Эпидемиология, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза. Методические рекомендации
Утверждаю
Заместитель Министра
здравоохранения РСФСР
К.И.АКУЛОВ
7 декабря 1987 года
Согласовано
Начальник Главного управления
научно-исследовательских
институтов и координации
научных исследований
В.Н.ШАБАЛИН
7 декабря 1987 года
Аннотация
Настоящие Рекомендации, выпускаемые взамен методических указаний МЗ РСФСР 1976 года, содержат современные данные по эпидемиологии, этиологии, лабораторной диагностике, клинике, лечению и профилактике лептоспироза.
Предназначены для работников санитарно-эпидемиологических станций, лечебно-профилактических учреждений, научно-исследовательских и медицинских институтов, а разделы "Эпидемиология", "Профилактика" и для ветеринарных работников.
I. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
Лептоспироз - острое инфекционное зоонозное заболевание, вызываемое возбудителями рода Leptospira.
На земном шаре лептоспироз встречается почти повсеместно. В СССР заболевания регистрируются в различных ландшафтно-географических зонах среди людей, домашних животных, 42 видов диких млекопитающих, относящихся к отрядам грызунов, насекомоядных, хищных и копытных.
Источники возбудителей лептоспирозной инфекции для человека подразделяются на две группы. К первой относятся мышевидные грызуны и насекомоядные, представляющие природный резервуар возбудителей лептоспирозной инфекции; ко второй группе принадлежат домашние животные (свиньи, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, собаки и др.), пушные звери клеточного содержания (лисицы, песцы, нутрии и прочие), обусловливающие антропургические очаги.
Из этой группы наибольшее эпидемиологическое значение имеют свиньи, крупный рогатый скот и собаки, которые являются носителями самых распространенных возбудителей лептоспироза людей - Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Canicola и Sejroe (выделяется в самостоятельную группу).
За последнее десятилетие возросла роль в эпидемиологии лептоспироза серых крыс - носителей лептоспироза Icterohaemorrhagiae.
Заболевание, вызываемое этим возбудителем, характеризуется наиболее тяжелыми клиническими проявлениями с высокой летальностью.
Заражение от больного человека людей и животных практически не наблюдается.
Из внешней среды лептоспиры проникают в организм человека и животных через даже незначительные повреждения кожи и неповрежденные слизистые оболочки полости рта, желудочно-кишечного тракта, глаз, носа, наружных половых органов.
Территории, на которых выявлено носительство лептоспир среди диких животных и заболевания или лептоспироносительство домашних животных, считают лептоспирозными очагами, потенциально опасными для человека. Лептоспирозные очаги подразделяются на природные, антропургические и смешанные.
Природные очаги лептоспироза - это территории, на которых лептоспиры паразитируют на диких животных. Они имеют ландшафтную стациальную приуроченность и располагаются преимущественно в лесной зоне, а по долинам рек проникают в лесостепную и лесотундровую зоны.
В пределах своего ареала природные очаги встречаются не повсеместно, а в понижениях рельефа, где приурочены, главным образом, к сырым заболоченным биотопам. Они обычно существуют длительное время и могут быть ликвидированы лишь в результате хозяйственной деятельности человека (гидромелиоративные работы и т.п.).
Природные очаги чаще всего могут быть обнаружены в приозерных котловинах, по осоково-вейниковым болотам, зарослям тростника и рогоза, сырым пойменным лугам, заболоченным травяным участкам, сырым вырубкам и опушкам леса, лесным завалам, а также на небольших увлажненных участках осушенных территорий.
Основными носителями лептоспир в природных очагах являются различные виды мелких влаголюбивых грызунов и насекомоядных: серые крысы, полевки-экономки, обыкновенные полевки, полевые и домовые мыши, а также землеройки.
В РСФСР в инфекционной патологии человека наибольшее значение имеют природные очаги лептоспироза серогрупп Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa и в меньшей степени Pomona и Hebdomadis.
В последние годы значительное эпидемиологическое проявление приобретают природные очаги иктерогеморрагического лептоспироза, выявленные на различных территориях РСФСР. Наиболее интенсивные природные очаги этого лептоспироза наблюдаются в Краснодарском крае и Калининградской области.
Существует привязанность сероваров лептоспир к отдельным видам животных.
Носителями лептоспир сероваров saxkoebing, grippotyphosa являются полевки-экономки и обыкновенные полевки, лептоспир серовара mozdok (серогруппы Pomona) - полевые мыши, серовара sejroe - домашние мыши, серовара bataviae - мыши-малютки, серовара copenhageni (серогруппы Icterohaemorrhagiae) - серые крысы.
В настоящее время согласно имеющимся данным в северных районах Европейской части РСФСР существуют главным образом природные очаги лептоспироза серогруппы Grippotyphosa. В северо-западных и центральных областях, в районах Среднего Поволжья наиболее распространены природные очаги сероваров grippotyphosa, mozdok. В Центрально-Черноземной зоне преобладают лептоспиры серогрупп Pomona среди полевых мышей и Hebdomadis - среди домовых мышей.
На Северном Кавказе наибольшая зараженность грызунов отмечена лептоспирами сероваров copenhageni и mozdok, что связано с преобладанием в местной фауне серых крыс и полевых мышей.
В Западной Сибири, в зонах лесотундры, тайги и лесостепи широко распространены очаги серовара grippotyphosa. Носителями инфекции, как правило, оказываются полевки-экономки и обыкновенные полевки, а на северо-западе Сибири также обские лемминги. В таежной зоне Восточной Сибири имеются природные очаги лептоспир серогрупп Grippotyphosa и Hebdomadis, резервуаром которых являются полевки-экономки.
На Дальнем Востоке состав лептоспир разнообразен, что и определяет этиологическую структуру природных очагов. Это лептоспиры сероваров grippotyphosa, saxkoebing, а также серогруппы Javanica. Основным носителем первых двух широко распространенных сероваров является дальневосточная полевка (Microtus maximorici), а лептоспир серогруппы Javanica - полевая мышь.
Природным очагам наиболее важного в эпидемиологическом отношении лептоспироза серогруппы Pomona свойственны характерные черты в каждом географическом районе. В РСФСР эпизоотически напряженные очаги этой группы главным образом приурочены к интразональным ландшафтам (поймы рек) лесостепной и степной зон Европейской части до реки Волги. В Западной Сибири, если они и регистрировались, то только на ограниченных территориях и являлись слабонапряженными, а в Восточной Сибири, на Дальнем Востоке такие очаги не встречались.
Заражение людей в природных очагах характеризуется приуроченностью к летне-осеннему периоду и происходит во время сельскохозяйственных работ (покоса сырых лугов, при возделывании риса, льна, конопли и других обильно орошаемых культур, уборки сена, урожая на пшеничных, ржаных и овсяных полях, на садово-огородных участках), строительства на вновь осваиваемых территориях, проведения гидромелиоративных работ, охоты, рыбной ловли, туристических походов, неорганизованного отдыха на природе; при несоблюдении мер личной профилактики: при употреблении воды из случайных водоемов для питья, умывания, купания или продуктов питания, загрязненных выделениями грызунов.
Механизация большинства сельскохозяйственных работ ограничила возникновение крупных вспышек лептоспироза в природных очагах. Заболеваемость в них имеет спорадический и групповой характер. Тем не менее следует считаться с потенциальной эпидемической значимостью природных очагов лептоспироза при освоении природных ресурсов, и особенно при создании на их территориях ирригационных систем, рисовых плантаций и других обильно орошаемых культур. В этих случаях могут формироваться новые природноочаговые территории вследствие распространения возбудителя из старых очагов.
Диаметрально противоположный ирригации процесс осушения территории, как правило, сопровождается снижением напряженности эпизоотии лептоспироза. Однако повторное избыточное увлажнение, возникающее в результате неправильного использования мелиоративной системы, может вновь привести к активизации природного очага.
Природные очаги могут также являться местом инфицирования сельскохозяйственных животных.
Антропургические очаги не имеют определенной ландшафтной приуроченности и могут возникать повсеместно, как в сельской местности, так и в городах. Они по-прежнему имеют важное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. В последние годы особенно возросла роль животных индивидуальных владельцев как источника заражения людей лептоспирозом.
Формированию антропургических очагов лептоспироза способствует, главным образом, ввод в хозяйства (в том числе индивидуальные) животных-лептоспироносителей. В этих очагах лептоспиры паразитируют на сельскохозяйственных животных, крысах и собаках.
Циркуляция лептоспир в антропургических очагах обусловливается несвоевременным выявлением, диагностикой, лечением больных животных и лептоспироносителей, а также запоздалым проведением комплекса оздоровительных мероприятий.
Лептоспироз у сельскохозяйственных животных протекает остро, подостро, бессимптомно или в форме хронического лептоспироносительства. Восприимчивы к лептоспирозу животные всех возрастов. Болезнь характеризуется кратковременной лихорадкой, гематурией, иногда желтушным окрашиванием и некрозами слизистых и отдельных участков кожи, а также нарушением функции желудочно-кишечного тракта. У телят чаще, чем у других животных, наблюдается острое течение болезни с высокой летальностью.
У взрослого крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, особенно свиней лептоспироз протекает преимущественно бессимптомно, но у супоросных свиноматок и коров заболевание сопровождается абортами в последней трети беременности, рождением слабого или нежизнеспособного потомства и снижением продуктивности. Аборты у свиноматок в ранее благополучных хозяйствах могут быть массовыми.
При вспышке лептоспироза острое течение инфекции с характерными клиническими признаками наблюдается у небольшого количества животных, а основная масса их переболевает бессимптомно.
Независимо от течения инфекции и вида животного на 5 - 7-й день после заражения в их крови выявляют специфические антитела, а через 10 - 20 дней у ряда особей развивается лептоспироносительство, которое продолжается от нескольких недель до 2 и более лет.
Животные-лептоспироносители выделяют лептоспир во внешнюю среду с мочой и инфицируют подстилку, воду, корма, пастбища, почву и другие объекты внешней среды, через которые заражаются здоровые животные.
Пушные звери клеточного содержания заражаются главным образом при поедании необеззараженных продуктов убоя от животных, больных лептоспирозом.
Заболевания у животных в антропургических очагах наблюдаются в любое время года, но у животных с пастбищным содержанием - преимущественно в пастбищный период.
Этиологическая структура антропургических очагов в животноводческих хозяйствах, как и в природных очагах, определяется количественным соотношением между различными видами животных. Так, в свиноводческих хозяйствах главная роль в этиологии заболеваний человека принадлежит лептоспирам Monjakov (серогруппа Pomona), реже возбудителям серогруппы Tarassovi, а в хозяйствах крупного рогатого скота - сероварам grippotyphosa, pomona, hardjo и иногда tarassovi.
В антропургических очагах лептоспироз среди людей регистрируется в виде "купальных" вспышек, а также групповых или единичных заболеваний среди работников животноводческих хозяйств, звероводческих ферм, мясокомбинатов, индивидуальных владельцев скота и других лиц повышенного риска заражения.
"Купальные" вспышки возникают в результате нарушений ветеринарно-санитарных правил при размещении животноводческих ферм и летних лагерей вблизи рек и различных водоемов, водопоя сельскохозяйственных животных из открытых водоемов. Выделения сельскохозяйственных животных - лептоспироносителей попадают в воду, в которой население купается и использует для хозяйственных нужд. При "купальных" вспышках лептоспироза ярко выражена сезонность (теплое время года). Болеют, как правило, дети и подростки.
В течение всего года могут наблюдаться заболевания среди ветеринарных работников, работников животноводческих хозяйств, звероводческих ферм, зоотехников, собаководов, индивидуальных владельцев скота и др.
Заражение происходит при уходе за животными, ремонте и очистке животноводческих помещений, приеме пищи и курении без соблюдения правил личной профилактики.
Опасность заражения увеличивается в хозяйствах, находящихся в неудовлетворительном санитарном состоянии, при наличии серых крыс и других грызунов.
Этиология заболеваний людей может отражать этиологию лептоспироза сельскохозяйственных животных данного очага.
Пораженность лептоспирозом сельскохозяйственных животных и несвоевременное ее выявление являются причиной заболевания не только животноводов, но и работников мясокомбинатов и убойных площадок, причем последние заражаются даже чаще, чем лица, ухаживающие за скотом. На мясокомбинатах преимущественно болеют рабочие убойного, субпродуктового и кишечного цехов, а также санитарной бойни. Заболевания людей на мясокомбинатах регистрируются также на протяжении всего года. При анализе причин неблагополучия в отношении лептоспироза на мясокомбинатах следует иметь в виду возможность заражения персонала от грызунов, бродячих и сторожевых собак.
Смешанные очаги характеризуются признаками, свойственными одновременно антропургическим и природным очагам инфекции. Этиологическая структура заболевания отражает таковую как у домашних, так и у диких животных, обитающих в данном очаге.
Кроме указанных типов очагов возможно внутрилабораторное заражение при работе с грызунами и другими животными, а также непосредственно с культурами лептоспир высокой вирулентности.
Особенности эпидемиологии в зависимости от патогенных свойств возбудителей. Различные возбудители лептоспироза вызывают одинаковые по патогенезу заболевания и могут при определенных условиях поражать разнообразных животных, но они довольно существенно различаются по патогенным свойствам, избирательной привязанности к тем или иным видам животных-хозяев (то есть по кругу основных носителей инфекции), закономерностям заражения людей, эпидемиологической значимости.
В связи с этим для проведения целенаправленного эпидемиологического обследования очагов и организации необходимых мероприятий ниже приводятся сведения о наиболее распространенных на территории РСФСР основных возбудителях лептоспироза.
Для заболеваний, вызываемых лептоспирами серогруппы Pomona, источником инфекции являются свиньи (серовар monjakov) и крупный рогатый скот (серовар pomona), в силу чего они регистрируются в антропургических очагах. В таких очагах, как правило, наблюдаются крупные эпидемические вспышки водного характера, главным образом среди купальщиков.
Реже источником инфицирования служат полевые мыши - носители серовара mozdok. В этом случае заражение происходит в природных очагах и обычно наблюдается спорадическая заболеваемость.
До настоящего времени среди всех заболеваний, регистрируемых в природных очагах, ведущая роль принадлежит возбудителям серогруппы Grippotyphosa. Источниками инфекции являются серые полевки, в первую очередь полевка-экономка и обыкновенные полевки.
В антропургических очагах заболевания, вызываемые представителями этой серогруппы, встречаются редко, регистрируются преимущественно в сельской местности. Источником инфекции, как правило, является крупный рогатый скот. Эпидемические вспышки среди людей носят обычно локальный характер по сравнению с заболеваниями, вызываемыми лептоспирами серогруппы Pomona, но также связаны с купанием заболевших в водоемах и использованием воды этих водоемов для бытовых и хозяйственных нужд.
При заболеваниях, обусловленных представителями серогруппы Icterohaemorrhagiae, источником заражения служат серые крысы, затем собаки и крайне редко сельскохозяйственные животные.
Болеют лица, по роду своей деятельности соприкасающиеся с синантропными грызунами или загрязненной ими средой (дератизаторы, сантехники, докеры, шахтеры, горнорабочие, рабочие рисовых плантаций, лица, ловящие рыбу в каналах этих плантаций, и др.). Но в последние годы участились случаи заболеваний, вызванных лептоспирами этой серогруппы, у лиц различных профессий, которые заражаются большей частью в природных очагах лептоспироза во время сельхозработ, в том числе и на садово-огородных участках, туристических походов, неорганизованного отдыха на природе, рыбной ловли, охоты и т.п.
Заражение осуществляется через пищу, воду, другие предметы, загрязненные мочой крыс. Инфекция наблюдается как в городах, так и в сельской местности в течение всего года с осенним подъемом (в период наибольшей численности крыс) и обычно носит спорадический характер. Лишь при крайне неблагоприятных санитарных условиях (авария на водопроводе, наводнение, загрязнение крысами пищевых продуктов, воды колодцев и т.д.) могут возникнуть вспышки среди населения.
В условиях Европейской части РСФСР все чаще регистрируются заболевания, вызываемые возбудителями серогруппы Hebdomadis et Sejroe, которые ранее регистрировались в основном на Дальнем Востоке. Эти группы включают в себя большое число различных сероваров лептоспир, значительно отличающихся по своим антигенным свойствам и приуроченности к различным видам животных. В антропургических очагах встречаются спорадические заболевания и небольшие эпидемические вспышки. Источником инфицирования людей обычно является крупный рогатый скот (носитель серовара hardjo), у которого заболевание большей частью протекает бессимптомно.
В качестве носителей возбудителей указанной серологической группы среди грызунов наиболее часто выявляются домовые мыши и серые полевки. Заболевания людей, связанные с заражением от грызунов, встречаются редко.
Источником инфицирования людей лептоспирами серогруппы Tarassovi служат свиньи и крупный рогатый скот. Заболевания обычно единичны, имеют чаще всего профессиональный характер (персонал неблагополучных ферм, работники мясокомбинатов и т.п.). Носители указанных лептоспир в природных условиях на территории СССР не обнаружены.
Заболевания, вызываемые представителями серогруппы Canicola, встречаются преимущественно в городах. Источником инфекции, как правило, являются собаки. Среди людей обычно отмечается спорадическая заболеваемость в результате общения с собаками-лептоспироносителями, у которых инфекция может протекать как в острой, так и в бессимптомной форме. Заболевания регистрируются в течение всего года среди работников собачьих питомников, индивидуальных владельцев собак и др. В редких случаях среди населения могут иметь место эпидемические вспышки водного характера в результате инфицирования питьевой воды собаками-лептоспироносителями.
Кроме того, на территории СССР изредка регистрируются заболевания, вызванные лептоспирами серогруппы Bataviae (источником является мышь-малютка, а наиболее угрожаемый контингент - рабочие на рисовых полях) и возбудителями из серогруппы Javanica (основной источник - бурозубки).
II. ЭТИОЛОГИЯ
Возбудителями лептоспироза являются микроорганизмы рода Leptospira, принадлежащие к самостоятельному семейству Leptospiracea в порядке Spirochaetales. Род Leptospira объединяет два вида: паразитический (патогенный) - Interrogans и сапрофитический - Biflexa. Морфологически патогенные и сапрофитические формы лептоспир неотличимы, их деление принято на основе серологических, культуральных и биохимических критериев.
Лептоспиры на основании антигенных свойств разделяются на серовары, которые по серологическим связям объединяются в группы. Основным таксоном является серовар. В настоящее время известно свыше 200 различных сероваров патогенных лептоспир, 23 серогруппы, а сапрофитических - более 60 сероваров.
Типичная лептоспира представляет собой спиралеподобное образование, обладающее характерной прямолинейной и ротационной подвижностью. Концы у микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. В некоторых культурах большинство или все клетки постоянно имеют прямые концы (бескрючковые лептоспиры). Длина лептоспиры в среднем составляет 6 - 20 микрон, а поперечник равен 0,1 - 0,15 микрона. В зависимости от длины количество завитков бывает разным (в среднем до 20), отдельные клетки могут превышать длину в 2 и даже в 3 раза.
Клетки лептоспир состоят из спирального протоплазматического цилиндра, покрытого цитоплазматической гликопептидной мембраной. Все тело клетки дополнительно заключено в наружную мембрану. Между цитоплазматической гликопептидной мембраной и мембраной наружного покрова расположены два жгутика ("осевые нити"). Каждый жгутик прикреплен к базальному телу и переплетается с протоплазматическим цилиндром. Их свободные концы расположены около середины тела клетки.
У всех видов лептоспир, за исключением серовара illini (типичного сапрофита), базальные тела жгутиков такие же, как у грамотрицательных бактерий, а у illini они сходны с соответствующими образованиями грамположительных бактерий.
В протоплазматическом цилиндре обнаруживаются ядерный материал, рибосомы и мезосомы.
Лептоспиры содержат эстеразу, а также каталазу или пероксидазу или два последних фермента.
Лептоспиры относятся к хемоорганотрофам и культивируются в
средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные
кислоты с длинной цепью (14 или более атомов углерода). Эти
вещества служат основным источником углерода и энергии, а также
клеточных липидов, поскольку лептоспиры не обладают способностью
синтезировать жирные кислоты. Лептоспиры являются аэробными,
микроаэрофильными микроорганизмами. Они могут утилизировать
неорганические соли аммония (но не аминокислоты) как главный
источник азота, а также пуриновые, но не пиримидиновые основания.
Для роста лептоспир необходимы тиамин (витамин B ) и
1
цианокобаламин (витамин B ).
12
Как свежевыделенные, так и рабочие музейные штаммы лептоспир чувствительны к тетрациклину, пенициллину и стрептомицину.
В жидких средах для лептоспир характерны вращение вдоль длинной оси и перемещение без полярной дифференциации. Делящиеся клетки часто энергично и резко изгибаются в точке намечающегося деления. В полужидких средах также наблюдаются изгибание, буравящая и змеевидная подвижность. Лептоспирам свойственен вискотаксис, то есть способность перемещаться в направлении среды, обладающей большей вязкостью.
Лептоспиры - типичные гидрофилы. Важными условиями для их выживания во внешней среде являются повышенная влажность и pH в пределах 7,0 - 7,4.
Оптимальный рост лептоспир наблюдается при pH 7,2 - 7,6, диапазон роста от 6,8 до 7,8, температурный оптимум 28 - 30 °C. Время размножения одной популяции в средах около 7 - 16 часов. Инкубационный период для оптимального роста обычно 6 - 14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 недель и более. При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста. На 1% агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии; в жидкой среде вызывают легкое помутнение и характерную опалесценцию.
Лептоспиры способны проходить через мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,22 мкм.
При кипячении лептоспиры погибают моментально, а при нагревании до 56 - 58 °C гибнут в течение 25 - 30 минут. Они также быстро погибают при высушивании и под воздействием прямого солнечного света. К низким температурам лептоспиры весьма устойчивы. Они остаются жизнеспособными после длительного замораживания во льду. Лептоспиры чувствительны к кислотам. Растворы 0,1% соляной кислоты, 0,5% фенола инактивируют их в течение 20 минут. Активный хлор в дозе 0,3 - 0,8 мг/л убивает лептоспир после двухчасовой экспозиции. Для обеззараживания чистых культур лептоспир рекомендуется использовать 2% раствор соляной кислоты с экспозицией 24 часа, а для патологического материала следует применять 5% раствор фенола в течение 2 часов.
В воде открытых водоемов патогенные лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 и более дней, а во влажной почве - 270 дней. На пищевых продуктах - от нескольких часов до нескольких дней.
Лептоспиры не видны при обычной светлопольной микроскопии, но хорошо различимы при темнопольной. Плохо окрашиваются анилиновыми красителями, но могут быть окрашены импрегнацией серебром или по Романовскому - Гимзе. Лептоспиры серологически неоднородны, что определяется в реакциях перекрестной агглютинации и абсорбции агглютининов. Патогенные лептоспиры, в отличие от сапрофитов, обладают адгезивными свойствами, то есть способностью прилипать к поверхности клеток первичных культур тканей почек млекопитающих, а также к гепатоцитам и нефротелию проксимальных канальцев больных людей и животных. Кроме того, они оказывают цитопатогенное действие на клетки первичных культур тканей почек млекопитающих. Оно обусловлено токсическим веществом белковой природы с молекулярным весом около 50000. Некоторые штаммы определенных сероваров продуцируют гемолизин, специфический в отношении клеток жвачных животных. У патогенных лептоспир имеются цитохромные энзимы, каталаза, пероксидаза, энзимы цикла лимонной кислоты, гликолитические и пентозные пути, а также ацилкоэнзим-А-дегидрогеназа для В-окисления жирных кислот. Клетки обычно чувствительны к содержанию в питательной среде 8-азагуанина в концентрации 250 мкг/мл и бикарбоната натрия 1%.
Типовой штамм: Leptospira interrogans, серовар icterohaemorrhagiae, штамм RG A.
В природе патогенные лептоспиры встречаются у различных видов млекопитающих, обычно они паразитируют в извитых канальцах почек, откуда выводятся с мочой.
Лептоспиры патогенны для человека и животных. Инфекция протекает в различных формах - от манифестной до субклинической. Клиническое течение лептоспироза (симптоматика, тяжесть течения) не зависит от принадлежности возбудителя к серовару, а связано в основном с его вирулентностью и состоянием (реактивностью) макроорганизма. Кроме того, патогенные лептоспиры могут вызывать заболевания, проявляющиеся разнообразно, - от летальной до субклинической инфекции у широкого круга животных. Причем для них характерна специализация патогенных свойств: каждый серовар циркулирует в популяции определенного вида животного.
В СССР от людей и животных выделяются лептоспиры 27 серологических вариантов, относящихся к 13 серологическим группам (табл. N 1). От больных людей выделены культуры лептоспир следующих сероваров: copenhageni, sorex-jalna, canicola, pomona, monjakov, mozdok, grippotyphosa, hebdomadis, hardjo, saxkoebing, bataviae, belorussiae, tarassovi, vietnami, madida, kazachstanica I, kazachstanica II. Из них наиболее часто встречаются серовары: pomona, monjakov, qrippotyphosa, copenhageni, hardjo, saxkoebing, canicola.
Домашние животные чаще инфицируются лептоспирами сероваров pomona, grippotyphosa, monjakov, hardjo, sejroe canicola, tarassovi, являющихся возбудителями заболеваний людей. Лептоспиры сероваров balcanica, guide, vietnami, moldaviae до сих пор установлены только у сельскохозяйственных животных.
От грызунов в основном выделены лептоспиры сероваров mozdok, grippotyphosa, copenhageni, sejroe, saxkoebing, tarassovi, bataviae, sorex-jalna, madida, которые выделены и от больных людей. Однако среди диких зверьков циркулируют пока не изолированные от людей в СССР лептоспиры сероваров icterohaemorrhagiae, poi, erinacei europaei, lora, erinacei auriti.
Таблица N 1
ЛЕПТОСПИРЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ОТ ЛЮДЕЙ И ЖИВОТНЫХ В СССР
--------------------------+-------------------------+--------------------------- ¦ Серогруппа ¦ Серовар ¦ Справочный штамм ¦ +-------------------------+-------------------------+--------------------------+ ¦Icterohaemorrhagiae ¦icterohaemorrhagiae ¦Кубань-25 ¦ ¦ ¦copenhageni ¦Судьин ¦ ¦Javanica ¦poi ¦Sorex I ¦ ¦ ¦sorex-jalna ¦N 33 ¦ ¦Canicola ¦canicola ¦Каширский ¦ ¦Autumnalis ¦mujunkumi ¦Еж N 237 ¦ ¦ ¦erinacei auriti ¦Еж N 670 ¦ ¦Australis ¦erinacei europaei ¦Еж N 1 ¦ ¦ ¦lora ¦Apodemus sylvaticus 889 ¦ ¦Pomona ¦pomona ¦Шали ¦ ¦ ¦monjakov ¦Monjakov ¦ ¦ ¦mozdok ¦ПО 5621 ¦ ¦Grippotyphosa ¦grippotyphosa ¦Moskva V ¦ ¦Hebdomadis ¦hebdomadis ¦Терехов ¦ ¦ ¦hardjo ¦ДВП ¦ ¦ ¦sejroe ¦БМ-1 ¦ ¦ ¦balcanica ¦СВ 132 ¦ ¦ ¦saxkoebong ¦Гамзулин ¦ ¦Bataviae <**> ¦bataviae ¦Microtus minutus 167 ¦ ¦ ¦belorussiae ¦Котова ¦ ¦Tarassovi ¦tarassovi ¦Perepelicin ¦ ¦ ¦guide ¦СВ 134 ¦ ¦ ¦vietnami ¦Казань ¦ ¦ ¦moldaviae ¦114-2 ¦ ¦Madida s. Semaranga ¦madida s. semaranga ¦Фирсова ¦ ¦Kazachstanica I ¦kazachstanica I <*> ¦Казахстанский N 1 ¦ ¦Kazachstanica II ¦kazachstanica II <*> ¦Казахстанский N 2 ¦ --------------------------+-------------------------+---------------------------
--------------------------------
<*> Лептоспиры этих серогрупп выделены в СССР в ограниченных районах и не включены в диагностический набор штаммов лептоспир.
<**> От грызунов.
Сапрофитические лептоспиры серологически гетерогенны, что определяется в реакциях перекрестной агглютинации и абсорбции агглютининов. Они обычно резистентны к содержанию в питательной среде 8-азагуанина в концентрации 250 мкг/мл и бикарбонату натрия 1%. Некоторые штаммы, изолированные из морской воды, зависимы от ионов натрия в концентрации 0,5 М. Продуцируют гемолизин, который действует на эритроциты крыс и мышей. Все штаммы продуцируют липазу.
Штаммы обычно выделяются из естественных водоемов, водопроводной воды и иногда из морской воды. Они непатогенны для экспериментальных животных, обычно восприимчивых к L. interrogans.
Отличительным признаком сапрофитических штаммов лептоспир является их рост при 13 °C.
По тестам гибридизации ДНК не существует их генетической гомологии со штаммами L. interrogans.
Типовой штамм Leptospira biflexa: серовар patoc, штамм Patoc I.
III. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА
Для лабораторной диагностики лептоспироза пользуются микроскопическим, бактериологическим, иммунологическим и биологическим методами исследования.
С 1-го по 5-й день болезни могут быть произведены посев крови, заражение лабораторных животных и микроскопия цитратной крови.
С 4-го дня болезни в сыворотках крови больных появляются агглютинины и лизины, которые определяются с помощью серологической реакции микроагглютинации и лизиса (РМАЛ).
С 10 - 16-го дня болезни исследуются моча, ликвор. В случае летальных исходов - паренхиматозные органы на присутствие лептоспир методом микроскопии, посев и биопробы.
1. Метод микроскопии
1.1. Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения производят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа.
Для этого в микроскопе светлопольный конденсор заменяют на конденсор темного поля ОИ-13. Используют осветитель ОИ-19 или другой системы. Вогнутое зеркало микроскопа должно быть освещено так, чтобы при наложении на него листа белой бумаги при закрытой диафрагме осветителя была четко видна окруженная голубым ореолом нить спирали лампы осветителя, что достигается передвижением патрона с лампой в его корпусе. После того как освещение отрегулировано, диафрагму осветителя надо открыть.
Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты "раздавленная капля": небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1 - 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.
Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив - Х20 или Х40, окуляр - Х7 или Х10. Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу, ликвор, ткань паренхиматозных органов (увеличение - Х400).
Цитратную кровь, приготовленную смешиванием 2 объемов крови и одного объема 1,5% раствора лимоннокислого натрия, отстаивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Микроскопируют надосадочную жидкость. Лучшие результаты получают при двойном центрифугировании. Осаждение эритроцитов производят при 3000 об./мин. в течение 15 минут. Затем надосадочную жидкость центрифугируют 30 минут при 10000 об./мин. Полученный осадок микроскопируют. Метод микроскопии цитратной крови - простой и пока единственный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако для подтверждения диагноза с определением серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить серологические и бактериологические исследования. Мочу и ликвор исследуют в нативном состоянии или методом центрифугирования.
Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и др.) забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Взвесь не должна быть слишком густой.
При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, в котором локализуются лептоспиры.
Микроскопию проводят тотчас после приготовления препарата.
При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:
- наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспир, - нитей фибрина, стромы эритроцитов и т.д. От лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;
- наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;
- дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;
- плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.
1.2. Для обнаружения лептоспир в органах и тканях пользуются также окраской мазков-отпечатков по Романовскому - Гимзе, импрегнацией серебром гистологических срезов по Вартину - Стерри и методом иммунофлуоресценции (см. иммунологические методы).
Применение этих приемов открывает дополнительные методические возможности обнаружения лептоспир в органах и тканях, а также позволяет оценить клеточную реакцию на их присутствие.
Выявление лептоспир в тканях особенно целесообразно в целях подтверждения лептоспирозной природы летальных исходов. При соблюдении патологоанатомических требований к забору и фиксации материала лептоспиры могут быть выявлены в любой срок после гибели больного.
Окраска мазков-отпечатков по Романовскому - Гимзе проводится по общепринятой методике.
1.3. Метод импрегнации серебром по Вартину - Стерри основан на серебрении непосредственно срезов (а не кусочков ткани) в кислой среде и состоит из двух этапов. На первом этапе осуществляется серебрение, на втором - проявление. Для импрегнации необходимы следующие реагенты:
а) ацетатный буфер pH 3,6 М 1/125 состоит из уксусной кислоты М/5 (1,2 г на 100 мл) - 18,5 мл; ацетата натрия М/5 (1,64 г на 100 мл) - 1,5 мл; 480 мл кипяченой дистиллированной воды (буфер хранят в холодильнике);
б) 1% азотнокислое серебро на ацетатном буфере (сосуд с раствором оборачивают черной бумагой и хранят в холодильнике не более недели);
в) 2% азотнокислое серебро на ацетатном буфере (хранят в холодильнике в темной посуде до 1 месяца).
Растворы серебра должны быть прозрачными и бесцветными. Кроме того, нужны 5% желатин на ацетатном буфере, который готовят из 10% желатина для инъекций в ампулах путем разведения в 2 раза ацетатным буфером, и 3% гидрохинон в ацетатном буфере. Его готовят непосредственно перед употреблением. Необходимы также спирт 76°, 96°, 100°, ксилол, канадский бальзам.
Техника импрегнации.
Предметные стекла с обеспарафиненными срезами помещают на 2 минуты в ацетатный буфер. Затем переносят в стаканчик с 1% азотнокислым серебром, предварительно нагретым до 56°. Стаканчик оборачивают черной бумагой и помещают в термостат на 30 минут. Стекла со срезами укладывают на стеклянные рельсы и покрывают раствором проявителя, состоящим из 3 мл 2% азотнокислого серебра, 15 мл 5% желатина и 1 мл 3% гидрохинона. Проявитель готовят непосредственно перед употреблением. Ингредиенты добавляют в строго указанном порядке. После добавления каждого ингредиента производят помешивание стеклянной палочкой. Все компоненты проявителя предварительно нагревают до 37 °C. Проявление осуществляется при температуре 37 °C до тех пор, пока срезы не станут светло-золотисто-коричневыми или желтыми. Время проявления варьируют от 3 до 12 минут. Затем препараты прополаскивают в ацетатном буфере при 56 °C 1 - 2 минуты и обезвоживают в спиртах восходящей крепости (70°, 96°, 100°) по 15 минут. После этого препараты следует просветлить в двух порциях ксилола (погрузив в каждую на 10 мин.) и заключить в бальзам.
Препараты исследуют под микроскопом при увеличении Х400 - Х1000. На желтом или золотисто-коричневом фоне обнаруживаются бархатно-черные лептоспиры.
Хорошие результаты получаются при условии строгого соблюдения pH и хорошего качества гидрохинона.
2. Бактериологический метод
Исследуемый материал от больного - кровь, мочу, спинномозговую жидкость в количестве 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.
При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,5 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.
Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 часов в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5% спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.
Посевы следует производить в несколько (3 - 5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 - 30 °C.
Для культивирования лептоспир применяются сывороточные питательные среды Терских и Фервоорта - Вольфа.
Наиболее простой и оптимальной для практического использования является фосфатно-сывороточная среда Терских. Для приготовления основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера Зеренсена <*> (pH 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды.
--------------------------------
<*> Для получения фосфатного буфера Зеренсена соединяют 72 мл
1/15 молярного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия
(11,876 г Na HPO на 1 л дистиллированной воды) и 28 мл 1/15
2 4
молярного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (9,078 г
KH PO на 1 л дистиллированной воды). 2 4
Основу дважды фильтруют через двухслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 °C в течение 30 минут; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком бракуют.
В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 минут при температуре 56 °C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56 °C в течение 1 часа и контроля на стерильность инкубированием при 37 °C в течение суток.
В основу среды Фервоорта - Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л) и NaCl (0,5 г на 1 л).
При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла. Процесс обработки новых или бывших в употреблении пробирок состоит из следующих этапов:
- погружение на 24 часа в 1 - 2% раствор соляной кислоты;
- многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;
- обработка ершами в горячем мыльном растворе (1 кусок хозяйственного мыла на 10 л воды);
- повторное многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;
- погружение в дистиллированную воду на 24 часа;
- сушка и стерилизация вместе с ватными пробками.
Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят "раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле.
При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. После помещают в термостат на 7 - 10 дней при температуре 28 - 30 °C.
В случае получения хорошего роста (50 - 100 лептоспир в поле зрения при увеличении Х400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.
Пробирки, где не выявлен рост лептоспир, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.
Рост лептоспир рабочих музейных штаммов в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые выросшей культурой.
Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.
Аналогичным способом контролируется рост диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.
Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах.
Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл, или 5 капель, стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные 1 - 5 мл ампулы из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев.
При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168 °C) или жидкую фазу (-196 °C) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10% охлаждают с помощью программного замораживателя со скоростью 35 или 60 об. в минуту (от 0 до -130 °C).
Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 °C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.
Выделенные на местах штаммы лептоспир должны быть идентифицированы до серогрупповой принадлежности с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток.
Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитических может
быть проведена по биологическим и культурально-биохимическим
свойствам. При этом учитывают высокую чувствительность патогенных
лептоспир к NaHCO (бикарбонатный тест), в противоположность
3
сапрофитам, которые хорошо размножаются в его присутствии.
Бикарбонатный тест. К 100 мл дистиллированной воды добавляют
0,1 г NaHCO и устанавливают pH = 7,2. Раствор автоклавируют 30
3
минут при 120 °C, снова контролируют реакцию среды и добавляют 10%
от объема среды инактивированной кроличьей сыворотки. Среду
разливают в пробирки по 5 мл и трехкратно (с интервалом 24 часа)
прогревают в водяной бане при 56 °C 30 минут. Ее проверяют на
стерильность путем инкубирования при 37 °C в течение 24 часов.
Испытуемую культуру лептоспир 7-дневного возраста сеют по 0,5 мл в
3 пробирки. Посевы выдерживают 9 дней и затем проверяют
микроскопически. Уже в это время, за редким исключением,
патогенные лептоспиры если и обнаруживаются, то не более 1 - 2
клеток в поле зрения микроскопа при увеличении в 400 раз, а
сапрофитов содержится около 100 особей.
3. Биологический метод
Заражение животных подозрительным на наличие лептоспир материалом производится в следующих случаях:
- для выделения культур лептоспир из контаминированного посторонней микрофлорой материала (различные ткани органов, моча людей и животных, вода открытых водоемов, почва и т.д.);
- для очистки культур лептоспир от посторонней микрофлоры;
- для определения вирулентности штаммов лептоспир;
- для исследования воды открытых водоемов.
Универсальной лабораторной модели для воспроизведения заболеваний различными сероварами лептоспир не существует.
Лучшей моделью для лептоспир Icterohaemorrhagiae являются морские свинки массой 150 - 200 г, у которых заболевание протекает в первые дни с подъемом температуры до 40 - 41 °C и резким падением веса.
На 5 - 10-й день после инфицирования высоковирулентным штаммом у морских свинок появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Животные погибают через 12 - 48 часов после появления желтухи при явлении гипотермии. На вскрытии обнаруживаются увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани на общем ишемическом фоне.
К лептоспирам других серологических групп морские свинки менее восприимчивы.
Картина болезни, аналогичная лептоспирозу, вызванному лептоспирами Icterohaemorrhagiae у морских свинок, может наблюдаться у кроликов-сосунков, золотистых хомячков при заражении их вирулентными культурами лептоспир серогрупп Pomona, Grippotyphosa и др.
Наиболее универсальная модель для воспроизводства экспериментального лептоспироза различных сероваров - золотистые хомячки массой 25 - 40 г.
Заражение животных достигается введением инфекционного материала внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые оболочки.
Подопытных животных ежедневно термометрируют и взвешивают, а на 2-й неделе проводят микроскопию мочи. При обнаружении лептоспир в моче животных забивают и делают посев почек. При повышении температуры у животных производят пункцию сердца и засевают кровь по 0,2 - 0,3 мл в пробирки с питательной средой. В случае появления клинической картины животных также можно забивать и сделать посев из внутренних органов (печени, почек). За животными, не погибшими в первые дни от инфекции, наблюдают в течение месяца. По истечении этого срока их забивают и делают посевы из коркового слоя почек, а из сердца берут кровь для исследования на наличие специфических антител с помощью РМА.
Для исследования воды на наличие патогенных лептоспир золотистым хомячкам, молодым морским свинкам или крольчатам-сосункам вводят внутрибрюшинно соответственно 1,0, 10 и 10 мл испытуемой нецентрифугированной воды.
Водой, подогретой до 30 °C, можно также орошать скарифицированную поверхность кожи животного. Для этого брюшко животного бреют и скарифицируют, после чего его помещают в воду не менее чем на 2 часа так, чтобы скарифицированные участки кожи оказались погруженными в воду.
Испытуемую воду (50,0 мл) можно центрифугировать (в течение 20 минут при 10000 об./мин.). Полученным осадком заражают животных (вводят 2 - 3 мл). Заболевание у животных может развиваться на 5 - 11-й день от момента заражения.
Наблюдение за животными и их исследование ведут в течение месяца. Ввиду отсутствия лабораторных животных, восприимчивых ко всем эпидемически значимым лептоспирам, выделение патогенных лептоспир из воды открытых водоемов удается не во всех случаях.
4. Иммунологические методы
Иммунологические методы являются основными в лабораторной диагностике лептоспироза людей.
В сыворотках крови больных и переболевших присутствуют специфические, соответствующие серовару лептоспир, групповые, межгрупповые и родовые антитела. Родоспецифические антитела без определения серогрупповой принадлежности возбудителя могут быть обнаружены реакциями непрямой гемагглютинации, связывания комплемента, непрямой иммунофлуоресценции иммуноферментным методом и др. Однако до настоящего времени основой серологической диагностики лептоспироза остается реакция микроскопической агглютинации лептоспир (РМА), которая отличается высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет поставить диагноз на уровне серогруппы возбудителя.
Агглютинины в сыворотке крови при лептоспирозе обнаруживаются с 4-го дня болезни. Титры их достигают максимума чаще на 14 - 17-й день заболевания, а затем постепенно снижаются. Однако в некоторых случаях тяжелого отягощенного клинического течения лептоспироза отмечено подавление иммуногенеза (иммунологический шок) с первых суток болезни до 2 - 3 месяцев от ее начала. Это явление обусловлено действием ингибирующего фактора лептоспир (фибринолизин, продукты метаболизма, гемолизин, липолитические вещества и т.д.) на иммунную систему больного, следствием чего является полное отсутствие синтеза антител у таких больных еще до медикаментозного лечения. Наряду с этим антибиотикотерапия больных лептоспирозом также оказывает иммунодепрессивный эффект.
Серологически это характеризуется отрицательным результатом РМА или выявлением антител только в низких разведениях 1:10 - 1:50 у больных с манифестной формой болезни. Это важное обстоятельство необходимо учитывать в оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспироза (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном тяжелые отягощенные случаи заболеваний. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом сохраняются обычно в течение 3 - 5 лет, однако в отдельных случаях могут быть выявлены на более отдаленных сроках после перенесенного заболевания. В этой связи приобретает особое значение метод ретроспективной диагностики (изучение иммунологической структуры людей и сельскохозяйственных животных в очагах лептоспироза).
4.1. Методика постановки РМА при лептоспирозе принципиально не отличается от таковой при других инфекциях, кроме учета результатов, который производят под микроскопом в темном поле.
Для постановки реакции в качестве антигена используют живые культуры лептоспир 4 - 14-дневного возраста с плотностью роста в 50 - 100 и более лептоспир в поле зрения микроскопа (при увеличении в 400 раз), с хорошей подвижностью, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок и пр.).
Постановка реакции агглютинации одновременно со всеми 200 сероварами практически неосуществима. В связи с этим научной группой ВОЗ (1982) предложен диагностический набор штаммов лептоспир, которые обладают широким диапазоном внутригрупповых антигенных связей и могут обеспечивать серогрупповой диагноз.
Для диагностики лептоспироза в медицинских учреждениях используют культуры 13 серогрупп (табл. N 2), включающих одновременно диагностические штаммы, предложенные ВОЗ, и штаммы отечественного происхождения, идентифицированные относительно международных эталонных культур. С лептоспирами всех этих серогрупп исследуют каждую испытуемую сыворотку. В специализированных лабораториях лептоспироза используют полный набор штаммов лептоспир, относящихся к 17 серогруппам.
Схема N 2
СПИСОК ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР
----------------------+----------------+---------------------------------------- ¦ Серогруппа ¦ Серовар ¦ Штаммы ¦ ¦ ¦ +---------------+-------------+---------+ ¦ ¦ ¦ международные ¦отечественные¦ аналоги ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ основные ¦ <*> ¦ +---------------------+----------------+---------------+-------------+---------+ ¦+ Icterohaemorrhagiae¦copenhageni ¦M-20+ ¦Судьин ¦Мич ¦ ¦Javanica ¦poi ¦Poi ¦Sorex I ¦Еж 3433 ¦ ¦Celledoni ¦celledoni <****>¦Celledoni ¦<**> ¦ ¦ ¦+ Canicola ¦canicola ¦Hond-Utrecht IV¦Каширский+ ¦Казань ¦ ¦Ballum ¦castellonis ¦Castellon 3 ¦<**> ¦Макаров ¦ ¦Pyrogenes ¦pyrogenes ¦Salinem ¦<**> ¦ ¦ ¦Cynopteri ¦cynopteri ¦Vleermuis 3868 ¦<**> ¦ ¦ ¦Autumnalis ¦autumnalis ¦Akijami A ¦Erinaceus 670¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦<***> ¦ ¦ ¦Australis ¦bratislava ¦Jez Bratislava ¦Еж N 1 ¦ ¦ ¦+ Pomona ¦pomona ¦Pomona+ ¦Шали ¦Шагров, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Гиацинт, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Сарпин- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ский ¦ ¦+ Grippotyphosa ¦grippotyphosa ¦Moskva V+ ¦Moskva V ¦Дмитров- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ский, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦Vitulina,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Осеньчук ¦ ¦+ Hebdomadis ¦wolffi ¦3705+ ¦Гамзулин ¦ДВ-II ¦ ¦ ¦ ¦ ¦<***> ¦ ¦ ¦ ¦borincana <****>¦Hs 622 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦szwajizak <****>¦Szwajizak ¦ ¦ ¦ ¦Bataviae ¦djatzi ¦Hs-26 ¦Micromys ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦minutus 167 ¦ ¦ ¦+ Tarassovi ¦tarassovi ¦Perepelicin+ ¦Perepelicin ¦Т-384 ¦ ¦Panama ¦panama <****> ¦Cz 214K ¦<**> ¦ ¦ ¦Shermani ¦shermani <****> ¦Lt 821 ¦<**> ¦ ¦ ¦Huanuco ¦huanuco <****> ¦M-4 ¦<**> ¦ ¦ ----------------------+----------------+---------------+-------------+----------
--------------------------------
<*> Штаммы, по антигенной структуре идентичные основным отечественным штаммам, соответственно определенным серогруппам.
<**> Лептоспиры, принадлежащие к этой серогруппе, еще не выделены в СССР.
<***> Штаммы отечественного происхождения по серовару не тождественны международному эталону, но относятся к той же серогруппе.
<****> Штаммы этих сероваров включаются для диагностики только в лабораториях лептоспирозов.
+ - Основные диагностические штаммы.
В административных территориях, где на протяжении ряда лет регистрируются заболевания лептоспирозом, вызываемые лептоспирами, относящимися только к 6 основным серогруппам, разрешается пользоваться для диагностики этого заболевания не 13, а 6 основными диагностическими штаммами (табл. N 2), при этом в лабораториях поддерживается полный набор штаммов. К основным 6 диагностическим штаммам относятся: М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae), Каширский (Canicola), Pomona (Pomona), Moskva V (Grippotyphosa), 3705 (Hebdomadis) и Перепелицин (Tarassovi).
При серологическом исследовании нативной сыворотки (консервированной или без консерванта), а также людей и животных пользуются высушенной каплей крови или сыворотки на чистой фильтровальной бумаге. В этом случае кровь из пальца в количестве 4 - 6 капель (каждая размером 15 - 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции вырезают 2 участка фильтровальной бумаги размером с двухкопеечную монету, которую разрезают на несколько частей и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого делают остальные разведения капельным способом. Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре и в течение 6 месяцев при хранении в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при +4 °C.
При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. В случаях, когда извлечь кровь пастеровской пипеткой не удается, прибегают к вскрытию полости сердца. Для постановки РМА сыворотку больных разводят физиологическим раствором в отношениях 1:10 и 1:100 и в случае положительной реакции определяют ее конечный титр (1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 и т.д.). Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 и также титруют, если реакция положительная.
При постановке реакции микроагглютинации можно использовать сыворотки, обработанные мертиолятом натрия в разведении 1:10000.
Разведенная сыворотка и живая культура диагностического набора штаммов лептоспир смешиваются в равных объемах (по 0,2 мл) в агглютинационных пробирках. В контрольную пробирку наливают 0,2 мл физиологического раствора и 0,2 мл культуры. Пробирки встряхивают и оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего производят окончательный учет реакции в препаратах "раздавленная капля" под микроскопом в темном поле зрения. Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается. Удобно использовать для постановки серологической реакции пластины из полистирола с лунками. В каждую лунку вносят 1 каплю сыворотки соответствующего разведения и прибавляют 1 каплю культуры диагностического набора. Пластины со смесями кладут одна на другую, сверху закрывают пустой пластиной (для предохранения от высыхания) и выдерживают при комнатной температуре 2 часа. Затем производят учет реакции, оценивая результаты в крестах по 3-балльной схеме:
+++ - агглютинированы 100% лептоспир;
++ - агглютинированы 75% лептоспир;
+ - агглютинированы 25 - 30% лептоспир.
Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании "паучков", "бантиков", "кос".
В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать не менее двух раз: первый - в первые 3 дня заболевания, а второй - не ранее 5-го и в последующие дни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-е отр. и 2-е - 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.
При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:20 и выше (соответственно срокам болезни).
При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1 - 2 неделе заболевания, наблюдается реакция не только к антигену, вызвавшему заболевание, но и к лептоспирам 2 - 9 других серологических групп. Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona. Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.
Наличие межгрупповых реакций затрудняет установление этиологического агента лептоспироза людей.
Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у того или иного конкретного больного прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что микроглобулиновые антитела (IgG) отличаются большей специфичностью, чем макроглобулины (IgM), и в 85% случаев реагируют только с гомологичными антигенами.
4.2. Определение IgM и IgG-антител в РМА.
Для определения антител классов IgM и IgG используют препараты, разрушающие в сыворотке IgM-антитела с потерей агглютинирующей активности. Однако редуценты не нарушают серологической активности IgG-антител.
В качестве редуцирующих веществ наиболее часто применяют 2-меркаптоэтанол (2-МЕ) и цистеин. Использование 2-меркаптоэтанола небезопасно вследствие неприятных побочных свойств. В связи с этим разлив редуцента и добавление его к сыворотке следует осуществлять в вытяжном шкафу с соблюдением мер личной безопасности. Цистеин - вещество, лишенное недостатков 2-меркаптоэтанола и обладающее равной с ним активностью. Однако после обработки сывороток цистеином в результате окисления кислородом воздуха образуется цистид в виде белого осадка, который затрудняет чтение реакции в начальных разведениях, создавая впечатление о наличии положительной реакции.
4.2.1. Техника обработки сывороток 2-меркаптоэтанолом.
0,2 М раствор 2-меркаптоэтанола готовят непосредственно перед употреблением. 0,15 мл 2-меркаптоэтанола растворяют в 10 мл фосфатного буфера с pH 7,2 - 7,4. К исследуемой сыворотке, разведенной фосфатным буфером в 5 раз, добавляют равное количество 0,2 М раствора 2-меркаптоэтанола, который в контрольных пробирках заменяют равным объемом буфера. Пробирки закрывают резиновыми пробками, выдерживают 2 часа при 37 °C, а затем помещают на 14 часов в бытовой холодильник. В качестве антигена используют живые культуры лептоспир, как и в обычной реакции.
4.2.2. Техника обработки сывороток цистеином.
Инактивацию IgM-антител цистеином проводят по методике Е.В. Чернохвостовой (1965). Навеску цистеина 314 мг растворяют в 10 мл 0,2 М раствора едкого натра. Каждую испытуемую сыворотку разводят буферным раствором 1:5 и затем делят на 2 части. К одной добавляют равный объем раствора цистеина, а к другой - также равный объем 0,85% раствора поваренной соли. Пробирки со смесями закрывают резиновыми пробками, выдерживают 18 - 20 часов в термостате при 37 °C. Сыворотки разводят и испытывают в РМА.
С целью разграничения противолептоспирозных агглютининов различных классов обработанные редуцирующими веществами и контрольные сыворотки параллельно испытывают в РМА по общепринятой методике.
Контрольные сыворотки, реагирующие в реакции на 2 - 3 креста, исследуют в ряде последовательных разведений с целью определения конечного титра. Затем подобным образом изучают сыворотки с редуцирующим агентом с целью определения IgG-антител.
Результаты титрования антител оценивают сопоставлением их уровня в сыворотках, обработанных редуцентами, и нативных. Если концентрация антител в обеих пробах совпадает, их определяют как IgG. О наличии IgM судят по полному отсутствию антител в обработанных образцах или четырехкратному и более снижению титров в сыворотках, подвергшихся воздействию редуцента, по сравнению с контрольными.
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное