- Законы
- Кодексы
- Форум
Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей
Утверждаю
Начальник Главного управления
ветеринарии Госагропрома СССР
А.Д.ТРЕТЬЯКОВ
13 февраля 1987 года
Начальник Главного управления
карантинных инфекций
Министерства здравоохранения СССР
В.П.СЕРГИЕВ
4 сентября 1986 года
В разработке "Методических рекомендаций по лабораторной диагностике листериоза животных и людей" принимали участие специалисты Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Госагропрома СССР и научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Диагноз - листериоз ставят на основании комплекса эпизоотологических или эпидемиологических данных, клинических признаков, патологоанатомических и патологогистологических изменений, а также результатов лабораторного исследования (схема 1, Приложение 10.1). Решающее значение принадлежит бактериологическому исследованию - выделению культуры листерий. Серологические методы (РА, РНГА, РСК) применяют для выяснения эпизоотической ситуации в хозяйствах, где диагноз на листериоз поставлен комплексным методом с выделением культуры.
1.2. Для исследования в лабораторию направляют трупы мелких животных или голову (головной мозг), паренхиматозные органы (часть печени, селезенку, почку, пораженные участки легких), абортированный плод или его оболочки.
1.3. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют истечения из половых органов абортировавших самок, молоко из пораженных долей вымени при наличии мастита - для бактериологического исследования; кровь или сыворотку крови от больных и подозрительных по заболеванию животных - для серологического исследования.
1.4. При подозрении на листериоз у людей исследованию подвергают слизь из носоглотки и зева - при ангинозной форме; выделяемое из глаз - при глазной форме; кровь и ликвор - при септической форме, менингитах и менингоэнцефалитах; меконий - при заболевании новорожденных; околоплодную жидкость, плаценту, отделяемое родовых путей - у женщин, родивших мертвых или больных детей.
1.5. Показания для взятия материала у людей на исследование:
1.5.1. У женщин вне беременности: повторные ангины, воспаление яичников, шейки матки, отягощенный акушерский анамнез.
1.5.2. У беременных женщин: отягощенный акушерский анамнез, патологическое течение беременности (гриппоподобные заболевания, токсикозы, ангины, усиленное выделение из влагалища).
1.5.3. У рожениц: отягощенный акушерский анамнез, патологическое течение родов.
1.5.4. У новорожденных с подозрением на листериоз: обязательное бактериологическое исследование мекония.
1.5.5. От трупа мертворожденного или погибшего в первые дни жизни: необходимо взять кусочки мозга, печени, селезенки для посевов.
1.6. Рекомендуется в первую очередь исследовать кровь, ликвор, меконий, околоплодную жидкость, слизь из носоглотки.
1.7. После смерти возбудитель может быть обнаружен в печени, селезенке, лимфоузлах, в головном и продолговатом мозге, мозжечке, а также в других органах.
1.8. Материал для исследования в свежем или консервированном (в 30-процентном водном растворе глицерина) виде упаковывают в полиэтиленовые пакеты, помещают в ящик или контейнер, опечатывают и вместе с сопроводительным документом направляют в лабораторию.
В сопроводительном документе указывают наименование и адрес отправителя, опись проб патологического материала, эпизоотологические (эпидемиологические) данные.
2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
2.1. Бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурально-биохимическим, тинкториальным и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных.
2.2. Учитывая возможность существования нетипичных вариантов листерий, бактериологическое подтверждение считается обязательным для определения наличия возбудителя и распространения листериозной инфекции.
2.3. Микроскопическое исследование.
2.3.1. Микроскопическому исследованию подвергают мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков чистым предметным стеклом 3 - 4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из патматериала, а также после подращивания его проб при 37 °C в течение 4 - 6 часов.
2.3.2. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флюоресцирующих антител согласно п. п. 4.6.2 - 4.6.3.
2.3.3. Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes - грамположительная подвижная неспорообразующая полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5 - 2,0 мкм.
2.4. Бактериологическое исследование.
2.4.1. Из органов и обязательно головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физрастворе в соотношении 1:5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычные среды с добавлением 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина или печеночный агар и бульон (pH среды 7,2 - 7,4), а также кровяной агар и элективные среды (Приложение 10.2).
2.4.2. В качестве дополнительного метода при отрицательном результате первичного посева рекомендуется часть исследуемого материала поместить в холодильник и хранить в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней. При хранении в холодильнике при +4 °C патологического материала, помещенного в глицерин, происходит размножение и накопление листерий. Рекомендуется хранение суспензии исследуемого материала в холодильнике в физиологическом растворе или мясопептонном бульоне (МПБ) с добавлением полимиксина 15 - 25 ЕД/мл для задержки роста контаминантов.
2.4.3. При исследовании абортированных плодов посевы делают из содержимого желудка и внутренних органов.
При исследовании истечений из половых органов, молока и силоса (Приложение 10.6) посевы проводят на печеночный агар в чашках и МПБ с 10% хлорида натрия, из которого потом делают пересевы на твердые среды.
2.4.4. Посевы инкубируют в термостате при 37° с ежедневным просмотром в первые 3 - 4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение двух недель.
2.4.5. Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бета-гемолиза на кровяном агаре. Колонии листерий в проходящем свете имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру.
2.4.6. Из выделенной культуры делают мазки, окрашивая их по Граму, а также для люминесцентной микроскопии с применением прямого и непрямого метода флюоресцирующих антител согласно п. п. 4.6.2 - 4.6.3.
2.4.7. При получении смешанной культуры ее очищают общепринятыми методами (отсев отдельных характерных колоний, дробный рассев на 2-процентный мясопептонный агар (МПА) в чашках), а также путем заражения молодых мышей согласно п. 3.
3. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
3.1. Биологическое исследование проводят на 2 - 3 белых мышах (масса 14 - 16 г). Животных заражают под кожу или внутрибрюшинно суспензией из головного мозга и внутренних органов или культурой в дозе 0,3 - 0,5 мл. При положительной биопробе животные погибают через 2 - 6 суток после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть. При наблюдении более 10 дней рекомендуется дополнительно делать посев из головного мозга. Очень чувствительны к подкожному заражению 5 - 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18 - 36 часов.
3.2. Для повышения эффективности биопробы белым мышам за 3 - 4 часа до заражения суспензией патматериала или культурой листерий инъецируют внутримышечно кортизон в дозе 5 мг.
3.3. К заражению листериями восприимчивы и кролики. Показательно внутривенное заражение кроликов культурой листерий в дозе 0,5 - 1 млрд. микробных тел (по стандарту мутности), при этом количество моноцитов в крови зараженных животных увеличивается в несколько раз. Это является дополнительной характеристикой возбудителя болезни.
3.4. Из внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце) павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды.
Срок наблюдения за подопытными животными - 14 суток.
4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ
4.1. Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли, а также посевом методом укола в полужидкий МПА. На подвижность исследуют 6 - 18-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре (22 °C). Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью.
4.2. Для определения ферментативных свойств чистую бульонную культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, маннит, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза), который выдерживают при 37 °C в течение 10 дней. Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, трегалозу, салицин и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу, маннит.
4.3. Проба на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленной 5-процентной перекиси водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель перекиси водорода. При наличии фермента каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пена).
Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий при дифференциации от возбудителя рожи свиней.
4.4. Определение чувствительности листерий к бактериофагам.
4.4.1. Диагностический набор лиофилизированных листериозных бактериофагов включает два монофага - L2A и L4A. Набор бактериофагов позволяет идентифицировать более 85% культур листерий, однако могут быть выделены штаммы листерий, которые не лизируются данными фагами.
4.4.2. Перед применением содержимое ампул растворяют бульоном Мартена или МПБ в объеме, указанном на этикетке ампулы, и переносят в пробирки с соблюдением правил асептики. Растворенные бактериофаги не пригодны к использованию при наличии осадка, хлопьев или помутнения.
Не использованные в день исследования растворенные бактериофаги могут быть применены в дальнейшей работе в течение 5 - 10 суток при хранении в холодильнике (+2° - +6°) после предварительной проверки на отсутствие бактериального загрязнения.
Ампулы, пробирки и пипетки из-под бактериофага, а также выбракованный бактериофаг обезвреживают кипячением (не менее 30 минут).
4.4.3. Исследование проводят в бактериологических чашках, содержащих 2-процентный агар Мартена или МПА с глюкозой (0,5%), разлитый накануне или в день исследования. Перед нанесением испытуемой культуры поверхность агара необходимо подсушить. При подсушивании чашки открывают и переворачивают вверх дном. Агар, разлитый накануне, подсушивают 20 - 30 минут при комнатной температуре, а разлитый в день исследования - 1 - 1,5 часа при 37°.
Для идентификации используют 16 - 18-часовую агаровую культуру, выращенную при 37 °C. Ее засевают в бульон Мартена или МПБ с глюкозой (0,5%). Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры подращивают в термостате (37°) 4 часа. После этого бактериальную взвесь наносят газоном на поверхность подсушенного 2-процентного агара в бактериологических чашках. Каждую культуру подвергают не менее чем 2 - 3 параллельным исследованиям.
4.4.4. В одной чашке можно одновременно проводить испытания 2-х культур. Для этого поверхность агара делят пополам и на каждую из половин наносят по 0,1 мл исследуемых культур, которые распределяют равномерно отдельным шпателем по отмеченному участку агаровой пластинки. Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате (37°) 1 - 1,5 часа при слегка приоткрытой крышке.
4.4.5. Для исследования действия бактериофага на культуру листерий с целью ее идентификации на газон испытуемой культуры тонко оттянутой пастеровской пипеткой или бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофагов и отдельно каплю стерильного бульона (контроль).
Место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее одного сантиметра. Чашки после нанесения фага и бульона оставляют при комнатной температуре (22 - 23°) в затемненном месте.
4.4.6. Учет результатов проводят через 16 - 24 часа. Культуру признают листериями, если в месте нанесения одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона зона лизиса отсутствует.
4.4.7. Если лизис культуры выражен нечетко (едва заметно место нанесения капли бактериофага) или полностью отсутствует литическая реакция, культуры идентифицируют согласно п. 4.
4.5. Методика постановки реакции нарастания титра фага для обнаружения возбудителя листериоза в организме животных и людей, кормах и объектах внешней среды.
4.5.1. Реакция нарастания титра фага (РНФ) - быстрый специфический метод обнаружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения его культуры.
4.5.2. РНФ основана на свойстве так называемого индикаторного бактериофага строго специфично размножаться только в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра.
4.5.3. РНФ рекомендуется использовать в качестве основного метода для обнаружения листерий в кормах и объектах внешней среды, а также при диагностике листериоза.
4.5.4. Для исследования используют органы животных и людей, корма и объекты внешней среды.
4.5.5. В реакции применяют листериозные бактериофаги L2A и L4A. Штаммы листерий I (9 - 127) и II (9 - 72) серогруппы. Питательные среды, содержащие 0,5% глюкозы: мясопептонный бульон, 1,5-процентный и 0,7-процентный мясопептонный агар.
4.5.6. При постановке РНФ с пробами внутренних органов, кормов и почвы отвешивают 3 г исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 50 - 100 мл и добавляют 30 мл МПБ. Смесь в течение 5 - 10 минут встряхивают, затем 9 мл переносят в бактериологическую пробирку N 1 (опытная).
Для исследования воды ее наливают в количестве 8 мл в пробирку N 1 (опытная), в эту же пробирку добавляют 1 мл МПБ.
4.5.7. Бактериофаги используют в рабочем разведении (10000
фаговых корпускул в мл). Для этого их растворяют МПБ до исходного
объема, указанного на этикетке ампулы, а затем на МПБ отдельными
пипетками делают пять последовательных десятикратных разведений
4
(в последнем разведении титр бактериофага составит 1 x 10 ).
Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага L2A и L4A в рабочем разведении.
4.5.8. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на группу анализов, проводимых одновременно, в пробирку N 2 (контроль) вносят 9 мл МПБ.
4.5.9. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 мл смеси фагов в рабочем разведении (схема 2) и выдерживают их в течение 16 - 24 часов при комнатной температуре, после чего в пробирки добавляют по 1 мл хлороформа. Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 минут. Хлороформ оседает на дно, надосадочную жидкость подвергают дальнейшим исследованиям.
Схема 2
Схема постановки РНФ для обнаружения листерий
Исследуемый МПБ субстрат
------------------------------------------------
\/ ¦
----- ----- --+-¬
+---+ +---+ +---+
¦---¦ ¦xxx¦ ¦\\\¦
¦---¦ ¦xxx¦ ¦\\\¦
L-T-- LT-T- L-T--
¦ ---¬ ¦ ¦ ---¬ ¦
---------->+--+<-------- --------->+TT+<--------
¦ ¦ Смесь фагов ¦¦¦¦
---- L++-
N 1 опытная N 2 контроль смеси фагов
¦ ¦
\/ \/
инкубация в термостате при 23 °C в течение 16 - 24 часов
¦ ¦
\/ \/
обработка хлороформом 30 - 40 минут
¦ ¦
\/ \/
исследование методом агаровых слоев
---------------- ----------------
\/ \/ \/ \/
__ __ __ __
/ \ / \ / \ / \
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
\__/ \__/ \__/ \__/
L2A L4A L2A L4A
4.5.10. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 мл и переносят по 0,1 мл в две пробирки, содержащие по 0,9 мл МПБ (один ряд для обнаружения фага L2A, а другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно десятикратное разведение.
4.5.11. Готовят 1-миллиардную взвесь штаммов I и II серогруппы по стандарту мутности путем разведения суточной агаровой культуры в физиологическом растворе. Во все пробирки с разведенным материалом добавляют по 0,1 мл взвеси штамма I серогруппы для выявления фага L2A или штамма II серогруппы для обнаружения фага L4A.
Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа. Для чего накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри разливают по 10 мл 1,5-процентного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри и в день исследования, но в этом случае поверхность агара необходимо предварительно подсушить в течение 40 - 50 минут при 37° или 2 часов при комнатной температуре. Для второго слоя используют расплавленный и охлажденный до 48 - 50° 0,7-процентный МПА, который следует использовать в течение часа, так как позже он приобретает гелеобразную консистенцию и не пригоден для исследования.
Затем в пробирки пипеткой вносят по 2,5 - 3 мл расплавленного и охлажденного до 48 - 50° 0,7-процентного МПА. Содержимое быстро и тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают в чашку Петри. Смесь легким покачиванием чашки равномерно распределяют вторым слоем на поверхности 1,5-процентного МПА. Чашки оставляют на ровном месте на 20 - 30 минут (до застывания 0,7-процентного МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной температуре.
4.5.12. Учет реакции проводят через 16 - 24 часа инкубирования посевов.
В опытных пробах и контроле титра фага подсчитывают число негативных колоний во всех чашках. Негативные колонии - округлые, хорошо заметные на фоне бактериального роста, прозрачные участки, образующиеся в результате лизиса бактерий.
При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на чашках соответствующих разведений.
4.5.13. Результаты реакции оценивают по увеличению титра бактериофага (количества негативных колоний):
увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений) оценивается как положительный результат, менее чем в 5 раз - отрицательный;
сплошной лизис или лизис с островками оценивается как положительный результат.
4.5.14. При получении положительного результата РНФ дают заключение, что в исследуемом материале (пробе) обнаружен возбудитель листериоза.
При получении отрицательного результата РНФ для окончательной постановки диагноза необходимо провести бактериологическое исследование материала.
4.6. Люминесцентно-серологическое исследование.
4.6.1. Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого (ПМФА) и непрямого методов флюоресцирующих антител (НМФА). С помощью этих методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность.
4.6.2. Окраска по прямому методу флюоресцирующих антител.
4.6.2.1. Для проведения исследования необходимо иметь:
- флюоресцирующие сыворотки против листерий сероваров 1, 4а, 4в;
- нефлюоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель, приготовленный из диметилфталата чистого 100 мл, нафталина сублимированного 1,75 г или тимола чистого 5,0 г;
- глицерин с фосфатным буфером pH 8,0 (1 часть глицерина нейтрального и 9 частей фосфатного буфера);
- физиологический раствор хлорида натрия с фосфатным буфером pH 7,4, приготовленный следующим образом: на аналитических весах отвешивают 9,078 г химически чистого однозамещенного фосфата калия, помещают его в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1 л; затем отвешивают 11,876 г двузамещенного фосфата натрия и в другой мерной колбе доводят дистиллированной водой до объема 1 л. При использовании двузамещенного фосфата натрия, содержащего 12 молекул воды, для получения 1 л раствора берут навеску 23,752 г, а безводного препарата - 9,476 г. Для получения буфера pH 7,4 смешивают 4 части раствора двузамещенного фосфата натрия и 1 часть раствора однозамещенного фосфата калия. Полученный буфер добавляют к физиологическому раствору (8,750 г хлорида натрия на 1 л дистиллированной воды) в соотношении 1:50. Если при смешении растворов фосфатов 4:1 не получают нужный pH, то изменяя соотношение растворов, достигают необходимой величины pH (при повышенной кислотности добавляют двузамещенный фосфат натрия, а при щелочном pH добавляют однозамещенный фосфат калия). Если при добавлении буфера в соотношении 1:50 к физиологическому раствору последний будет иметь pH ниже 7,4, то увеличением количества добавляемого буфера добиваются нужной реакции физиологического раствора;
- спирт этиловый, 96°;
- покровные стекла толщиной не более 0,2 мм;
- предметные стекла, нелюминесцирующие и хорошо обезжиренные.
Перед применением флюоресцирующие сыворотки разводят дистиллированной водой до рабочего разведения. Сыворотки в рабочем разведении могут храниться при температуре 2 - 4° в течение 2-х недель.
4.6.2.2. Определение возбудителя в культуре. Для исследования используют 18 - 24-часовые чистые или смешанные культуры, из которых готовят по два мазка на отдельных предметных стеклах для обработки листериозными люминесцирующими сыворотками.
Густые мазки для исследования непригодны, так как микробы в них могут светиться менее интенсивно. Мазки готовят средней густоты (несколько десятков микробов в поле зрения микроскопа) размером не более 1 кв. см.
Место нанесения культуры очерчивают карандашом по стеклу с обратной стороны, подсушивают мазки на воздухе, маркируют и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 минут; мазки для фиксации погружают в вертикальном положении в стеклянный сосуд со спиртом. Каждое стекло отделяют металлической проволочкой или стеклянной палочкой.
После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физиологическим раствором хлорида натрия с фосфатным буфером pH 7,4.
На слегка подсушенный мазок наносят 1 - 2 капли соответствующей люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Мазки с сывороткой помещают во влажную камеру (в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) и выдерживают в термостате при температуре 37° в течение 30 минут. Затем сыворотку отмывают, погружая мазки в кювету, содержащую физиологический раствор с фосфатным буфером pH 7,4, на 20 минут. Раствор в кювете периодически помешивают и меняют через 10 минут.
Отмытые мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Для быстроты высушивания можно использовать настольный вентилятор.
На поверхность мазка наносят небольшую каплю глицерина с буфером pH 8,0, накрывают покровным стеклом, излишек глицерина удаляют.
На покровное стекло наносят нефлюоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель и производят люминесцентную микроскопию. Люминесцентный микроскоп рекомендуется устанавливать в хорошо вентилируемой комнате с частично затемненным окном или в затемненной части комнаты.
Диагностическая оценка интенсивности свечения возбудителя листериоза.
Степень свечения оценивается по следующим показателям:
"++++" - ярко выраженное золотисто-зеленоватое свечение, четко заметны морфологические особенности бактерий, хорошо видна темная центральная зона клетки;
"+++" - яркое свечение, хорошо заметны цвет и морфологические особенности клетки;
"++" - выраженное свечение, но меньшей интенсивности;
"+" - заметное, но слабое свечение, цвет неясен, морфологические особенности различаются плохо;
"-" - свечение не обнаруживается.
Свечение бактериальных клеток на 4 и 3 креста расценивается как положительный результат.
4.6.2.3. Обнаружение возбудителя в патологическом материале.
Материал для исследования должен быть свежим.
Для люминесцентной микроскопии из паренхиматозных органов готовят суспензию на физиологическом растворе в соотношении 1:5. После осаждения крупных частиц в суспензии из разных участков ее поверхности готовят по 2 - 3 мазка.
Мазки из головного и костного мозга готовят отдельно и после фиксации спиртом дополнительно обезжиривают ацетоном в течение 5 минут, меняя его 2 - 3 раза. Дальнейшую обработку препаратов и люминесцентную микроскопию выполняют согласно п. 4.6.2.2.
При обнаружении возбудителя с типичной морфологией, специфическим свечением и интенсивностью не ниже чем на три креста ставят положительный люминесцентно-серологический диагноз.
4.6.3. Окраска по непрямому методу флюоресцирующих антител.
4.6.3.1. Для постановки реакции необходимо иметь:
- материал для исследований (антиген) в виде микробной бульонной или агаровой культуры (500 млн. микробных тел/мл), выращенной при 22 - 37° в течение 16 часов или мазков-отпечатков из органов и тканей павшего (убитого) животного;
- гипериммунные кроличьи сыворотки: листериозные - серогрупповые и поливалентную;
- флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика;
- метиловый или этиловый спирт 96°;
- глицерин на забуференном физиологическом растворе 1:10 (pH 7,2 - 7,4);
- дистиллированную воду;
- нефлюоресцирующее иммерсионное масло;
- тонкие, обезжиренные предметные стекла.
Для приготовления рабочего разведения сухую флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. После растворения сыворотку центрифугируют при 3000 - 6000 оборотах в минуту в течение 30 минут для удаления крупных конгломератов.
Разведенную сыворотку хранят в пробирке с резиновой пробкой или в запаянной ампуле при температуре +4° в течение 2 недель. Перед нанесением на препарат флюоресцирующую сыворотку необходимо развести физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,4) в соответствии с указанным на этикетке ампулы рабочим разведением в нужном для работы объеме. Разведенная до рабочего разведения сыворотка используется в тот же день.
4.6.3.2. Методика приготовления препаратов для люминесцентной микроскопии:
- мазок из бактериальной культуры или тонкий мазок-отпечаток из органов высушивают на воздухе в течение 1 минуты и фиксируют этиловым или метиловым спиртом также в течение 1 минуты;
- наносят каплю гипериммунной листериозной кроличьей сыворотки, покрывают (разрезанным на 4 части 1 x 1 см) покровным стеклом на 5 минут при температуре 20 °C. Затем покровное стекло снимают и в течение 20 - 30 секунд препарат промывают дистиллированной водой. После этого препарат высушивают в сушильном шкафу при температуре 60 - 70° в течение 2 минут;
- наносят одну каплю флюоресцирующей сыворотки против глобулинов кролика, покрывают покровным стеклом (разрезанным на 4 части 1 x 1 см) - экспозиция 5 минут при температуре 20°. Снимают покровное стекло и под сильной струей водопроводной воды промывают препарат 5 - 10 минут;
- препарат высушивают в сушильном шкафу при температуре 60 - 70° в течение 2 минут.
Затем на препарат наносят каплю жидкости (одна часть нейтрального глицерина и 9 частей физраствора, забуференного фосфатным буфером pH 7,2 - 7,4), накрывают покровным стеклом, на которое наносят одну каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла, и исследуют под люминесцентным микроскопом (объектив 90, окуляр 5, 7, 10) с системой светофильтров (ФС-1-4, БС-8-2).
4.6.4. Для обнаружения листерий в органах и тканях мазки обрабатывают поливалентной сывороткой, а для серологической типизации листерий готовят несколько мазков, половину которых обрабатывают сывороткой первой серогруппы, а другую половину - сывороткой второй серогруппы.
4.6.5. При исследовании материала необходимо ставить контроли с нормальной сывороткой, проверенной на отсутствие листериозных антител, и с заведомо известной листериозной культурой.
Обязательным контролем следует считать препарат с листериями, обработанный только люминесцирующей антивидовой сывороткой.
4.6.6. Клетки листерий, обработанные гомологичной листериозной сывороткой, обладают свечением, в то время как бактерии, обработанные гетерологичной листериозной сывороткой, не светятся при исследовании в люминесцентном микроскопе. Бактерии других видов, обработанные листериозной сывороткой, также не светятся.
4.6.7. При использовании метода флюоресцирующих антител для контрастирования фона препарат можно одновременно с флюоресцирующей сывороткой окрашивать бычьим альбумином, меченным родамином, в соответствии с Временным наставлением на его применение, утвержденным Минздравом СССР 14 апреля 1962 г. Совместное применение флюоресцирующей сыворотки и альбумина значительно повышает чувствительность и надежность иммунофлюоресцентного анализа - меченый альбумин снижает неспецифическое свечение фона, сообщая посторонним бактериям и тканям, а также прочим органическим частицам, содержащимся в препаратах, оранжево-красное неспецифическое свечение, на фоне которого листерии выделяются сияющим зеленоватым цветом.
4.7. Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды; метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий.
Исследуемую бульонную культуру или смыв агаровой культуры засевают в объеме 2 - 4 капель не менее чем на две из пяти следующих индикаторных сред: с лакмусом, нейтраль-ротом в смеси с метиленовой синью, метил-ротом, конго-ротом, амидо-черным (приготовление сред см. Приложение 10.2.1). Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38° вместе с контрольными (незасеянными) средами. Результат учитывают через 3 - 6, 24, 48 часов.
Возбудитель листериоза через 3 - 6 часов обесцвечивает среду с лакмусом и среду с нейтраль-ротом в смеси с метиленовой синью до цвета бульона, лишь у поверхности на границе с воздухом остается окрашенный ободок. При встряхивании цвет частично восстанавливается, поэтому посевы просматривают, не встряхивая пробирки.
Среда с метил-ротом обесцвечивается через 3 - 6 часов, но восстановление цвета среды не происходит.
Обесцвечивание сред с конго-ротом и с амидо-черным происходит в более поздние сроки: через 6 - 48 часов, при этом исходный цвет среды после обесцвечивания не восстанавливается.
Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.
4.8. Серологическая идентификация листерий.
4.8.1. Поливалентная листериозная агглютинирующая сыворотка представляет собой смесь кроличьих листериозных агглютинирующих сывороток и содержит факторы (антитела) Н-АВ и 0 - II, V, VI, VII, IX. Поливалентная сыворотка в капельной реакции агглютинации на стекле агглютинирует все известные серовары листерий. Серогрупповые сыворотки агглютинируют культуры листерий соответствующих серогрупп. Сыворотка 1-го серовара ("1-я серогруппа") содержит 0-фактор II, а сыворотка 4-го "в" серовара ("2-я серогруппа") - 0-факторы V, VI.
4.8.2. Предназначенную для идентификации чистую 24-часовую бульонную культуру, выращенную при 37°, платиновой петлей засевают частым штрихом на 2 пробирки обычного МПА так, чтобы получить рост по всей поверхности агара, и выращивают в темном месте при комнатной температуре (18 - 26 °C) в течение 24 - 30 часов. Затем агаровую культуру смывают небольшим количеством физраствора, чтобы получить густую взвесь (10 - 15 млрд. микробных клеток в 1 мл).
4.8.3. Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах. На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физраствора. К обеим каплям на стекле добавляют по одной капле смыва культуры, смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекла плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно для контроля один раз в день исследуют на стекле каплю сыворотки с добавлением капли физраствора.
4.8.4. Учет результатов РА проводят в течение 3-х минут. Реакция считается положительной при появлении четкой агглютинации (образование хлопьев) в капле с сывороткой при ее отсутствии в контроле. Запоздалые реакции не учитывают.
4.8.5. Исследуемую культуру признают листериями при получении положительной реакции с поливалентной сывороткой и отсутствии агглютинации в контроле с физраствором, а также наличии характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств.
4.8.6. При наличии самоагглютинации РА ставят повторно по указанной выше методике, но при посеве на МПА в качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре, что предотвращает самоагглютинацию.
4.8.7. С помощью сероваровых ("серогрупповых") сывороток определяют серовар ("серогруппу") идентифицированных культур листерий. С этой целью чистую бульонную 24-часовую культуру листерий засевают на 1 - 2 пробирки МПА, как указано в п. 4.8.2, и выращивают при 37° 18 - 24 часа. Смыв с агаровой культуры делают так же, как и для РА с поливалентной сывороткой, и исследуют в РА одновременно с сыворотками 1-го и 4-го "в" сероваров. Техника постановки и учета РА описана в п. п. 4.8.3 - 4.8.4.
4.8.8. Положительная РА с сывороткой 1-го серовара свидетельствует о принадлежности культуры к 1-му серовару ("1-я серогруппа"), а положительная РА с сывороткой 4-го "в" серовара указывает на принадлежность ее к 4-ому "в" серовару ("2-я серогруппа") листерий. В случае отрицательных или сомнительных показаний РА с сыворотками обоих сероваров, что возможно в результате изменчивости (диссоциации) культуры, для определения ее сероваровой ("серогрупповой") принадлежности ставят пробу роста.
4.8.9. Для постановки пробы роста используют обычный МПБ в пробирках по 4 - 5 мл с добавлением 1% - 1,25% стерильной сероваровой сыворотки, проверенной на стерильность путем экспозиции в термостате в течение 24 часов.
4.8.10. Для постановки пробы роста выращенную при 37° суточную бульонную культуру листерий пересевают платиновой петлей на две пробирки МПБ - одну пробирку с сывороткой 1-го и одну пробирку с сывороткой 4-го "в" серовара, которые инкубируют при температуре 37° в течение 24 - 48 часов.
4.8.11. Если культура является смесью двух сероваров ("серогрупп"), то из верхнего слоя бульона каждой пробирки производят посев на МПА с целью получения изолированных колоний. Полученную из изолированной колонии каждой пробирки культуру снова испытывают по описанной выше методике в РА с сероваровыми сыворотками. При этом из пробирки с сывороткой 1-го серовара выделяют культуру 4-го "в" серовара ("2-я серогруппа"), а из пробирки с сывороткой 4-го "в" серовара - культуру 1-го серовара ("1-я серогруппа"). Таким образом, с помощью пробы роста удается разделить смесь культур листерий двух серогрупп.
4.9. Специфические свойства листерий проверяют также конъюнктивальной пробой на морских свинках или дермонекротической пробой на морских свинках или кроликах.
4.9.1. Конъюнктивальная проба. На конъюнктиву глаза морской свинки наносят 2 капли испытуемой бульонной культуры с последующим легким массажем век ватным тампоном. Вирулентные штаммы листерий на 2 - 4 день вызывают у морской свинки гнойный кератоконъюнктивит. Пробу с каждым штаммом желательно ставить не менее чем на двух морских свинках.
4.9.2. Дермонекротическая проба. В тщательно выстриженный участок кожи бока морской свинки или кролика внутрикожно вводят 0,3 - 0,5 мл бульонной культуры. Через 24 - 48 часов возникает воспаление с последующим некрозом и образованием струпа.
На одной морской свинке можно ставить конъюнктивальную и дермонекротическую пробу при изучении свойств одного штамма. При необходимости испытания нескольких культур в выстриженный участок кожи на правом и левом боку кролика можно инъецировать по 3 культуры с каждой стороны.
5. Для дифференциации возбудителя листериоза от возбудителя рожи свиней пользуются таблицей 1:
Таблица 1
-------------------------+----------------------+----------------- ¦ Признаки ¦Возбудитель листериоза¦ Возбудитель ¦ ¦ ¦ ¦ рожи свиней ¦ +------------------------+----------------------+----------------+ ¦Подвижность ¦Подвижен в молодой 6 -¦Неподвижен ¦ ¦ ¦18-часовой культуре, ¦ ¦ ¦ ¦выращенной при комнат-¦ ¦ ¦ ¦ной температуре ¦ ¦ ¦Лизис листериозным ¦Лизируется ¦Не лизируется ¦ ¦бактериофагом ¦ ¦ ¦ ¦Салицин ¦Разлагает ¦Не разлагает ¦ ¦Проба на каталазу ¦Положительная ¦Отрицательная ¦ ¦Индикаторные среды ¦Обесцвечивает ¦Не обесцвечивает¦ ¦РА с позитивной листери-¦Положительная ¦Отрицательная ¦ ¦озной сывороткой ¦ ¦ ¦ ¦Конъюнктивальная проба ¦Положительная ¦Отрицательная ¦ ¦на морских свинках ¦ ¦ ¦ ¦Дермонекротическая проба¦Положительная ¦Отрицательная ¦ -------------------------+----------------------+-----------------
6. Диагноз на листериоз считается установленным при получении положительного результата РНФ; обнаружении листерий в патматериале иммунофлюоресцентным методом, а также при выделении грамположительной полиморфной подвижной палочки, образующей каталазу и разлагающей с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, трегалозу и салицин; вызывающей (вирулентные штаммы) положительные конъюнктивальную и дермонекротическую пробы у морских свинок и кроликов; дающей положительную РА с листериозной сывороткой; лизирующейся листериозным бактериофагом; обладающей патогенностью для лабораторных животных (вирулентные штаммы).
7. ПАТОЛОГОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
7.1. Для патологогистологического исследования необходимо брать следующие материалы: кусочки головного мозга (все отделы), спинного мозга и паренхиматозных органов.
7.2. Материал фиксируют в 10-процентном растворе нейтрального формалина с последующим заключением в парафин и окраской гематоксилинэозином или в жидкости Карнуа с окраской по Браше, или в 96° этиловом спирте с окраской по Нисслю.
7.3. Гистологические изменения наиболее сильно проявляются в головном и спинном мозге, где хорошо выражены периваскулиты, состоящие из лимфоцитов и гистиоцитов; отек, дегенерация нейронов, нейронофагия, микроабсцессы и некротические очаги. Наличие микрофокусного энцефалита, проявляющегося очагами, состоящими из скопления моноцитарных и лимфоидных клеток с примесью сегментоядерных лейкоцитов, является отличительным признаком от энцефалита вирусного происхождения.
При септической форме болезни в печени, селезенке, надпочечниках обнаруживают гранулемы, состоящие из клеток лимфоидно-гистиоцитарного типа.
7.4. При гистологическом исследовании органов ягнят часто находят зернистую дистрофию клеток печени и почек; воспалительные изменения в тонком отделе кишечника и сычуге, мелкоочаговую бронхопневмонию.
7.5. Для экспрессной диагностики листериоза используют прямой или непрямой метод флюоресцирующих антител для выявления листерий в гистологических срезах проб органов и тканей животных и человека.
7.5.1. Для исследования необходимо иметь:
- листериозную культуру для контроля активности люминесцирующих сывороток;
- пробы органов и тканей для исследования, которые в случае хранения замораживают при -8 - -10 °C;
- люминесцирующую листериозную сыворотку (для прямого метода) или поливалентную листериозную кроличью сыворотку (если имеются, то и серогрупповые) и флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика;
- микротом с ножом глубокого охлаждения или микрокриостат (криостат);
- люминесцентный микроскоп;
- чистый ацетон;
- 0,15 М раствор хлорида натрия;
- смесь глицерина (1 часть) и 0,15 М NaCl (9 частей);
- нефлюоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель - диметилфталат;
- предметные и покровные стекла;
- 10-процентный формалин.
7.5.2. Если невозможно исследовать материал на месте, то кусочки органов и тканей размером 1 x 1, 5 x 2 см помещают в плотно закрываемую стеклянную тару и заливают 10-процентным формалином. В таком виде материал пересылают в лабораторию.
7.5.3. Для приготовления рабочих разведений сухую люминесцирующую сыворотку (для прямого метода) или флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика (для непрямого метода) сначала растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды.
При наличии осадка сыворотку центрифугируют. Перед нанесением на гистологические срезы тканей флюоресцирующую сыворотку разводят раствором 0,15 М хлорида натрия до рабочего титра, который указан на ампуле.
7.5.4. Методика приготовления гистологических срезов: из нефиксированных проб органов и тканей готовят на замораживающем микротоме с ножом глубокого охлаждения или криостате (микрокриостате) срезы толщиной не более 5 - 8 микрон в количестве 2 - 3 с каждой пробы; полученные срезы наклеивают на обезжиренные предметные стекла без клеящих растворов, фиксируют чистым ацетоном в течение 15 минут и подсушивают на воздухе; материал, фиксированный в 10-процентном формалине, режут на обычном замораживающем микротоме толщиной не более 5 - 8 микрон, срезы промывают 30 минут в физиологическом растворе и наносят на чистые обезжиренные предметные стекла с наклеивающей жидкостью (белок). Приготовленные срезы на предметных стеклах подсушивают при комнатной температуре или в термостате до полного высыхания.
7.5.5. Окрашивание срезов прямым методом люминесцирующих антител: на срезы наносят 2 капли флюоресцирующей листериозной сыворотки и препараты выдерживают во влажной камере (в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при комнатной температуре в течение 30 минут; препараты промывают 2 раза по 10 минут раствором 0,15 М хлорида натрия и 1 раз 10 минут дистиллированной водой, затем высушивают при температуре 35 - 40 °C в течение 15 - 20 минут.
7.5.6. Окрашивание срезов непрямым методом флюоресцирующих антител: на срезы наносят 1 - 2 капли поливалентной листериозной агглютинирующей кроличьей сыворотки, выдерживают в течение 60 минут во влажной камере пря комнатной температуре; сыворотку смывают в течение одной минуты физиологическим раствором хлорида натрия. Остатки раствора удаляют со стекла фильтровальной бумагой; наносят 1 - 2 капли флюоресцирующей сыворотки против глобулинов кролика в рабочем разведении и выдерживают 30 минут при комнатной температуре в закрытых чашках Петри; препараты промывают 2 раза по 10 минут физиологическим раствором хлорида натрия и 10 минут дистиллированной водой, а затем высушивают в термостате при 35 - 40 °С в течение 15 - 20 минут.
7.5.7. Для люминесцентной микроскопии окрашенные препараты (как прямым, так и непрямым методами) заключают в буферную смесь из 1 части глицерина и 9 частей 0,15 М NaCl. Гистологические срезы накрывают покровным стеклом, на которое наносят одну каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла (или диметилфталата) и исследуют в люминесцентном микроскопе.
7.5.8. Для контрастирования фона препарата при окрашивании гистологических срезов можно применять совместно с флюоресцирующей сывороткой бычий альбумин, меченный родамином (согласно наставлению по его применению), который окрашивает исследуемую ткань и постороннюю микрофлору в оранжево-красный цвет (различных оттенков). На этом фоне листерии четко выделяются специфическим золотисто-зеленоватым свечением.
7.5.9. В качестве контроля при исследовании проб органов и тканей необходимо ставить контроли с нормальной сывороткой, а также во всех случаях проводить окрашивание культуры листерий люминесцирующей сывороткой.
7.5.10. Оценку интенсивности свечения листерий проводят согласно п. 4.6.2.2.
Положительным результатом обнаружения листерий считается наличие светящихся клеток соответствующей для листерий морфологии, свечение которых оценивается на 4 и 3 креста.
8. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
Для серологического исследования берут пробы от животных любого возраста, подозреваемых в заболевании листериозом, а также от животных из поголовья, где заболевание подтверждено.
От каждого животного берут из яремной вены 5 - 10 куб. см крови в стерильные пробирки или используют кровь, полученную при убое животного.
Из отобранных проб крови получают сыворотку методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30 - 60 мин. при температуре 20 - 30 °C, а затем при температуре 4 - 10 °C. Сыворотка крови должна быть прозрачной, без признаков гемолиза.
Допускается консервировать сыворотку 5-процентным раствором карболовой кислоты (1 - 2 капли на 1 куб. см сыворотки) или сухой борной кислоты (2% кислоты к объему сыворотки).
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 суток со дня взятия пробы, сыворотки консервированные - в течение 30 суток.
8.1. Реакция агглютинации.
8.1.1. Реакцию агглютинации (РА) в диагностике листериоза применяют для исследования сывороток животных с целью обнаружения листериозных агглютинирующих макроглобулиновых (19S) и микроглобулиновых (7S) антител.
8.1.2. Результаты РА используют при постановке диагноза в комплексе с другими данными (бактериологическое исследование, эпизоотическая ситуация, клинические признаки, патологоанатомические изменения), а также для выявления скрыто больных и переболевших животных.
8.1.3. Компоненты реакции и условия их применения.
8.1.3.1. Для исследования используют консервированные и неконсервированные сыворотки крови без признаков гнилостного распада и гемолиза.
8.1.3.2. В реакции применяют антигены первой и второй серогрупп, представляющие собой взвесь инактивированных листерий, выпускаемые в лиофилизированном виде. Перед применением необходимо добавить к ним физиологический раствор pH 7,2 в количестве, указанном на этикетке. Разведенные антигены можно хранить при 4° в течение 1,5 - 2 месяцев. Перед употреблением антигены тщательно встряхивают.
8.1.3.3. Для контроля используют первую и вторую серогрупповые агглютинирующие листериозные сыворотки, содержащие 19S- и 7S-антитела, а также нормальную (отрицательную) сыворотку.
8.1.3.4. Для дифференцирования 19S- и 7S-антител используют 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) или солянокислый цистеин, которые избирательно разрушают макроглобулины (19S).
8.1.4. Постановка реакции агглютинации.
8.1.4.1. Испытуемые сыворотки исследуют параллельно с двумя антигенами. При исследовании сывороток крупного рогатого скота и лошадей реакцию ставят в разведениях 1:160 и 1:320, овец, коз и свиней - 1:80 и 1:160, кроликов - 1:20 и 1:40. Разведения сывороток делают в физиологическом растворе.
8.1.4.2. Реакцию проводят в объеме 1 мл. При исследовании сывороток кроликов в первую пробирку наливают 0,9 мл физиологического раствора, во вторую - 0,5 мл. Затем в первую пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки, перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую пробирку. Из второй пробирки 0,5 мл смеси удаляют. Получают разведение сывороток 1:10 и 1:20. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:20 и 1:40.
8.1.4.3. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей сначала готовят основное разведение сыворотки - 1:40, для чего в пробирки наливают 0,1 мл сыворотки и 3,9 мл физиологического раствора. Затем из полученного разведения готовят рабочие разведения сыворотки: наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем из нее удаляют 0,5 мл смеси, после чего в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:160 и 1:320.
8.1.4.4. При исследовании сывороток крови овец, коз и свиней готовят основное разведение сыворотки - 1:20 (0,1 мл сыворотки + 1,9 мл физиологического раствора). Для приготовления рабочих разведений наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси из нее переносят во вторую пробирку. Из второй пробирки удаляют 0,5 мл смеси. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают необходимое разведение сыворотки 1:80 и 1:160.
8.1.4.5. При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят следующие контроли:
- с отрицательной сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые;
- с положительной агглютинирующей сывороткой соответствующего серовара, содержащей 7S-антитела, в разведении до ее предельного общего титра;
- 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одну пробирку) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одну пробирку) - для контроля антигена.
8.1.4.6. Пробирки с испытуемыми и контрольными сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18 - 20 часов при 37°, затем при комнатной температуре в течение 1,5 - 2 часов, после чего учитывают результаты реакции.
8.1.5. Учет и диагностическая оценка реакции.
8.1.5.1. Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
"++++" - полное просветление жидкости при наличии четко выраженного зонтика, который при встряхивании разбивается на мелкие хлопья, комочки;
"+++" - те же явления, но надосадочная жидкость слегка опалесцирует;
"++" - просветление жидкости выражено слабее, имеется недостаточно четко сформированный зонтик, при встряхивании разбивается на мелкие хлопья и крупинки;
"+" - незначительное просветление при наличии зонтика, при встряхивании - мелкие крупинки и комочки;
"-" - отрицательная, отсутствие просветления и зонтика.
8.1.5.2. Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации с оценкой не менее чем на два креста в разведениях сыворотки 1:160 для овец, свиней и коз; 1:320 для крупного рогатого скота, лошадей; 1:40 для кроликов. Сыворотки, давшие отрицательную реакцию в указанных разведениях, подлежат дополнительной обработке 2-МЭ или солянокислым цистеином (см. пункты 8.1.6 - 8.1.7).
8.1.6. Обработка сывороток 2-МЭ.
8.1.6.1. 2-МЭ - бесцветная жидкость, обладающая запахом, поэтому работу с 2-МЭ проводят в вытяжном шкафу. Рабочий раствор 2-МЭ готовят непосредственно перед применением, разводя исходный препарат дистиллированной водой согласно титру, указанному на этикетке флакона.
8.1.6.2. Сыворотки крови кроликов разводят физиологическим раствором 1:5 (0,2 мл сыворотки + 0,8 мл физиологического раствора), сыворотки овец, коз и свиней - 1:10 (0,1 мл сыворотки + 0,9 мл физиологического раствора), сыворотки крови крупного рогатого скота и лошадей - 1:20 (0,05 мл сыворотки + 0,95 мл физиологического раствора).
8.1.6.3. Затем к 1 мл разведенной сыворотки добавляют 1 - 2 капли рабочего разведения 2-МЭ. Пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в водяную баню (37°) на 1 час. После этого сыворотку, обработанную 2-МЭ, разливают в 2 пробирки по 0,5 мл и в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую - 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение 1:10 для сывороток кроликов, 1:20 - овец, коз и свиней, 1:40 - для сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей.
8.1.6.4. При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят следующие контроли:
- с отрицательной сывороткой в том же разведении, как и испытуемые;
- с агглютинирующей сывороткой, содержащей 19S-антитела, в том же разведении, что и испытуемые;
- с агглютинирующей сывороткой, содержащей 7S-антитела, в разведении до предельного титра 7S-антител;
- 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одна пробирка) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одна пробирка) - для контроля антигена.
8.1.6.5. Агглютинирующие контрольные сыворотки обрабатывают 2-МЭ так же, как и испытуемые. Отрицательная сыворотка обработке 2-МЭ не подлежит.
8.1.6.6. Пробирки с контрольными и испытуемыми сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18 - 20 часов при 37°, затем при комнатной температуре 1,5 - 2 часа, после чего учитывают результаты реакции.
8.1.7. Обработка сывороток солянокислым цистеином.
Раствор цистеина готовят непосредственно перед применением. Для получения рабочего раствора цистеина 35,1 мг препарата растворяют в 1 мл 0,2 М NaOH. Для приготовления 0,2 М раствора едкого натра растворяют 8 г реактива в 1 л дистиллированной воды.
Сыворотки крови кроликов разводят в 2,5 раза (0,2 мл сыворотки + 0,3 мл физраствора), сыворотки овец, коз и свиней - 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл физраствора), сыворотки крупного рогатого скота и лошадей - 1:10 (0,05 мл сыворотки + 0,45 мл физраствора). Затем к 0,5 мл разведенной сыворотки добавляют 0,5 мл рабочего раствора цистеина. Пробирки закрывают резиновыми пробками и выдерживают в течение 18 - 20 часов в термостате при 37°. После этого сыворотку, обработанную цистеином, разливают в 2 пробирки по 0,5 мл, в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую - 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение сыворотки 1:10 для кроликов, 1:20 - для овец, коз и свиней и 1:40 - для крупного рогатого скота и лошадей.
Контроли реакции ставят как при обработке сывороток 2-МЭ с последующим выдерживанием испытуемых и контрольных проб при 37° (18 - 20 часов) и при комнатной температуре (1,5 - 2 часа).
8.1.8. Учет и оценка реакции после обработки сывороток 2-МЭ или солянокислым цистеином.
8.1.8.1. Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации с оценкой не менее чем на два креста в сыворотках, обработанных 2-МЭ или цистеином, в разведении 1:10 для кроликов, 1:20 - для овец, коз и свиней, 1:40 - для крупного рогатого скота и лошадей. При этом контрольная агглютинирующая сыворотка, содержащая 19S-антитела, должна дать отрицательную реакцию в том же разведении, а контрольная сыворотка, содержащая 7S-антитела, - положительную реакцию в разведении до предельного титра 7S-антител.
8.1.8.2. При оценке реакции необходимо учитывать, что цистеин легко окисляется на воздухе, образуя мелкие крупинки, которые можно легко отличить от специфической агглютинации.
8.1.8.3. В заключении лаборатории о результатах исследования проб сывороток крови должна быть сообщена диагностическая оценка результатов исследования (положительная или отрицательная).
8.2. Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) с листериозным антигеном применяется для исследования на листериоз сывороток крови всех видов животных и человека.
Применение РСК не исключает применения других методов диагностики листериоза, однако ценность этой реакции состоит в том, что она ускоряет постановку диагноза и позволяет выявлять больных животных, не имеющих выраженных клинических признаков болезни (листерионосителей).
Реакцию ставят в водяной бане в общем объеме 1,0 мл всех компонентов при температуре 37 - 38°.
8.2.1. Компоненты реакции и условия их применения:
- гемолизин с рабочим титром не ниже 1:500; титрование гемолизина по общепринятой схеме проводят периодически 1 раз в 3 месяца, а также при получении каждой новой серии;
- листериозный антиген для РСК; применяют в рабочем титре, указанном на этикетке флакона; срок годности антигена - 2 года, при условии хранения его в темном прохладном месте (5 - 10 °C);
- позитивные листериозные сыворотки (ТУ 46-21-182-75); используют при титровании комплемента в бактериолитической системе и для контроля реакции в главном опыте после предварительной инактивации в день постановки реакции в разведении 1:10 в течение 30 минут при 56 - 60 °C (сыворотки крупного рогатого скота и свиней при 56 - 57 °C, лошадей и овец при 58 - 59 °C, кроликов - 60 °C);
Примечание: Обработка сывороток морских млекопитающих
(ластоногих и китообразных) CO для снятия антикомплементарности
2
с последующим традиционным прогреванием для инактивации
комплемента изложена в Приложении 10.3.
- нормальные сыворотки заведомо здоровых животных тех же видов, как и испытуемые; применяют при титровании комплемента в бактериолитической системе и для контроля реакции в главном опыте так же, как и позитивные сыворотки после предварительной инактивации при указанном режиме и в таких же дозах;
- комплемент сухой для РСК (ГОСТ 16446-78); применяется в титре, установленном в день постановки реакции путем титрования в бактериолитической системе;
- 2,5-процентная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе; лучше применять сенсибилизированные эритроциты (гемолитическую систему). Для сенсибилизации эритроцитов гемолитическую систему (смесь равных объемов 2,5-процентной взвеси эритроцитов и рабочего разведения гемолизина) выдерживают в водяной бане при 37 - 38 °C в течение 20 минут; гемолитическую систему применяют в реакции в дозе 0,4 мл;
- физиологический раствор (0,85-процентный) химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, pH 7,0 - 7,2.
8.2.2. Титрование компонентов.
Перед постановкой главного опыта проводят титрование компонентов реакции: гемолизина и комплемента в гемолитической и бактериолитической системах.
Титрование гемолизина.
Гемолизин титруют в разведениях: 1:1000, 1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500, 1:3000 и т.д., которые готовят из основного его разведения 1:100.
Комплемент используют в реакции в разведении 1:10 или 1:20 по 0,2 мл. Взвесь эритроцитов барана по 0,2 мл. Взамен антигена и сыворотки в пробирки прибавляют по 0,4 мл физиологического раствора. Время течения реакции - 10 минут в водяной бане при температуре 37 - 38 °C.
При титровании гемолизина ставят следующие контроли:
- гемолизин 1:100 с эритроцитами и физраствором в отсутствии комплемента;
- комплемент с эритроцитами и физраствором в отсутствии гемолизина;
- эритроциты с физраствором в отсутствии гемолизина и комплемента.
Во всех контролях гемолиз эритроцитов должен отсутствовать.
Титром гемолизина считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,2 мл взвеси эритроцитов при комплементе 0,2 мл в разведении 1:10 или 1:20.
Для титрования комплемента и постановки главного опыта гемолизин применяют в рабочем титре, который является четырехкратной дозой по сравнению с предельным титром. Например, если предельный титр равен 1:2000, то в реакции следует применять разведение 1:500, для чего к 1 мл гемолизина приливают 499 мл физиологического раствора (таблица 2).
Таблица 2
ТИТРОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
------+--------------+------------+----------+---------+---------- ¦N ¦ Разведенная ¦2,5-процент-¦Комплемент¦Физиоло- ¦Результат¦ ¦про- ¦гемолитическая¦ная взвесь ¦ 1:20 ¦гический ¦ опыта ¦ ¦бирки¦ сыворотка ¦эритроцитов ¦ (мл) ¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ (мл) ¦(мл) ¦ ¦(мл) ¦ ¦ +-----+--------------+------------+----------+---------+---------+ ¦1 ¦0,2 (1:1000) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¬¦ ¦ ¦2 ¦0,2 (1:1200) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦ ¦ ¦3 ¦0,2 (1:1500) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦Полный ¦ ¦4 ¦0,2 (1:1800) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦гемолиз ¦ ¦5 ¦0,2 (1:2000) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 -¦ ¦ ¦6 ¦0,2 (1:2500) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¬¦ ¦ ¦7 ¦0,2 (1:3000) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦ ¦ ¦8 ¦0,2 (1:3500) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦Частичный¦ ¦9 ¦0,2 (1:4000) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 ¦¦гемолиз ¦ ¦10 ¦0,2 (1:5000) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,4 -¦ ¦ ¦Конт-¦0,2 (1:100) ¦0,2 ¦- ¦0,6 ¬¦Полная ¦ ¦роль-¦- ¦0,2 ¦0,2 ¦0,6 ¦¦задержка ¦ ¦ные ¦- ¦0,2 ¦- ¦0,8 -¦гемолиза ¦ ------+--------------+------------+----------+---------+----------
Примечание: В данном примере предельный титр гемолитической сыворотки равен 1:2000, а для реакции следует применять ее в титре 1:500.
Титрование комплемента в гемолитической системе.
Комплемент титруют в дозах 0,02, 0,04, 0,06 и т.д. (с интервалом по 0,02 мл) до 0,20 мл основного его разведения. В каждую пробирку к недостающему до 0,2 мл количеству основного разведения комплемента добавляют физиологический раствор: в первую пробирку 0,18 мл, во вторую 0,16 мл и т.д. После этого во все пробирки наливают по 0,4 мл физиологического раствора и по 0,4 мл гемолитической системы. Реакция должна сопровождаться контролями компонентов в смеси с эритроцитами (контроль гемолизина, контроль комплемента, контроль физраствора), а также контролем гемолитической системы при максимальной дозе комплемента (0,2 мл основного разведения). После тщательного смешивания компонентов путем встряхивания штативы с пробирками помещают на 10 минут в водяную баню при 37 - 38 °C.
Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в указанных условиях 0,2 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина (таблица 3).
Таблица 3
ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ
---------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----- ¦1. Комплемент ¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦ ¦в разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦1:10 или 1:20 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦2. Физраствор ¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦0 ¦ ¦до объема 0,2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦3. Сенсибили- ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦ ¦зированные ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦эритроциты ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦барана (гемо- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦литическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦система) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦4. Физраствор ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦ ¦ ¦ ¦ Водяная баня при 37 - 38 °C в течение 10 минут ¦
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное