Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий. Инструкция

                                     +
двух температурах,  диаметр колоний П -иерсиний  при  37  °С,  как
правило, не превышает 1,0 мм.

                                     +    -
               Методика определения Т  и Т -колоний

Чистую культуру испытуемого штамма иерсиний выращивают при 37 °С на питательном агаре в чашке в виде изолированных колоний. Посев микроскопируют в открытой чашке при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 5х и 7х), лучше без конденсора, в проходящем искусственном свете от точечного источника.

    Культуры    иерсиний,   содержащие   плазмиду   вирулентности,
формируют  на  питательном  агаре мелкие выпуклые колонии с ровным
                                                                +
или  слабо  бахромчатым  краем,  непрозрачные,  почти  черные (Т -
колонии).  Микробные клетки, не содержащие плазмиды вирулентности,
образуют  при этих же условиях более крупные, прозрачные, плоские,
                                                     -
неструктурные колонии с ровным или волнистым краем (Т -колонии).

Методика постановки теста хлопьеобразования

Для определения хлопьеобразования используют культуры, выращенные при 37 °С и при комнатной температуре на питательном агаре. Микробную массу эмульгируют в капле 0,85% раствора хлорида натрия на предметном стекле. При положительном результате культура, выращенная при 37 °С, остается в виде глыбок или в первоначально гомогенной суспензии в течение 1 - 2 мин. появляются хлопья по типу агглютината. Культура, выращенная при комнатной температуре, образует равномерное помутнение.

Штаммы иерсиний, не содержащие плазмиду вирулентности, хорошо эмульгируются в капле 0,85% раствора хлорида натрия с сохранением равномерного помутнения независимо от температуры культивирования (отрицательный результат). В случае обнаружения хлопьев в культурах, выращенных при 37 °С и при комнатной температуре, тест хлопьеобразования также считается отрицательным.

Результат в тесте хлопьеобразования в значительной мере зависит от процентного содержания в исследуемой культуре иерсиний бесплазмидных клеток. При наличии в популяции 25% бесплазмидных клеток оценка теста хлопьеобразования может вызвать затруднение, а при 50% тест становится отрицательным.

Для повышения достоверности получаемых результатов при дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов иерсиний необходимо параллельное изучение контрольных культур иерсиний.

При определении маркеров вирулентности рекомендуется использовать референтные плазмидосодержащие штаммы Y. enterocolitica серовара 03 (N 188 в коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Москва, Сивцев Вражек, 41) и 09 (N КМ-33/201 в коллекции ВНИПЧИ "Микроб", Саратов, Университетская, 46), а также бесплазмидные штаммы серовара 03 (N 189 в ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и 09 (N 207 там же). Кроме того, в качестве плазмидосодержащего можно использовать свежевыделенный штамм Y. pseudotuberculosis, формирующий типичные мелкие колонии на средах Серова и Эндо, а в качестве бесплазмидного - Y. enterocolitica биовара I, выделенные из объектов внешней среды.

При решении вопроса о принадлежности культуры к возбудителям иерсиниоза учитывают ее биохимические (биовар), антигенные (серовар) свойства и наличие маркеров вирулентности.

4.4. ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИТЕЛ

Антитела к иерсиниям появляются в крови в конце первой - начале второй недели болезни. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках (не менее чем в двух), взятых от больных в первую неделю болезни и в конце второй - начале третьей.

Кровь берут из вены в стерильную пробирку в количестве 3 мл. Можно брать кровь из пальца. В этом случае взятую мерной пипеткой кровь смешивают с 0,85% раствором хлорида натрия в таком соотношении, чтобы после центрифугирования получить сыворотку, разведенную 1:3. Примеры: 0,1 мл крови и 0,2 мл раствора; 0,2 мл крови и 0,4 мл раствора и т.д.

Для серодиагностики применяют реакцию непрямой гемагглютинации с эритроцитарными антигенными диагностикумами производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, а также реакцию агглютинации.

4.4.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Постановка РНГА при наличии коммерческих ингредиентов методически проста, она позволяет выявить антитела в более ранние сроки.

Методика постановки и учета РНГА приведена в наставлении по ее применению, дополнительно рекомендуется при каждой постановке реакции включать в опыт прилагаемую гипериммунную сыворотку с известным титром в качестве контроля активности препарата.

Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 3 разведения ниже, чем указано, то такой препарат непригоден для дальнейшего использования.

4.4.2. Реакция агглютинации (РА).

Для постановки реакции агглютинации необходимо иметь культуры Y. pseudotuberculosis I, II, III, IV, V сероваров и Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров (03; 09; 05,27; 08) и другие, выделенные от больных на данной территории, обладающие типичными для указанных видов биологическими свойствами. Эталонные культуры можно получить в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва, Сивцев Вражек, д. 41) или его филиале (г. Саратов, ул. Университетская, д. 46). В качестве антигена используют живые культуры в S-форме или приготовленные из них формалинизированные препараты. Учитывая нестандартность используемых антигенов, каждый опыт необходимо сопровождать контролем с заведомо положительной сывороткой с известным титром.

Антиген из живых культур представляет собой взвесь иерсиний, полученную путем смыва 2-суточной культуры, выращенной на агаре Хоттингера или МПА при температуре 24 - 26 °С.

Перед каждым приготовлением антигена для РА проверяют морфологические и культуральные свойства иерсиний. Для этого засевают микробные клетки в бульон (Хоттингера, мясопептонный) или 1% пептонную воду и инкубируют в течение суток при температуре 24 - 26 °С. Полученную бульонную культуру пересевают на чашки с агаром, инкубируют при той же температуре 48 часов, просматривают под микроскопом и отбирают колонии в S-форме (круглые, с ровными краями, блестящие, с ярким голубоватым свечением). При наличии однородных гладких колоний их используют для приготовления антигенов.

Шероховатые колонии (R-форма) восстанавливают в S-форму пересевами, чередуя питательный бульон и агар до получения однородной популяции.

Далее из взвеси иерсиний, смытых с агара 0,85% раствором хлорида натрия, готовят взвесь, содержащую 1 млрд. м.к. в 1 мл, что соответствует стандарту 10 ед. по ОСО мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Антиген из живой культуры для РА используют однократно.

Возможно также применение в РА формализированного антигена. Для его получения приготовленную взвесь, содержащую 1 млрд. м.к. в 0,85% растворе хлорида натрия с 5% формалином, выдерживают 2 суток при температуре 24 - 26 °С. Затем ее отмывают от формалина 0,85% раствором хлорида натрия в соотношении 1 часть взвеси и 10 частей раствора с помощью центрифугирования при 3000 об./мин., 40 мин. 3-кратно. Полученный антиген хранят при температуре 5 - 8 °С и перед постановкой РА стандартизируют до 1 млрд. м.к. Формализированный антиген может быть использован в течение месяца.

При постановке РА сыворотку разводят 0,85% раствором хлорида натрия 1:10, затем последовательно двукратно до разведения не менее 1:320 в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл антигена (живая культура или формализированная), содержащего 1 млрд. м.к. 1 мл. Одновременно проводят контрольные реакции: 1) 0,5 мл антигена вносят в 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия (контроль антигена); 2) 0,5 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:10, вносят в 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия (контроль сыворотки). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, выдерживают 3 часа при температуре 37 °С, а затем 16 - 18 часов - при температуре 24 - 26 °С.

Учет результатов производят по 4-крестовой системе с использованием вогнутого зеркала или агглютиноскопа.

++++ - Полная агглютинация, жидкость прозрачная, осадок на дне пробирки, рыхлый.

+++ - Полная агглютинация, жидкость прозрачная, осадок на дне, мелкие хлопья.

++ - Агглютинация неполная, жидкость прозрачная неполностью, на дне осадок.

+ - Частичная агглютинация, жидкость мутная, осадок небольшой в виде пуговки, косичкой смывается при встряхивании.

Реакция оценивается как положительная при титре не ниже чем 1:160. Агглютинация на 2 и 1 крест не учитывается как положительная.

4.5. ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИГЕНОВ

В последнее десятилетие в диагностическую практику широко внедряются иммунологические методы исследования, обладающие высокой чувствительностью и строгой специфичностью. К наиболее перспективным относят реакции: коагглютинации (РКА), иммуноферментный анализ (ИФА), непрямая иммунофлуоресценция (РНИФ).

Они выявляют антиген (возбудитель) в слюне, моче, копрофильтратах, крови больных, органах мелких млекопитающих и сельскохозяйственных животных, в смывах из объектов внешней среды в очагах псевдотуберкулеза. Из перечисленных методов в настоящее время внедряются в практику ИФА для выявления Y. pseudotuberculosis и РНИФ для обнаружения Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

4.5.1. Иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА предназначен для обнаружения псевдотуберкулезного антигена в биологических субстратах (в испражнениях больных, органах мелких млекопитающих, смывах с объектов внешней среды).

Выявление антигенов проводится с помощью специфических антител, меченных пероксидазой в "сэндвич" варианте иммуноферментного анализа. Методика постановки и учета результатов ИФА приведена в наставлении по применению тест-системы.

4.5.2. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

РНИФ может быть применена как в клинической, так и в противоэпидемической практике (табл. 6) для обнаружения Y. pseudotuberculosis I - V сероваров и Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров.

Таблица 6

ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

---------------------+---------------+----------------------------
¦  Вид исследуемого  ¦ Сроки взятия  ¦Сроки исследования, харак- ¦
¦     материала      ¦   материала   ¦тер обработки материала    ¦
+--------------------+---------------+---------------------------+
¦         1          ¦       2       ¦             3             ¦
+--------------------+---------------+---------------------------+
¦Испражнения больных:¦               ¦                           ¦
¦при спорадических   ¦В первые 3 - 5 ¦Обогащенные в ФБР. В       ¦
¦заболеваниях        ¦дней болезни   ¦течение 3 - 5 и более суток¦
¦при групповых       ¦В первые 3 - 5 ¦Нативный - исследовать     ¦
¦заболеваниях        ¦дней болезни   ¦сразу после эмульгирования ¦
¦                    ¦               ¦в 0,85% растворе хлорида   ¦
¦                    ¦               ¦натрия в соотношении 1:1.  ¦
¦                    ¦               ¦Обогащенный - в первые трое¦
¦                    ¦               ¦и более суток              ¦
¦Кровь, ликвор, мазок¦Первые три дня ¦Обогащенный в течение      ¦
¦из зева             ¦болезни        ¦3 - 5 суток и более        ¦
¦Органы и ткани      ¦               ¦                           ¦
¦экспериментальных и ¦               ¦                           ¦
¦диких животных:     ¦               ¦                           ¦
¦а) Мазки-отпечатки  ¦Сразу после    ¦Нативный                   ¦
¦печени, селезенки,  ¦умерщвления    ¦                           ¦
¦кишечника и др.     ¦животных       ¦                           ¦
¦б) Мазки из гомоге- ¦Трупы зверьков ¦Нативный - исследовать сра-¦
¦натов органов       ¦в первые часы  ¦зу. Органы и ткани размером¦
¦(печени, селезенки, ¦после их гибели¦1 х 1 см измельчают ножни- ¦
¦кишечника и др.)    ¦               ¦цами, затем растирают в    ¦
¦                    ¦               ¦ступке с песком и эмульги- ¦
¦                    ¦               ¦руют в растворе 0,85% хло- ¦
¦                    ¦               ¦рида натрия в соотношении  ¦
¦                    ¦               ¦1:1.                       ¦
¦                    ¦               ¦Обогащенный в течение      ¦
¦                    ¦               ¦3 - 5 суток и более        ¦
¦Гистологические сре-¦               ¦                           ¦
¦зы органов и тканей ¦               ¦                           ¦
¦людей и животных    ¦               ¦                           ¦
¦(паренхиматозные    ¦               ¦                           ¦
¦органы, аппендиксы, ¦               ¦                           ¦

¦мезентериальные лим-¦               ¦                           ¦
¦фоузлы, кишечник и  ¦               ¦                           ¦
¦др.)                ¦               ¦                           ¦
¦а) Криостатные      ¦В ходе операций¦Нативный. Пробы размером   ¦
¦                    ¦и секций       ¦1 х 1 см немедленно замора-¦
¦                    ¦               ¦живают при минус 70 °С     ¦
¦                    ¦               ¦(возможно замораживание в  ¦
¦                    ¦               ¦смеси этилового спирта 96° ¦
¦                    ¦               ¦с сухим льдом). Хранят до  ¦
¦                    ¦               ¦изготовления срезов        ¦
¦б) Парафиновые      ¦В ходе операций¦Нативный. Пробы размером   ¦
¦                    ¦и секций       ¦1 х 1 см погружают в 10%   ¦
¦                    ¦               ¦нейтральный формалин, а    ¦
¦                    ¦               ¦затем проводят подготовку и¦
¦                    ¦               ¦заливку в парафин по       ¦
¦                    ¦               ¦общепринятой методике. При ¦
¦                    ¦               ¦освобождении от парафина   ¦
¦                    ¦               ¦помещают 2 раза в ксилол на¦
¦                    ¦               ¦15 мин., затем в 100°      ¦
¦                    ¦               ¦спирт, прополаскивают 96°  ¦
¦                    ¦               ¦спиртом 10 мин. или дистил-¦
¦                    ¦               ¦лированной водой 3 мин.    ¦
¦                    ¦               ¦Высушивание при температуре¦
¦                    ¦               ¦20 °С                      ¦
¦<...> инструменты,  ¦По показаниям  ¦Обогащенный в течение 3 - 5¦
¦пищевые продукты и  ¦               ¦и более суток              ¦
¦др.                 ¦               ¦                           ¦
---------------------+---------------+----------------------------

Оборудование и ингредиенты

Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Д, ЛЮМАМ)

Термостат с температурой 37 °С

Холодильник

Предметные стекла

Чашки Петри

Батарейные стаканы для промывания мазков

Дистиллированная вода

0,85% раствор хлорида натрия

Сыворотки к Y. pseudotuberculosis: поливалентная (объединяет 5 сероваров) и моновалентная (к I и III сероварам) содержат специфические антитела в рабочем разведении 1:160.

Сыворотки Y. enterocolitica: моновалентные к наиболее распространенным сероварам (03; 04,32; 05; 05,27; 07,8; 08; 09; 013,7) содержат специфические антитела в рабочем разведении 1:160. Для удобства применения их соединяют в следующей последовательности: сыворотки 03; 04,32; 09 - I группа и сыворотки 05; 05,27; 07,8; 013,7 - II группа.

Сухой бычий альбумин, меченный родамином

Ацетон для фиксации мазков

Фосфатно-буферный раствор (рН 7,2 - 7,4) для промывания препаратов

Нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат

ФБР для обогащения исследуемого материала.

Подготовка ингредиентов и материала для РНИФ

В ампулы, содержащие сухие сыворотки, добавляют дистиллированную воду в объеме 1 мл. Регидратируют 3 мин. Затем их разводят 1:5 или 1:10 (в соответствие с титром, указанным на этикетке) 0,85% раствором хлорида натрия. Регидратированные препараты хранят при температуре 5 - 8 °С в течение 1 месяца.

Постановка и учет РНИФ

На хорошо вымытые и обезжиренные смесью Никифорова предметные стекла наносят мазки или мазки-отпечатки ровным, тонким слоем. Из жидких материалов (взвеси, суспензии, эмульсии) их делают, нанося пипеткой или петлей каплю жидкости, которую расширяют до 7 - 8 мм в диаметре. На каждое предметное стекло со шлифованным краем наносят материал из 4 - 6 проб. Мазки хорошо высушивают на воздухе и фиксируют ацетоном в течение 20 мин. Приготовленные мазки хранят до использования при температуре 5 - 8 °С. Препараты необходимо беречь от увлажнения. Такие мазки пригодны для работы в течение месяца.

На мазки с испытуемым материалом наносят рабочее разведение поливалентной сыворотки к Y. pseudotuberculosis I - V сероваров и групповые к Y. enterocolitica и выдерживают 45 мин. во влажной камере при температуре 37 °С. Затем препараты следует промыть фосфатно-буферным раствором (рН 7,2 - 7,4) в течение 10 мин. и высушить на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой люминесцирующий гамма-глобулин к иммуноглобулинам кролика в смеси с родамином в рабочем разведении (рабочее разведение указано на этикетке каждой ампулы). Мазки выдерживают во влажной камере при температуре 37 °С в течение 30 мин. Далее препараты следует промыть в двух порциях буфера в течение 10 мин. и высушить на воздухе. Высушенные мазки просматривают в люминесцентном микроскопе по общепринятой методике. В случае обнаружения единичных клеток флуоресцирующих иерсиний со специфическим свечением на +++ или ++++ креста готовят новые мазки и обрабатывают по указанной выше методике, используя моновалентные сыворотки к Y. pseudotuberculosis I и III сероваров и моновалентные к Y. enterocolitica для идентификации серологического варианта. Для контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную пробы; контроль - положительный - специфический антиген; контроль - отрицательный - гетерологичный антиген.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе типа МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Д, ЛЮМАМ (объектив 90 х 1,3; окуляр 8х). Первичные светофильтры для МЛ-2 - ФС 1-4; СЗК = 7-2; ВС8 = 2; окулярный или запирающий = 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2; ФС - 1-6; окулярный зеленый, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатами изотиоцианата флуоресцина.

Просматривают не менее 20 полей зрения. Оценку результатов исследования проб осуществляют на основании морфологии и яркости флуоресценции иерсиний. Для этого используют условную систему обозначения крестами (таблица 7).

Таблица 7

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБ

------------+-----------------------------------------------------
¦Обозначение¦               Яркость флуоресценции                ¦
+-----------+----------------------------------------------------+
¦++++       ¦Яркая флуоресценция                                 ¦
¦+++        ¦Отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция¦
¦           ¦с характерным для данного флуорохрома цветом (в дан-¦
¦           ¦ном случае желтовато-зеленый), морфология иерсиний  ¦
¦           ¦выявляется хорошо, у отдельно лежащих бактерий видны¦
¦           ¦четкие ободки за счет более яркого свечения комплек-¦
¦           ¦са антител с поверхностным антигеном                ¦
¦++         ¦Флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет      ¦
¦           ¦люминесценции выявляется достаточно четко           ¦
¦+          ¦Флуоресценция очень слабая, морфология иерсиний     ¦
¦           ¦различима плохо, цвет неопределенный                ¦
¦-          ¦Флуоресценция отсутствует                           ¦
------------+-----------------------------------------------------

Таким образом, оценку результатов реакции непрямой иммунофлуоресценции для выявления и идентификации иерсиний осуществляют дважды: 1) первое исследование испытуемого материала проводят после нанесения на мазок поливалентной (I - V сероваров) псевдотуберкулезной сыворотки и групповых I и II к Y. enterocolitica; 2) второе - при наличии специфической флуоресценции (не менее чем на ++) с поливалентной к Y. pseudotuberculosis и групповыми (I и II), к Y. enterocolitica проводят с помощью моновалентных псевдотуберкулезных сывороток (I и III серовары) и к Y. enterocolitica сероваров 03; 04,32; 05; 05,27; 07,8; 08; 09; 013,7.

4.6. ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

ФОСФАТНО-БУФЕРНЫЙ РАСТВОР (ФБР)

    Раствор А - KH PO  - 9,08 г в 1,0 л дистиллированной воды.
                  2  4
    Раствор Б - NaH PO  х 2H O - 11,87 г  в 1  л  дистиллированной
                   2  4     2
воды рН 7,6 - 7,8.

Приготовление:

150 мл раствора А соединить с 850 мл раствора Б. Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать при 1 атм. в течение 1 часа.

Приложение 2

БУФЕРНО-КАЗЕИНОВО-ДРОЖЖЕВАЯ СРЕДА (БКД)

Состав:

гидролизат казеина средней степени расщепления - 2,0 г (Дагестанский НИИ питательных сред)

экстракт пекарских дрожжей - 5,0 мл

фосфатно-буферный раствор рН 7,6 - 7,8 - до общего объема 1 л.

Приготовление:

Экстракт пекарских дрожжей: к 500 г дрожжей, предварительно размельченных до гомогенной массы в фарфоровой ступке в малом объеме дистиллированной воды, добавить до 1 л дистиллята. Взвесь слить в колбу и кипятить в течение 60 мин. на медленном огне при помешивании. Взвесь охладить при 5 °С в течение 16 - 18 час. Затем надосадочную жидкость слить и профильтровать через широкопористый бумажный фильтр. Приготовленный дрожжевой экстракт разлить во флаконы, простерилизовать под давлением 0,5 атм. 30 мин.; хранить при температуре 5 - 8 °С в течение 12 месяцев.

К 0,5 л фосфатно-буферного раствора добавить 2,0 г гидролизата казеина (предварительно подготовленного согласно наставлению, указанному на этикетке) и 5,0 мл экстракта дрожжей. Смешать встряхиванием, добавить фосфатно-буферный раствор до общего объема 1 л и проверить рН готовой среды (должен быть 7,6 - 7,8). Далее смесь разлить в пробирки по 5,0 мл и автоклавировать под давлением 0,5 атм. в течение 20 минут. Среду можно использовать в течение 7 - 10 суток при хранении в условиях холодильника.

Приложение 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА СЕРОВА

    Состав:
    Глюкоза                                              0,5 г
    Мочевина                                             0,25 г
    Молибденовокислый аммоний                            0,1 г
    Сода безводная                                       0,1 г
    30% водный раствор сухой желчи                       2,0 мл
    1,6% водный раствор конго-рот                        0,8 мл
    1% водный раствор генцианвиолета                     0,1 мл
    Сухой агар                                           3,5 г
    Дистиллированная вода                                100,0 мл.

Приготовление: Конго-рот и генцианвиолет растворить в горячей дистиллированной воде. Раствор сухой желчи готовить в стерильной воде.

Указанные ингредиенты вносить в дистиллированную воду, нагревать и кипятить 5 мин. при помешивании, разлить в чашки Петри. Цвет среды темно-вишневый, рН - 7,2 - 7,4. Среду можно хранить в течение недели в холодильнике.

Приложение 4

СРЕДА С ИНДИКАТОРОМ БРОМТИМОЛОВЫМ СИНИМ (БТС)

    Состав:
    Желчь медицинская                               20 мл
    Раствор NaOH 4%                                 10 - 12 капель
    Сухой питательный агар                          35 г
    Глюкоза                                         10 г
    Мочевина                                        5 г
    1,6% спиртовой раствор с индикатором
    бромтимоловым синим                             8 мл
    Дистиллированная вода                           1 л.

Приготовление:

К 1 л воды добавить сухой питательный агар, медицинскую желчь и автоклавировать 20 мин. при 0,5 атм. После охлаждения до 80 °С добавить глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий, смешать и сразу разлить в стерильные чашки Петри. рН - 7,8. Хранить среду при температуре 5 - 8 °С в течение недели.

Приложение 5

УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СКОШЕННЫЙ СТОЛБИК

    Состав:
    Агар сухой питательный                         3,5 г
    Лактоза                                        0,4 г
    Глюкоза                                        0,08 г
    Крахмал растворимый                            0,05 г
    Сахароза                                       1,5 г
    Мочевина                                       0,25 г
    Уксуснокислый свинец                           0,03 - 0,04 г
    Тиосульфат натрия                              0,03 г
    Цистин                                         0,003 г
    1% феноловокрасный водорастворимый             2,5 мл
    Дистиллированная вода                          100 мл.

Приготовление:

Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10 - 15 минут, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 мин., после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.

Приложение 6

ЩЕЛОЧНОЙ РАСТВОР

    Состав:
    раствор А - Калия гидроокись                          400 г
                Вода дистиллированная                     до 1 л
    раствор В - Натрия хлорид                             5,0 г
                Вода дистиллированная                     до 1 л.

Приготовление:

Оба раствора приготовить отдельно и хранить в условиях холодильника. Перед началом работы готовить рабочий раствор: смешивая 9,7 мл раствора В и 0,13 мл раствора А.

Щелочной раствор должен быть прозрачным.

Приложение 7

СРЕДА КЛАРКА ДЛЯ АУТОАГГЛЮТИНАЦИИ

    Состав:
    Двузамещенный фосфат калия                            5,0 г
    Пептон                                                7,0 г
    Глюкоза                                               5,0 г
    Вода                                                  до 1 л.

Приготовление:

Пептон и фосфат калия растворить в воде и кипятить 2 - 5 мин. После удаления осадка среду стерилизовать при 120 °С в течение 20 мин., асептично добавить стерильный раствор глюкозы и разлить по 3 - 4 мл в пробирки.

Приложение 8

СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМОСТИ (КАЛЬЦИЙДЕФИЦИТНЫЙ АГАР)

    Состав:
    Агар АГВ Дагестанского НИИ питательных сред             100 мл
    Щавелевокислый натрий                                   8 мл
    Хлорид магния                                           4 мл.

Приготовление:

На 100 мл расплавленной (около 50 °С) среды АГВ внести - 8 мл 0,25 М стерильного раствора щавелевокислого натрия, тщательно перемешать; 4 мл 0,5 М стерильного раствора хлорида магния (указанная последовательность внесения солей обязательна). После перемешивания готовую среду разлить по 15 - 20 мл в чашки Петри, которые использовать после застывания и подсушивания агара. Хранить чашки можно в течение 1 - 2 недель в холодильнике.

Приложение 9

СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРФОЛОГИИ КОЛОНИЙ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Использовать агар АГВ Дагестанского НИИ питательных сред, который готовить согласно прилагаемой инструкции, стерилизовать автоклавированием; по 20 мл разлить в стандартные чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, использовать после застывания и подсушивания агара.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: