. Экстракты, собранные в делительную воронку, 2 раза промывают 2 - 3-кратным объемом дистиллированной воды. Петролейно-эфирный экстракт переносят в колбу и на водяной бане при температуре 60 °C выпаривают в токе азота до объема 1,5 - 2 мл. Остаток выливают в градуированную пробирку (центрифужную). Колбу ополаскивают 1 - 2 мл петролейного эфира, который сливают в центрифужную пробирку, и объем жидкости в пробирке доводят петролейным эфиром до 5 мл. Для осаждения витаминов A и каротиноидов в пробирку к экстракту добавляют 2 - 3 мл серной кислоты, тщательно перемешивают содержимое в течение 2 - 3 мин. (встряхиванием), а затем для разделения слоев центрифугируют 5 мин. при 1500 об./мин. Надосадочную жидкость пипеткой переносят в другую центрифужную пробирку в количестве 3,0 мл и остаток кислоты в ней нейтрализуют 2-процентным раствором KOH. Тщательно перемешивают 1 - 2 мин., затем центрифугируют 5 мин., 3 мл надосадочной жидкости выпаривают на водяной бане при температуре 60 °C в токе азота и осадок растворяют в 1 мл бензола, а затем добавляют 2,0 мл железодипиридилового реактива. Выдерживают 20 минут в темном месте и колориметрируют при длине волны 490 нм, в кювете с рабочим расстоянием 5 мм против контроля. Контролем служит бензол + железодипиридиловый реактив.

Расчет ведут по формуле:

                                  а х у х в
                              Е = ---------,
                                      м

где:

Е - концентрация витамина в мг%;

а - количество витамина E по калибровочной кривой;

у - объем раствора в кювете;

в - степень разведения (3);

м - количество печени (г).

Построение калибровочной кривой:

10 мг (чистого 96-процентного альфа-токоферола) растворяют в колбе на 10 мл бензолом (20 мг процентный - основной раствор);

2,5 мл основного раствора растворяют в колбе на 25 мл (2 мг процентный р-р);

к 5 мл (2 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл бензола (1 мг процентный р-р);

к 5 мл (1 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,5 мг процентный р-р);

к 5 мл (0,5 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,25 мг процентный р-р);

к 5 мл (0,25 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,125 мг процентный р-р).

Далее в пробирку по 1 мл каждого разведения прибавляют 1 мл бензола и 2 мл железодипиридилового реактива. Контроль: 2 мл бензола и 4 мл железодипиридилового реактива.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА E В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции хлорного железа с витамином E в присутствии 2,2'-дипиридила.

Реактивы. Гексан, этанол 96°, хлороформ, 2-процентный р-р хлорного железа, 2-процентный р-р 2,2'-дипиридила (на абсолютном спирте).

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные, водяная баня, центрифуга, баллон с газообразным азотом, фотоэлектроколориметр.

Ход определения. В центрифужную пробирку, содержащую 1 мл сыворотки, добавляют 2 мл 96° спирта, 3 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Затем через полученный раствор несколько секунд пропускают азот, после чего пробирки закрывают пробками и тщательно встряхивают в течение 1 - 2 минут. Одновременно, подобным образом, обрабатывают контрольную пробу, вместо сыворотки берут 1 мл дистиллированной воды. После встряхивания пробы центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об./мин. Затем отбирают 2 мл надосадочной жидкости и выпаривают на водяной бане в токе азота (водяная баня при температуре 60 °C). После выпаривания в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл хлороформа, 2 мл этанола, 0,2 мл 2-процентного раствора 2,2'-дипиридила, 0,2 мл 2-процентного раствора хлорного железа. Пробы встряхивают 10 сек. и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм не позже 40 сек., в кювете с рабочим расстоянием 5 мм против контроля. Контролем служит 0,2 мл хлороформа + 2 мл этанола + 0,2 мл 2-процентного раствора 2,2'-дипиридила + 0,2 мл 2-процентного раствора хлорного железа. Содержание витамина E находят по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой

Основной раствор (20 мг процентный) готовится следующим образом:

10 мг (чистого 96-процентного альфа-токоферола) растворяют в колбе на 50 мл абсолютным спиртом.

Для построения калибровочной кривой готовят рабочие растворы:

2,5 мл основного раствора растворяют в колбе на 25 мл (2 мг процентный р-р);

к 5 мл (2 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (1,0 мг процентный р-р);

к 5 мл (1,0 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,5 мг процентный р-р);

к 5 мл (0,5 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,25 мг процентный р-р);

к 5 мл (0,25 мг процентного р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,125 мг процентный р-р).

В центрифужные пробирки берут по 1 мл каждого разведения. Все остальные операции выполняют в том же порядке, как описано выше.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ E-ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

Принцип метода. Витамин E, участвуя в углеводном, белковом и липидном обмене, способствует сохранению целостности клеточных мембран. Одной из форм проявления гиповитаминоза E является нарушение липопротеиновых оболочек клеток и их субклеточных органелл. В полной мере недостаток токоферола отражается и на состоянии эритроцитарных мембран, в результате чего снижается устойчивость эритроцитов к действию лизирующих веществ. На этой биологической зависимости основан метод тест-гемолиза эритроцитов с лимонной кислотой, который используется для диагностики E-витаминной недостаточности у птиц.

Реактивы. Фосфатный буфер (14,2 г безводного фосфорнокислого двузамещенного натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды, pH 7,4, доводят 1 н раствором соляной кислоты), 0,89-процентный раствор хлористого натрия, солефосфатный раствор (смесь равных частей фосфатного буфера и солевого раствора), 0,1-процентный раствор лимонной кислоты на солефосфатном растворе.

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные на 10 мл, пипетки на 1 - 5 мл и микропипетки на 0,1 мл, фотоэлектроколориметр, термостат, центрифуга.

Ход определения. В центрифужную пробирку, содержащую 3 мл солефосфатного раствора, добавляют 0,03 мл крови, взятой из подкрыльцовой вены, смешивают и центрифугируют 10 мин. при 1500 - 2000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают. К осадку эритроцитов добавляют 3 мл солефосфатного раствора, осторожно смешивают до однородной взвеси, а затем переносят по 1 мл в три пробирки. В первую и вторую пробирку добавляют по 1 мл 0,1% раствора лимонной кислоты, а в третью - 1 мл солефосфатного раствора и выдерживают в термостате 30 мин. при температуре 40 °C, а затем 1 ч при комнатной температуре. После этого в первую и третью пробирки добавляют по 3 мл солефосфатного раствора, а во вторую - 3 мл дистиллированной воды. Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают и центрифугируют при 1500 - 2000 об./мин. 10 мин. Надосадочную жидкость каждой пробирки колориметрируют (светофильтр N 3, длина волны 410 - 415 нм). Контролем служит солефосфатный раствор.

Гемолиз в процентах вычисляют по формуле:

(а - в) / (б - в) х 100,

где:

а - показание ФЭКа при исследовании содержимого первой пробирки;

б - показание ФЭКа при исследовании содержимого второй пробирки;

в - показание ФЭКа при исследовании содержимого третьей пробирки.

Во избежание ошибки при определении следует пользоваться чистой стеклянной посудой, ополаскивая ее спиртом и тщательно просушивая. Нельзя сильно встряхивать пробирки с кровью, особенно после инкубации в термостате, иначе может произойти механический гемолиз эритроцитов.

Диагностическое значение. У клинически здоровой птицы в реакции с лимонной кислотой гемолизируется не более 8% эритроцитов, что соответствует физиологическому содержанию токоферола в сыворотке крови: 0,85 - 1,2 мг%.

При уменьшении запасов витамина E в организме устойчивость эритроцитов к гемолизу снижается. Так, гемолиз эритроцитов 10% и выше оценивается как показатель E-витаминной недостаточности. Чем выше гемолиз эритроцитов, тем более четко у птицы проявляются клинические признаки гиповитаминоза E.

Диагностика гиповитаминоза K. K-витаминную недостаточность у птиц диагностируют на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов биохимических исследований печени и сыворотки крови больных птиц.

Основными клиническими симптомами недостатка витамина K у птиц являются массовые кровоизлияния или кровотечения, возникающие при незначительных повреждениях сосудов и продолжающиеся длительное время из-за замедленной свертываемости крови.

При дефиците витамина K у несушек родительского стада птица несет большое количество яиц с кровяными пятнами. Из таких яиц выводится молодняк с повышенной кровоточивостью, который погибает в первые дни жизни от незначительных повреждений сосудов (прикрепление крылометок, обрезание клюва).

Патологоанатомические изменения

У павших птиц обнаруживается картина обескровливания тканей и органов, скопление плохо свернувшейся крови в полостях, под кожей, в межмышечных пространствах, под серозными оболочками.

Геморрагические явления у больных птиц могут быть в любой части тела, подвергшейся механическому воздействию или сильному мышечному напряжению, но, в основном, появляются в области головы, крыльев, грудных и бедренных мышц, в кутикулярном слое, мышечном слое мышечного желудка, под капсулой печени и в толще паренхимы органа.

Характерным патологоанатомическим признаком при K-витаминной недостаточности у взрослых птиц являются гематомы под капсулой печени и в толще органа, у молодняка старшего возраста - геморрагические кровоподтеки в межмышечных пространствах и кровоизлияния под кожей, а у молодняка первых дней жизни - очагово-язвенные кутикулиты.

Лабораторная диагностика

Из биохимических методов исследований наиболее достоверными являются: прямой метод определения витамина K в печени и экспресс-метод определения протромбиновой активности крови.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА K В ПЕЧЕНИ ПО МЕТОДУ МЕЕРОВИЧА И МАРТИНСОНА

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции 2 метил-1,4 нафтохинона с анилином.

    Реактивы.   Анилин,   петролейный   эфир,   витамин   K    (масляный  -
                                                           1
96-процентный).

Посуда и оборудование. Фотоэлектроколориметр, центрифуга, весы аналитические, ступки фарфоровые с пестиком, делительные воронки емкостью 50 мл, центрифужные пробирки, мерные пипетки на 5 мл.

Ход определения. Навеску печени в 1 грамм тщательно растирают в ступке. Растертую массу переводят в делительную воронку и ступку смывают 5 мл воды. Прибавляют сюда же 10 мл петролейного эфира. Всю массу взбалтывают в течение 5 мин., затем переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут при 1500 об./мин. После центрифугирования берут 5 мл надосадочной жидкости, приливают 2 мл анилина, встряхивают в течение 2 минут и ставят центрифугировать 5 минут при 1500 об./мин. Затем верхний слой выливают, а нижний слой колориметрируют на ФЭКс, кювета N 3, светофильтр N 4 (фиолетовый). Контролем служит анилин. Содержание витамина К определяют по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой

    10  мг  витамина K  растворяют в колбе на 50 мл петролейным эфиром (200
                      1
мкг/г);

25 мл раствора (200 мкг/г) + 25 мл петролейного эфира (100 мкг/г);

25 мл раствора (100 мкг/г) + 25 мл петролейного эфира (50 мкг/г);

25 мл раствора (50 мкг/г) + 25 мл петролейного эфира (25 мкг/г);

5 мл раствора (25 мкг/г) + 5 мл петролейного эфира (12,5 мкг/г).

Затем из каждой колбы берут 5 мл раствора, добавляют 2 мл анилина. Пробирку закрывают и смесь взбалтывают в течение 2 минут. Центрифугируют в течение 5 минут при 1500 об./мин. Затем нижний слой анилина колориметрируют на ФЭК. Контроль - анилин. Кювета N 3, светофильтр N 3.

ДИАГНОСТИКА K-ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ПТИЦ ПО ПРОТРОМБИНОВОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ

Принцип метода. При участии витамина K в организме птиц осуществляется синтез протромбина, проконвертина и некоторых других факторов свертывания крови. Существует корреляция между содержанием протромбина в крови и витамином K в организме птиц. "Протромбиновое время" (время, необходимое для образования в плазме крови сгустка из фибрина в присутствии проконвертина, тромбопластина и солей кальция) как показатель содержания в крови протромбина используется для определения обеспеченности организма птиц витамином K.

Реактивы. 0,85-процентный физиологический раствор, 1,34-процентный раствор щавелевокислого натрия (1,34 г на 100 мл дистиллированной воды), 0,277-процентный раствор хлористого кальция (0,277 г высушенного до постоянного веса и хранимого в эксикаторе хлористого кальция на 100 мл воды), лабораторный тромбопластин) (с активностью 22 - 27 с). Перед постановкой опыта берут 50 мг сухого препарата тромбопластина, растирают с 5 мл дистиллированной воды в фарфоровой ступке до получения однородной массы. Полученную суспензию переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 8 - 10 минут при 1500 об./мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и используют при постановке реакций. Разведенного тромбопластина (50 мг) достаточно для исследования 45 - 50 проб крови.

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные, пробирки Видаля, пипетки на 1,2 мл, микропипетки на 0,1 - 0,2 мл, водяная баня, секундомер, центрифуга.

Ход определения. Для получения объективных данных нужно исследовать кровь от 10 - 15 птиц, имеющих характерные для этой группы признаки. Исследуемая птица не позднее 6 часов до взятия крови должна получать достаточное количество питьевой воды. У нее не должно быть признаков заболевания печени. Кровь в количестве 0,4 мл берут пипеткой или шприцем из кровеносных сосудов крыла, ног (можно из сосудов шеи после декапитации) и выливают в центрифужные пробирки, содержащие 0,1 мл раствора щавелевокислого натрия. Для перемешивания крови с оксалатом натрия пробирку слегка покачивают, а затем центрифугируют 10 минут при 1500 об./мин. Надосадочную жидкость (плазму) отсасывают и пипеткой переносят в пробирку, где смешивают с равным количеством 0,85-процентного раствора хлористого натрия.

В тонкостенную пробирку Видаля наливают 0,2 мл хлористого кальция и 0,1 мл разведенного тромбопластина. Пробирку помещают в водяную баню (40 °C) и одновременно включают секундомер. Через 30 сек., не вынимая пробирки из бани, вводят в нее пипеткой 0,1 мл разведенной плазмы и слегка встряхивают до появления хлопьев или сгустков (лучше видны при проходящем свете). При появлении сгустков или хлопьев выключают секундомер, замечая время. "Протромбиновым" считается время, прошедшее с момента введения пробирки в водяную баню до появления хлопьев или сгустков, исключая 30 сек., затраченных на прогревание пробирки.

Если исследуемая кровь хранилась более 3 часов (при обычной температуре) с момента ее взятия, а также подвергалась замораживанию или в нее добавлено больше оксалата натрия, чем рекомендуется, то "протромбиновое время" значительно увеличивается.

Диагностическое значение. При достаточной насыщенности организма птиц витамином K среднее "протромбиновое время" у птиц при работе с гетерологичным тромбопластином (Кировский НИИ гематологии и переливания крови) составляет 45 сек. с пределами колебаний от 30 - 55 сек.

"Протромбиновое время" 60 и более секунд указывает на имеющийся дефицит витамина K в организме птиц.

При исследовании сыворотки крови с гомологичным ветеринарным тромбопластином (изготовлен из тканей суточных цыплят) - среднее "протромбиновое время" у птиц составляет 20 секунд с пределами колебаний 17 - 25 сек., что соответствует оптимальному содержанию в печени взрослых птиц витамина K - 225 мкг/г с пределами колебаний 200 - 250 мкг/г и молодняка птиц 40 мкг/г с пределами колебаний 30 - 50 мкг/г.

Симптомы K-витаминной недостаточности наступают при увеличении "протромбинового времени" как для гетерологичного, так и для гомологичного тромбопластинов в 2 и более раз.

Это групповой экспресс-метод, и для объективной постановки диагноза необходимо исследовать кровь не менее 10 птиц.

Диагностика Д-гиповитаминоза. При дефиците витамина Д в организме птиц нарушаются процессы всасывания из кишечника фосфорнокислых солей, уменьшается количество кальция и фосфора в костях, в результате чего развивается рахит у молодняка и остеомаляция у взрослых птиц.

Развитию этой патологии во многом способствует недостаток или неправильное соотношение между кальцием и фосфором, так как регуляторное влияние витамина Д на соотношение кальция и фосфора ограничено определенными пределами.

    Диагноз  ставят,  основываясь  на  данных  анализа рациона, клинических
патоморфологических   признаков  и  биохимических  исследований  содержания
витамина Д , кальция и фосфора.
          3

Патоморфологические изменения

При вскрытии павшей птицы обращает на себя внимание синюшность слизистых оболочек. Основные изменения сосредоточены в трубчатых, плоских и смешанных костях.

У молодняка птиц кости мягкие, хрящеподобные, легко режутся или ломаются. Под влиянием веса тела, мышечных сокращений и других нагрузок они искривляются, изменяется форма грудной кости. В местах костно-хрящевых сочленений ребер возникают утолщения, называемые рахитическими четками.

У утят, кроме вышеописанных изменений, клюв мягкий, резиноподобный. У взрослых птиц патология проявляется декальцинацией (остеомаляция) костей с образованием неполноценной в функциональном и морфологическом отношении остеоидной и хрящевой ткани. В период интенсивной яйцекладки несушки несут большое количество яиц шероховатых с насечками и тонкой скорлупой или вообще без скорлупы.

Лабораторная диагностика

    Из  биохимических  методов исследования используют определение витамина
Д  в печени и экспресс-метод определения уровня лимонной кислоты в крови.
 3

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА Д В ПЕЧЕНИ

Принцип метода. Метод основан на гидролизе исследуемого образца спиртовым раствором щелочи и отделении неомыляющейся фракции бензолом: удалении стеринов преципитацией с дигитанином, адсорбции токоферолов и каротиноидов на колонке с окисью алюминия, хроматографии на колонке с гумбрином с целью удаления витамина A, спектрофотометрического определения витамина Д по реакции с треххлористой сурьмой.

Реактивы. Бензол, свободный от тиофена и толуола, 1,2-дихлорэтан, 96° этанол (перегнанный), 72° этанол (75 мл 96° этанола + 25 мл дистиллированной воды, эфир серный, свободный от перекисей и кислот, эфир петролейный (фракция 40 - 70°), свободный от воды, ненасыщенных и ароматических углеводородов, 2-процентный раствор дигитонина в 72° этаноле, гумбрин 60 - 100 меш, содержащий 11% воды.

Для хроматографии гумбрин предварительно измельчают на шаровой мельнице, просеивают через сито 110 меш. К 200 г просеянного гумбрина добавляют 500 мл 96° этанола, хорошо размешивают и кипятят полученную смесь в течение 2 - 3 мин. После отстаивания верхний слой сливают. К осадку добавляют 250 мл 96° этанола и еще раз кипятят в течение 2 - 3 мин. при постоянном помешивании. Затем смеси дают отстояться, надосадочную жидкость сливают, а осадок дважды промывают диэтиловым эфиром. Промытый гумбрин переносят на стеклянный фильтр (нутч-фильтр) N 1 и с помощью вакуумного насоса отсасывают излишнюю влагу, далее его помещают в сушильный шкаф при температуре 60° на 3 часа, а затем хранят в темной посуде с притертой пробкой. Перед употреблением гумбрин снова помещают в сушильный шкаф на 6 часов при температуре 105°, охлаждают в эксикаторе над хлористым кальцием 1 - 2 часа, взвешивают, вносят в него воду из расчета 11% от массы гумбрина.

Окись алюминия (щелочная). В колбе на 200 мл смешивают 75 г окиси алюминия для хроматографии (100 - 325 меш) с 75 мл 2 н спиртового раствора едкого калия, подогревают на водяной бане 15 минут при температуре 80° и охлаждают. Затем фильтруют отсасыванием, сушат при 130° в вакууме и хранят в герметически закрытой колбе. Реактив Ниелда. Берут 22 г треххлористой сурьмы и заливают 100 мл хлороформа. Из полученного раствора готовят 2-процентный раствор ацетилхлорида. Спустя 3 суток реактив готов к употреблению.

Основной стандартный раствор витамина Д. Растворяют 10 мг кристаллического витамина Д в 200 мл бензола и хранят в холодильнике в темной герметически закрытой посуде. Раствор стоек в течение 14 суток.

Рабочий стандартный раствор витамина Д. В мерную колбу емкостью 100 мл наливают 5 мл основного стандартного раствора и доводят бензолом до метки. 1 мл этого раствора содержит 2,5 мкг витамина Д.

Ход определения. В колбу на 300 мл берут 10 г тщательно измельченной печени, заливают 200 мл 75-процентного спиртового раствора едкого калия, добавляют 0,5 г аскорбиновой кислоты, все тщательно перемешивают, после чего проводят гидролиз в течение 30 минут на водяной бане с обратным или воздушным холодильником при температуре кипения смеси 80°, не допуская бурного кипения. Далее колбу охлаждают под струей холодной воды, добавляют 50 мл 96° этанола, содержимое тщательно перемешивают и переносят в колбу с притертой пробкой (29 шлиф) на 1000 мл, добавляют 200 мл бензола, колбу закрывают и встряхивают до получения однородного раствора, затем приливают 400 мл дистиллированной воды и снова энергично встряхивают. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку на 1000 мл, которую прочно закрепляют в штативе. После разделения слоев нижний водный слой отбрасывают (если разделение слоев медленное или нечеткое, необходимо добавить 10 - 20 мл 96° этанола). Бензольный экстракт промывают 80 мл 0,5 н водного раствора едкого калия, отмывают дистиллированной водой от щелочи порциями по 80 мл до нейтральной реакции по фенолфталеину, после чего бензольный экстракт сливают в колбу с сернокислым натрием (7 - 8 г) и ставят в темное место на 30 - 60 мин. Высушенный бензольный экстракт фильтруют через складчатый фильтр, при этом трижды промывая сернокислый натрий и фильтр бензолом (10 - 15 мл).

Отфильтрованный бензольный экстракт выпаривают под вакуумом в токе азота на роторно-вакуумном испарителе на водяной бане при температуре 80°. Затем колбу разъединяют с вакуумом и азотом и к сухому остатку быстро добавляют 20 мл 96° этилового спирта. Если сухой остаток не растворился, то колбу следует немного подогреть. Далее добавляют 8,6 мл дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным, если этого явления не наблюдается, колбу необходимо подогреть для просветления раствора. Затем приливают 10 мл 2-процентного спиртового раствора дигитонина и через 30 мин. образующийся в растворе осадок комплекса стерин-дигитонина отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр, смоченный 72° этанолом. Фильтр и колбу промывают 15 мл 72° этанола. К полученному фильтрату еще раз добавляют 10 мл 2-процентного спиртового раствора дигитонина и ставят в холодильник до следующего дня (на 18 - 20 час.), предварительно плотно закрыв колбу притертой пробкой.

При определении витамина Д в других объектах обработку дигитонином можно проводить однократно с выдерживанием образцов в холодильнике, лучше в морозильной камере, в течение 18 - 20 ч. Образующийся осадок снова фильтруют, как было указано выше, полученный фильтрат дважды экстрагируют в делительной воронке по 25 мл петролейным эфиром и промывают 20 мл 72° этилового спирта. Нижний спиртово-водный слой отбрасывают, а экстракт сливают для выпаривания в колбу, в которую вставлена обычная стеклянная воронка с бумажным фильтром, на дно которого помещают сернокислый натрий. Фильтр с сернокислым натрием промывают петролейным эфиром. Затем фильтрат выпаривают под током азота в роторно-вакуумном испарителе на водяной бане при температуре 60 °C. Полученный сухой остаток растворяют в 10 мл петролейного эфира. В итоге выполненных операций получается раствор А.

С целью удаления каротиноидов и токоферолов, которые мешают определению витамина Д, проводят колоночную хроматографию на окиси алюминия. Для этого в колбу Эрленмейера на 50 мл к 5 г щелочной окиси алюминия добавляют 0,55 мл дистиллированной воды, закрывают резиновой пробкой, нагревают 5 мин. на водяной бане при 80 °C и встряхивают до образования рыхлого порошка. Колбу охлаждают и окись алюминия переносят в хроматографическую колонку (0,7 см), в узкой части которой помещена вата. Затем пропускают через приготовленную колонку с окисью алюминия 10 мл петролейного эфира и переносят раствор А. Далее сразу же после прохождения раствора А через окись алюминия проводят элюацию, вначале дважды по 5 мл и один раз 40 мл 1-процентного раствора диэтилового эфира в петролейном эфире, а затем 50 мл 10-процентного раствора диэтилового эфира в петролейном эфире. Собранный элюат выпаривают досуха в роторно-вакуумном испарителе в токе азота на водяной бане при 60°. Сухой остаток быстро растворяют в 10 мл петролейного эфира. Полученный раствор условно называют раствором Б.

Для отделения витамина A от витамина Д, который также дает цветную реакцию с треххлористой сурьмой и мешает определению витамина Д, используют хроматографию на гумбрине. Для этого берут хроматографическую колонку (альфа = 1 см), узкую часть которой заполняют ватой, затем помещают 27 г подготовленного для хроматографии гумбрина (при определении витамина Д в плазме количество гумбрина можно уменьшить до 9 - 18 г), пропускают через гумбрин 10 мл петролейного эфира и переносят раствор Б. После прохождения раствора Б колонку промывают (элюируют) бензолом дважды по 5 мл и один раз 50 мл. По окончании элюации раствор выпаривают досуха в роторно-вакуумном испарителе под током азота на водяной бане при температуре 80 °C. Сухой остаток в колбе растворяют в 1 мл 1,2-дихлорэтана. Это раствор С.

Измерение. К раствору С добавляют 2 мл раствора Ниелда и взбалтывают, затем переливают раствор в кювету и через 45 и 90 сек. после добавления реактива Ниелда измеряют на спектрофотометре оптическую плотность пробы против пустой кюветы сначала при длине волны 500 нм, а затем при 550 нм.

Стандартный раствор. Берут 2 мл рабочего стандартного раствора витамина Д и переносят в колбу. Затем раствор выпаривают на водяной бане при температуре 80 °C под вакуумом в токе азота. Колбу быстро охлаждают и осадок растворяют в 1 мл 1,2-дихлорэтана. В дальнейшем выполняют манипуляции, описанные в разделе "Измерение". Содержание витамина Д выражают в интернациональных единицах (ИЕ) на 1 г (или мл) образца. Расчет ведут по следующей формуле:

                             М  х (А  - А ) х 40
                              2     1    2
                         Х = -------------------,
                               М  х (А  - А )
                                1     3    4

    где:
    А  - оптическая плотность опытной пробы при 500 нм;
     1
    А  - оптическая плотность опытной пробы при 550 нм;
     2
    А  - оптическая плотность стандартной пробы при 500 нм;
     3
    А  - оптическая плотность стандартной пробы при 550 нм;

     4
    М  - навеска образца (печени), взятая для анализа, в г;
     1
    М  - количество витамина Д в стандартной пробе;
     2
    40 - коэффициент пересчета в ИЕ.

Например: Для анализа взяли 10 г печени, оптическая плотность (экстинкция) раствора, полученного из опытного образца (раствора С), при длине волны 500 нм равна 0,125, а при длине волны 550 нм - 0,070. Оптическая плотность стандартного раствора при длине волны 500 нм равна 0,270, а при длине волны 550 нм равна 0,050. Количество витамина Д в стандартном растворе 5 мкг (в 1 мл - 2,5 мкг), 40 - коэффициент для пересчета результата анализа в интернациональные единицы.

        5 (0,125 - 0,070) х 40
    Х = ---------------------- = 5,00 ИЕ/г.
          10 (0,270 - 0,050)

ДИАГНОСТИКА Д-ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПО УРОВНЮ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции лимонной кислоты с пиридином в уксусном ангидриде.

Реактивы. 10-процентный раствор трихлоруксусной кислоты уксусный ангидрид, пиридин безводный. Основной стандартный раствор лимонной кислоты (20 мг б/в лимонной кислоты х.ч. или ч.д.а. растворяют в 100 мл 10% ТХУ).

Посуда и оборудование. Центрифужные и химические пробирки, пипетки на 1,10 мл, водяная баня, отрегулированная на 60 °C, ФЭК.

Ход определения. Берут в центрифужную пробирку 1 мл 10-процентного раствора ТХУ и сюда же добавляют 1 мл крови. Смешивают, выдерживают 10 мин. и центрифугируют 10 - 15 мин. при 1500 об./мин. Отбирают 1 мл безбелкового экстракта в химическую пробирку. Сюда же добавляют 8 мл (точно) уксусного ангидрида, закрывают пробкой и помещают в водяную баню с постоянной температурой 60° +/- 1 °C. Через 10 мин. в пробирку добавляют 1 мл пиридина безводного, закрывают пробкой и оставляют в водяной бане на 40 мин., затем переносят на 5 мин. в сосуд с холодной водой. Отсчет ведут на ФЭКе (светофильтр 3, длина волны 400 - 420 нм, кювета N 10).

Для установки прибора проводят холостой опыт с 1 мл 10% ТХУ вместо исследуемого экстракта тканей, все остальное так же.

Содержание лимонной кислоты определяют по калибровочной кривой, которую строят на основании определения вещества в серии разведений стандартного раствора.

Построение калибровочной кривой

Берут 25 мл основного 20 мг процентного р-ра + 25 мл 10% ТХУ - 10 мг% раствор лимонной кислоты;

25 мл (10 мг процентного) + 25 мл 10-процентного ТХУ - 5 мг процентного;

10 мл (5 мг процентного) + 10 мл 10-процентного ТХУ - 2,5 мг процентного;

1 мл (10 мг процентного) + 9 мл 10-процентного ТХУ - 1 мг процентного.

Затем из каждого разведения берем 1 мл раствора, далее, как описано в методике.

Диагностическое значение. В крови клинически здоровой птицы, обеспеченной витамином Д, содержится 5 - 6 мг% и более лимонной кислоты. При появлении начальных симптомов Д-витаминной недостаточности уровень кислоты снижается до 2 - 3 мг% и далее. Необходимо учитывать, что симптомы рахита и остеомаляции у птицы могут быть следствием дефицита в организме кальция и фосфора, поэтому определение последних в крови также обязательно.

Для получения объективных данных кровь исследуют у 10 - 15 особей из группы.

                       Диагностика гиповитаминоза B
                                                   1

Клинические симптомы и патологоанатомические изменения, особенно в начальной стадии тиаминовой недостаточности, малоспецифичны, поэтому основой диагностики гиповитаминоза на этой стадии его развития являются биохимические методы исследования.

Патологоморфологические изменения

Более четко выражены при сильной степени недостаточности тиамина.

У павших птиц обнаруживают атрофию скелетной и сердечной мускулатуры, половых органов, желудка, а также расширение сердца и гипертрофию надпочечников.

Обнаруживается ярко выраженная гиперемия мозга с симметрично расположенными геморрагическими очажками в сером веществе.

Лабораторная диагностика. Имеются два лабораторных метода определения тиаминовой обеспеченности организма птиц: а) прямой - по содержанию общего тиамина в печени и б) экспресс-метод по определению пировиноградной кислоты в крови.

          ОПРЕДЕЛЕНИЕ B -ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПО СОДЕРЖАНИЮ
                       1
                          ОБЩЕГО ТИАМИНА В ПЕЧЕНИ

Принцип метода. Определение общего тиамина в печени основано на его экстракции изобутиловым или изоамиловым спиртом, окислении красной кровяной солью в тиохром и количественном измерении по интенсивности флюоресценции.

    Реактивы.  Кристаллический  препарат  витамина  B   0,25  н р-р соляной
                                                     1
кислоты,  20-процентный  р-р  углекислого  натрия,  20-процентный  р-р ТХУ,
универсальная  индикаторная  бумага, 1-процентный р-р красной кровяной соли
(хранить в склянке из темного  стекла),  30-процентный  р-р едкого  натрия,
изоамиловый или изобутиловый спирт, этиловый спирт 96°, фосфатаза.

Посуда и оборудование. Стаканчики Хагедорна (сахарные стаканчики), большие биологические пробирки (200 х 24) или цилиндры (100 мл) с притертой пробкой, центрифужные пробирки мерные, пипетки (10, 5, 2, 1 мл), ступки фарфоровые, водяная баня, термометр, центрифуга, термостат на 37 °C, флюорометр.

Ход определения. 3 грамма печени растирают в ступке с кварцевым песком, приливают 15 мл 0,25 н раствора соляной кислоты, размешивают и выливают в стаканчик Хагедорна или большую пробирку. Ступку ополаскивают 5 мл 0,25 н соляной кислоты и сливают в тот же стаканчик. Затем ставят стаканчик со смесью в кипящую водяную баню на 15 мин. Слегка охлаждают и доводят 20-процентным раствором углекислого натрия до pH 5,2. Добавляют 3 капли хлороформа и 50 мг фосфатазы, закрывают ватной пробкой и ставят в термостат при 37 °C на 24 часа. По истечении этого времени вынимают стаканчик из термостата и ставят в кипящую водяную баню на 3 мин. Смесь охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр (или лучше центрифугируют). К фильтрату прибавляют 2 мл 20-процентного ТХУ. Ставят в водяную баню при 40 - 50 °C на 10 мин., после чего снова фильтруют. Осадок на фильтре промывают 3 мл горячей бидистиллированной воды. К фильтрату (в больших пробирках) прибавляют двойной объем изоамилового спирта и энергично встряхивают 2 мин., оставляют до разделения слоев (примерно 2 часа).

Затем верхний слой (изоамиловый) с посторонними флюоресцирующими веществами отбрасывают, а нижний (водный) делят на 2 части (равные), переносят их в чистые большие пробирки: одна служит опытом, другая - контролем. Приготовление основного стандартного раствора (10 мг тиамина в 100 мл воды), рабочий стандартный раствор - 1 мл основного р-ра доводят до 100 мл дистиллированной водой. 1 мл рабочего стандартного раствора доводится до 10 мл (в 1 мл содержится 0,1 мг тиамина) (рабочий раствор). Берут 1 мл рабочего раствора + 2 мл красной кровяной соли + 2 мл NaOH (стандартная пробирка). В опытную пробирку прибавляют 4 мл смеси, состоящей из 2 мл 1-процентного раствора красной кровяной соли и 2 мл 30-процентного раствора едкого натрия (готовят перед анализом), и выдерживают 2 мин. В контрольную пробирку приливают 2 мл 30-процентного раствора едкого натрия.

По истечении 2 мин. в стандартную, опытную и контрольную пробирки прибавляют по 8 мл изоамилового спирта, встряхивают 2 мин. и оставляют до разделения слоев на 6 - 24 часа. После разделения слоев отбрасывают теперь уже нижний водный слой, а верхний промывают, добавляют в него 4 мл бидистиллированной воды, слегка встряхивают и отстаивают. После чего нижний водный слой отбрасывают, а верхний переносят в мерные пробирки, доливают изоамиловым спиртом до 8 мл. Если есть помутнение, прибавляют еще 1 мл 96° этилового спирта для просветления и флюорометрируют. Стандартным раствором выставляем стрелку флюорометра на 80. Затем флюорометрируем опытную и контрольную пробирки. Расчет производится по формуле:

                              (а - в) х к
                          Х = -----------, мкг/г,
                                   н

    где:
    Х - содержание B  в пробе в мкг/г;
                    1
    а - показания флюорометра для опытной пробы;
    в - показания флюорометра для контрольной пробы;
    к - цена одного деления (равна 1);
    н - навеска ткани.

ДИАГНОСТИКА ТИАМИНОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПО УРОВНЮ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ

Принцип метода. В основе метода определения пировиноградной кислоты лежит ее осаждение в виде 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ), дающего со щелочью соединение коричнево-красного цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию пировиноградной кислоты в растворе и определяется фотометрически.

Реактивы. 10-процентный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 0,1-процентный раствор 2,4-динитрофенилгидрозина (50 мг реактива растворяют в 10 мл концентрированной соляной кислоты при слабом подогревании, объем раствора доводят дистиллированной водой до 50 мл (хранят в холодильнике)), концентрированная соляная кислота, 12-процентный раствор едкого натрия, пировиноградная кислота или пировинограднокислый натрий.

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные, стеклянные палочки, колбы, пипетки на 1,2 мл, фотоэлектроколориметр.

Ход определения. Берут 0,3 мл крови и смешивают в центрифужной пробирке с 0,7 мл дистиллированной воды. К гемолизату приливают 1 мл 10-процентного раствора ТХУ, смешивают стеклянной палочкой и через 1 - 2 мин. центрифугируют при 1500 об./мин. в течение 15 мин. Надосадочную жидкость полностью сливают в пробирку, приливают 0,4 мл 0,1-процентного раствора 2,4-ДНФГ, смешивают и на 20 мин. помещают в темное место при комнатной температуре. К содержимому пробирки приливают 1 мл 12-процентного раствора едкого натрия и через 5 мин. определяют на ФЭКе оптическую плотность окрашенного раствора против контрольной пробы (готовят так же, как опытную пробу, только вместо крови берут воду). Светофильтр синий, длина волны 440 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм. Количество пировиноградной кислоты рассчитывают по калибровочной кривой.

Приготовление основного стандартного раствора: 50 мг пировиноградной кислоты или 63 мг пировинограднокислого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды (1 мл содержит 0,5 мг или 500 мкг).

Рабочий раствор: берут 1 мл основного стандартного раствора и доводят объем водой до 10 мл (1 мл содержит 50 мкг).

Построение калибровочной кривой. В пробирки берут 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 мл рабочего стандартного раствора и доводят объем до 1 мл дистиллированной водой. Все остальные операции выполняют в том же порядке, как описано выше.

Расчет проводят по формуле:

Х = (Р х 100) / (0,3 х 1000),

где:

Р - количество пировиноградной кислоты в мкг, найденное по калибровочной кривой;

0,3 - количество крови, взятое на анализ.

Диагностическое значение. В крови молодняка и взрослой птицы при уровне тиамина в печени не ниже 1,7 мкг/г содержится 1,5 - 2,5 мг% пировиноградной кислоты. В начальной стадии гиповитаминоза количество ее увеличивается до 3,5 - 4,5 мг%, что соответствует 0,9 - 1,1 мкг/г тиамина в печени. Для получения объективных данных необходимо исследовать не менее 10 голов из каждой возрастной группы.

    Диагностика    гиповитаминоза   B .   Диагноз   ставят   на   основании
                                     2
патологоморфологических изменений и биохимических исследований.

Патологоанатомические изменения

У молодых птиц обнаруживают дерматиты в области головы, шеи, спины, а также скрючивание пальцев и васкуляризацию роговицы - "кровянистый глаз".

У взрослых птиц обнаруживается гипертрофия и размягчение плечевого и седалищного нервов и их утолщение в 3 - 5 раз.

    Лабораторная  диагностика.  В организме животных витамин B  находится в
                                                              2
виде рибофлавина, флавин-мононуклеотида и флавеаденин-динуклеотида, которые
при суммарном их определении рассматриваются как общий рибофлавин.

          ДИАГНОСТИКА B -ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПО СОДЕРЖАНИЮ
                       2
                        ОБЩЕГО РИБОФЛАВИНА В ПЕЧЕНИ

    Принцип метода. Определение общего рибофлавина основано на его свойстве

флюоресцировать  после  отделения  от белков. Основным депонирующим органом
витамина  B   в  организме  птиц   является  печень,  в которой его уровень
           2
колеблется от 1,5 до 40,0 мкг/г.
    Реактивы.  20%  и  2-процентные   растворы   трихлоруксусной   кислоты,
4-молярный раствор K HPO  (912 г  K HPO   на  1 л  дистиллированной  воды),
                    2   4          2   4
двууглекислый   натрий   (NaHCO ).    Стандартный    раствор    рибофлавина
                               3
(0,4 мкг/мл): в мерной колбе на 1 л растворяют 40 мг рибофлавина и  доводят
до метки дистиллированной  водой.  Раствор можно хранить в течение месяца в
темном  и  холодном  месте.  Рабочий  раствор  готовят перед употреблением:
берут  1 мл  основного   раствора   в   мерную   колбу  на 100 мл и доводят
дистиллированной водой до метки.
    Приборы,  посуда  и оборудование. Флюорометр, светофильтры для витамина
B ,  пробирки  из  кварцевого  стекла,  водяная  баня,  стеклянные  колбы и
 2
воронки, мерные колбы на 1000 и 100 мл.
    Ход  определения.  2 г печени растирают с кварцевым песком в фарфоровой
ступке  и к ним добавляют 8 мл дистиллированной воды. Суспензию переносят в
колбу  с  10 мл  20-процентного раствора ТХУ. После 15-минутной выдержки на
кипящей  водяной  бане  содержимое  колбы  фильтруют через бумажный фильтр.
Колбу трижды промывают  2-процентным  раствором  ТХУ  по 5 мл.  К фильтрату
добавляют 5,8 мл 4-молярного раствора K HPO   и общий объем  смеси  доводят
                                       2   4
дистиллированной водой до 50  мл. Определение общего рибофлавина производят
на флюорометре  параллельно  стандартному раствору и испытуемым фильтратам.
Сначала измеряют  интенсивность  флюоресценции  и  регистрируют  показания.
Затем  в  каждую пробирку  для  гашения  флюоресценции  добавляют  примерно
0,05 - 0,07 г смеси  гидросульфита  натрия  и двууглекислого натрия и снова
измеряют интенсивность флюоресценции. В стандартном растворе  флюоресценция
должна  погаситься  полностью.  В  испытуемых  растворах  может  оставаться
небольшая флюоресценция (после 1 - 3-кратного гашения),  которая  возникает
от посторонних флюоресцирующих примесей.
    Содержание общего рибофлавина рассчитываем по формуле:

                          (А - В) х 0,4 х у
                      Х = ----------------- = мкг/г,
                                С х а

    где:
    А   -   показания  флюорометра  для  испытуемого  раствора  при  первом
определении;
    В - показания флюорометра для испытуемого раствора после гашения;
    0,4 - содержание рибофлавина в 1 мл стандартного раствора, мкг;
    у - общее количество разведенного испытуемого раствора;
    а - вес печени в граммах;
    С   -   первичное  показание  флюорометра  для  стандартного  раствора,
содержащего  0,4  мкг/мл  B  (лучше стрелку флюорометра устанавливать на 20
                           2
деление).
    Диагностика  гиповитаминоза B . Осуществляется на основании клинических
                                 c
и  гематологических  исследований  (бледность кожи, депигментация оперения,
снижение количества гемоглобина и эритроцитов).

Недостаток фолиевой кислоты отражается на выводимости и развитии эмбрионов, чаще всего встречается сплющивание головы и недоразвитие нижней челюсти.

Наиболее важное диагностическое значение имеет определение запасов фолиевой кислоты в печени птиц.

Лабораторная диагностика

         ДИАГНОСТИКА B -ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ
                      c
                         ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ В ПЕЧЕНИ

Принцип метода. Основан на принципе окисления фолиевой кислоты марганцевокислым калием в кислой среде. При этом образуется птеридин-6-карбоновая кислота - сильно флюоресцирующее вещество, содержание которого определяется (при pH 4,0 - 4,5) с помощью флюорометра.

    Реактивы.  Анилин  свежеперегнанный,  активированный  уголь  марки  СТ,
навеску  угля заливаем водным раствором свежеперегнанного анилина и кипятим
1  час при помешивании. Затем уголь отфильтровывают 5 - 6 раз через воронку
Бюхнера   с  бумажным  фильтром  с  помощью  вакуумного  насоса,  промывают
дистиллированной  водой  и  сушат  в  термостате  при  температуре  37  °C.
Стандартный  раствор  фолиевой  кислоты  (2  мг  фолиевой кислоты на 100 мл
дистиллированной  воды)  хранить  под  слоем  толуола  в  темной склянке на
холоде.  3-процентный раствор  аммиака  в  70-процентном  этиловом  спирте.
25-процентная уксусная кислота. 4-процентный KMnO .  3-процентная  перекись
                                                 4
водорода. 40-процентная метафосфорная кислота.

Посуда и оборудование. Вакуумный насос, термостат, водяная баня, флюорометр, фарфоровые ступки, воронки, фильтры Шотта N 3, мерные цилиндры на 50 и 100 мл, воронки Бюхнера, плоскодонные колбы на 100 и 250 мл.

Ход определения. Исследованию подлежит печень от 4 - 5 кур, имевших характерные для группы показатели (вес, здоровье, продуктивность). Для исследования пригодна печень, хранившаяся в замороженном состоянии (1 - 5°) не более 2 суток или при температуре +10° - +15° - не более 2 часов.

    2 г печени тщательно растирают в ступке с кварцевым песком, переносят в
колбу  на  250 мл,  заливают  75 мл  40-процентной  метафосфорной кислоты и
выдерживают на  кипящей водяной бане 45 мин. Затем охлаждают, доводят объем
до 100 мл и фильтруют.  Для  дальнейшей работы берут 50 - 70 мл фильтрата с
точным  учетом  объема.  Для  адсорбции  фолиевой   кислоты   добавляют   к
фильтрату  100 мг   предварительно  подготовленного  активированного  угля,
кипятят 5 мин. при помешивании  и  отфильтровывают  под вакуумом на фильтре
Шотта N 3. Уголь 5 раз  промывают  на  том  же  фильтре  Шотта  N 3 горячим
(60 - 70°)  30-процентным  раствором  аммиака.  Общее  количество  раствора
аммиака 70 мл. Из них на первую  колбу  берут  20  мл, на вторую и третью -
по 15 мл, на четвертую и пятую - по 10 мл. Все порции фильтрата соединяют в
цилиндре и их выпаривают на водяной бане  примерно 10 - 15 мл, а оставшуюся
часть охлаждают. Затем доводят  до  pH 3,0 25-процентным раствором уксусной
кислоты и добавляют по каплям 4-процентный  раствор KMnO  до   исчезновения
                                                        4
розовой   окраски.   Выдерживают   10 мин.,   затем   добавляют  по  каплям
3-процентный раствор перекиси водорода до обесцвечивания, доводят pH до 4 -
4,5, замеряют объем, фильтруют и флюорометрируют.

Интенсивность флюоресценции испытуемого образца сравниваем с интенсивностью флюоресценции стандартного раствора фолиевой кислоты.

Рабочий стандартный раствор: 1 мл основного стандартного раствора фолиевой кислоты разводят дистиллированной водой до 10 мл и доводят pH до 4,5 25-процентным раствором уксусной кислоты. Общий объем полученного раствора не должен превышать 10 мл (в 1 мл стандартного раствора содержится 2 мкг фолиевой кислоты). Холостую пробу обрабатывают так же, как и опытную, но без испытуемого образца.

Расчет по формуле:

                           (А - В) х С х Е

                       Х = --------------- = мкг/г,
                                а х д

где:

А - показания флюорометра для испытуемого образца;

В - -"- для холостого опыта;

С - объем вытяжки в мл, идущий на измерение флюоресценции;

Е - содержание фолиевой кислоты в стандартном растворе в мкг в 1 мл (2 мкг);

а - количество печени в г в исследуемой вытяжке;

Д - показания флюорометра для стандартного раствора.

Диагностика гиповитаминоза C. Диагноз ставят на основании клинических и патологоморфологических признаков и биохимического определения аскорбиновой кислоты в печени птиц.

Патологоанатомические изменения

У молодняка птиц они характеризуются геморрагическими явлениями, нарушением роста и явлениями анемии.

Кровоизлияния и кровоподтеки обнаруживаются на кожных покровах, слизистых оболочках, в подкожной клетчатке, в мышцах и в области суставов.

У взрослых птиц наблюдается изменение бедренных и берцовых костей в виде остеопороза.

Лабораторная диагностика

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА C В ПЕЧЕНИ

Принцип метода. Метод основан на восстановлении аскорбиновой кислотой трехвалентного железа в двухвалентное и комплексирование последнего 2,2'-дипиридилом.

Реактивы. 5-процентный раствор трихлоруксусной кислоты, 85-процентная фосфорная кислота, 3-процентный водный раствор хлорного железа (готовится через каждые 3 дня на бидистиллированной воде), 1-процентный водный раствор 2,2'-дипиридила (к 0,5 г 2,2'-дипиридила прибавить 4 мл спирта, перенести в мерную колбу на 50 мл и долить бидистиллированной водой до метки). Все реактивы должны быть х.ч.

Посуда и оборудование. Стеклянные колбы на 100 мл, центрифужные пробирки, пипетки на 0,1; 2; 1 мл, ножницы, ФЭК.

Ход определения. К 1 грамму размельченной ножницами печени, помещенной в колбу, добавляют 19 мл охлажденного раствора 5-процентной ТХУ, встряхивают в течение 1 минуты, выдерживают 14 мин. на холоду (в холодильнике). Часть содержимого колбы (7 - 8 мл) переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 мин. при 1500 об./мин. Для анализа берут 1,5 мл надосадочной жидкости, прибавляют 0,1 мл 85-процентного раствора ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 3-процентного хлорного железа, 0,8 мл 2,2'-дипиридила. Содержимое пробирки после каждого добавления реактива тщательно встряхивают и оставляют на 30 мин. для проявления окраски. В контроль вместо надосадочной жидкости берут 1,5 мл 5-процентной трихлоруксусной кислоты.

По истечении 30 мин. пробы центрифугируют 5 мин. при 1500 об./мин. и измеряют плотность окраски на ФЭКе при зеленом светофильтре N 5, в кювете 5 мм против контрольной пробы.

Калибровочную кривую строят на основе серии разведений различной концентрации из основного раствора, содержащего 50 мг процентной аскорбиновой кислоты. По 1,5 мл каждого разведения вносят в центрифужные пробирки и прибавляют по 0,1 мл 85-процентной ортофосфорной кислоты, 0,8 мл 1-процентного 2,2'-дипиридила, 0,1 мл 3-процентного хлорного железа, оставляют на 30 мин. для проявления окраски в затемненном от света месте. Перед колориметрированием пробирки центрифугируют 5 мин. при 1500 об./мин. Полученные результаты изображают графически на миллиметровой бумаге.

Установлено, что стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки, их необходимо готовить непосредственно перед исследованием.

Содержание витамина C в печени при хранении снижается.

Расчет витамина C ведется по формуле:

             А х 20 х 100
    мг% АК = ------------,
                 1,5

где:

А - содержание аскорбиновой кислоты, найденное по калибровочной кривой;

20 - разведение;

100 - коэффициент пересчета в %;

1,5 - мл фильтрата.

ПРОФИЛАКТИКА БОЛЕЗНЕЙ ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Особое место в профилактике болезней витаминной недостаточности отводится оптимальным параметрам микроклимата, условиям содержания и обеспеченности птиц полноценными и качественными кормами как в биологическом, так и санитарном отношении.

От соблюдения этих параметров зависит состояние здоровья птиц, их продуктивность и качество птицеводческой продукции.

Однако получаемые птицеводческими хозяйствами комбикорма не соответствуют определенным требованиям из-за недостатка стабилизированных, сыпучих, легкодозируемых, смешиваемых и равномерно распределяемых в корме биологически активных препаратов, без учета их активности и лабораторного контроля.

Поэтому практика убедила птицеводов в необходимости ввода витаминов в кормовые смеси непосредственно в хозяйствах, несмотря на то, что они вносятся в виде витаминно-минерального премикса на комбикормовых предприятиях.

В то же время нормативные добавки витаминов в рационы не всегда равнозначны оптимальной потребности организма птиц в них, так как потребность сельскохозяйственных птиц в отдельных витаминах увеличивается или уменьшается при изменении компонентов рациона, добавлении в корма жировых и белковых ингредиентов или лечебных препаратов, обладающих антивитаминным действием, влиянием на птицу стрессоров.

Анализ кормов и рационов - один из основных приемов технологического контроля полноценности кормления. Здесь должна учитываться фактическая их питательность, энергопротеиновое отношение и обеспеченность биологически активными веществами (витамины, микро- и макроэлементы). Обогащение рационов добавками витаминов непосредственно в хозяйствах должно осуществляться в соответствии с физиологической потребностью птиц и по результатам биохимических исследований содержания витаминов в депонирующем органе.

При доработке кормов в хозяйствах необходимо соблюдать следующие требования:

а) количество добавляемого в рацион того или иного витамина не должно превышать суточную потребность;

б) обязательная эмульгация жирорастворимых витаминов и растворение в воде витаминов группы B, равномерное смешивание их с наполнителем и остальным кормом;

в) кормовые смеси, обогащенные нестабилизированными жирорастворимыми витаминами, должны скармливаться в летнее время не позже 24 часов, а в зимнее - не более 36 - 48 часов.

В тех хозяйствах, в которых наряду с витаминами добавляются сернокислые соли микроэлементов, их скармливание необходимо производить раздельно. Для этих целей предлагается следующая технология их ввода в корма: по четным числам вводится витаминный премикс, а по нечетным минеральный или наоборот. В результате такого подхода в доработке кормов снижается в 2 раза расход витаминов и микроэлементов, уменьшается нагрузка на организм птиц и повышается резистентность, жизнеспособность и продуктивность птиц.

В профилактике болезней витаминной недостаточности немаловажное значение занимает обеспеченность птиц, особенно родительского стада, качественной травяной мукой и комбинированным силосом.

Использование комбинированного силоса (травяная мука, измельченная морковь или тыква) в кормлении мясных птиц родительского стада (утки, индейки, гуси) полностью профилактирует болезни витаминной недостаточности, повышает биологическую полноценность инкубационного яйца, увеличивает сохранность молодняка и сокращает расход на 25 - 35% зерновой части комбикорма.

ПРОФИЛАКТИКА ГИПОВИТАМИНОЗА A

Для предупреждения гиповитаминоза A в рацион птицы при комбинированном типе кормления вводят травяную муку хорошего качества (содержание каротина не ниже 100 мкг/г), морковь и силос, а при сухом типе кормления добавляют препараты витамина A (микровит, концентрат витамина A разной активности) и травяную муку.

Нормы обогащения рациона сельскохозяйственной птицы стабилизированным витамином A из расчета на тонну корма составляет в нашей стране от 7 до 15 млн. ИЕ. Они значительно выше, чем в зарубежных странах с развитым птицеводством и даются с учетом на возможные стрессовые ситуации.

Высокие дозы витамина A в рационе птиц, превышающие физиологические в 2 - 3 раза, ингибируют обмен витаминов E и K, ослабляют всасывание каротиноидов, замедляют рост и развитие молодняка птиц.

ПРОФИЛАКТИКА ГИПОВИТАМИНОЗА E

При дефиците витамина E в организме птиц развиваются необратимые изменения в жизненно важных органах (головной мозг, миокард, печень), поэтому основой борьбы с этим нарушением обмена веществ могут быть лишь профилактические мероприятия.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: