Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 N 535

Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений

Микробиологические (бактериологические) исследования занимают важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях.

Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.

Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие изменилась: значительно увеличился удельный вес заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами (около 200 видов условно-патогенных микроорганизмов). Возрастает роль неспорообразующих анаэробов и некоторых других видов микроорганизмов, роль которых в инфекционной патологии ранее была неизвестна.

Принадлежность возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний к условно-патогенным и сапрофитическим организмам существенно изменяет проведение и оценку микробиологических (бактериологических) исследований и требует новых методических подходов.

Для развития микробиологических (бактериологических) исследований в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений необходимо дальнейшее совершенствование материально-технической базы лабораторий, расширение номенклатуры стандартных селективных питательных сред, стандартных наборов для экспресс-методов идентификации условно-патогенных микроорганизмов, агглютинирующих сывороток и увеличение выпуска некоторых видов оборудования.

Требует совершенствования система заявок на бактерийные препараты для клинико-диагностических лабораторий.

В целях совершенствования микробиологических (бактериологических) лабораторных исследований в лечебно-профилактических учреждениях, повышения уровня и эффективности микробиологической диагностики:

I. Утверждаю:

1. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях (Приложение 1).

2. Задание на разработку сухих питательных сред, тест-наборов, агглютинирующих сывороток для диагностики заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (Приложение 2).

II. Приказываю:

1. Министрам здравоохранения союзных и автономных республик, заведующим краевыми, областными отделами здравоохранения, начальникам главных управлений здравоохранения Московского, Ленинградского, Киевского и Ташкентского горисполкомов и Московского облисполкома:

- обеспечить освоение сотрудниками клинико-диагностических лабораторий унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования и организовать, начиная с 1985 года, проведение микробиологических (бактериологических) исследований во всех клинико-диагностических лабораториях по унифицированным методам, утвержденным настоящим Приказом (согласно Приложению 1).

2. Главному управлению по производству бактерийных и вирусных препаратов (тов. Хлябич Г.Н.) для обеспечения проведения микробиологических (бактериологических) исследований в соответствии с унифицированными методами, принять меры по увеличению номенклатуры современных унифицированных питательных селективных сухих стандартных сред для условно-патогенных микроорганизмов; тест-систем для идентификации микроорганизмов; агглютинирующих сывороток (в соответствии с Приложением 2).

3. Главному аптечному управлению Министерства здравоохранения СССР (тов. Клюев М.А.), в целях наиболее полного удовлетворения потребности клинико-диагностических лабораторий бактерийными препаратами, организовать их обеспечение в соответствии с номенклатурой, предусмотренной заявкой на бактерийные и вирусные препараты, через Министерства здравоохранения союзных республик.

4. Главному управлению учебных заведений Министерства здравоохранения СССР (тов. Лакин К.М.) в течение 1986 года разработать методические рекомендации по применению унифицированных методов исследования для преподавателей кафедр микробиологии институтов усовершенствования врачей.

Контроль за выполнением настоящего Приказа возложить на Главное управление лечебно-профилактической помощи (тов. Москвичев А.М.).

Разрешается размножить Приказ в необходимом количестве.

Заместитель Министра
Ю.Ф.ИСАКОВ

Приложение 1
к Приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 22 апреля 1985 г. N 535

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ УНИФИЦИРОВАННЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ (БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ) МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ

Перечень унифицированных микробиологических методов исследования

1. Микробиологические методы исследования биологического материала.

1.1. Микробиологические методы исследования крови.

1.2. Микробиологические методы исследования спинномозговой жидкости.

1.3. Микробиологические методы исследования желчи.

1.4. Микробиологические методы исследования мочи.

1.5. Микробиологические методы исследования отделяемого дыхательных путей.

1.6. Микробиологические методы исследования открытых инфицированных ран.

1.7. Микробиологические методы исследования отделяемого глаз.

1.8. Микробиологические методы исследования отделяемого ушей.

1.9. Микробиологические методы исследования отделяемого женских половых органов.

1.10. Микробиологические методы исследования материалов при аутопсии.

2. Микробиологические методы идентификации микроорганизмов различных родов и семейств <*>.

--------------------------------

<*> Идентификация проводится с применением бактерийных препаратов в соответствии с номенклатурой заявки-заказа на бактерийные и вирусные препараты Главного аптечного управления Министерства здравоохранения СССР.

2.1. Микробиологические методы идентификации микробов рода стафилококка (Staphylococcus).

2.2. Микробиологические методы идентификации микробов семейства стрептококковых (Streptococcaceae).

2.3. Микробиологические методы идентификации микробов семейства нейссериевых (Neissariaceae).

2.4. Микробиологические методы идентификации микробов рода гемофилус (Haemophilus).

2.5. Микробиологические методы идентификации микробов рода коринебактерия (Corynebacterium).

2.6. Микробиологические методы идентификации микробов семейства энтеробактериевых (Enterobacteriaceae).

2.7. Микробиологические методы идентификации микробов рода псевдомонас (Pseudomonas).

3. Общие методы исследования.

3.1. Микроскопические методы (окраска препаратов).

3.2. Культуральные методы (питательные среды).

3.3. Биохимические методы.

1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

1.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ

Сепсис, бактериемию могут вызывать практически все микроорганизмы, относящиеся к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Из последних наибольшее значение имеют: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Aerococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa; представители родов: Klebsiella, Yersinia, Candida и другие.

Взятие исследуемого материала

1. Кровь для посева следует брать, соблюдая правила асептики, для того, чтобы избежать попадания микроорганизмов из внешней среды.

2. Посев необходимо проводить во время подъема температуры, в начале появления лихорадки.

3. Кровь для посева следует брать до начала специфического антибактериального химиотерапевтического лечения, или, по крайней мере, через 12 - 24 часа после последнего введения препарата больному (в зависимости от скорости выведения примененного препарата из организма). Следует учитывать также стадию заболевания с тем, чтобы взять кровь для посева в то время, когда предполагается бактериемия (например, при брюшном тифе в первые 10 - 15 дней от начала заболевания).

4. Для результативного бактериологического исследования необходимо сеять достаточные количества крови (не менее 10 мл у взрослых и 5 мл у детей) в большое количество жидких питательных сред. Это делается для того, чтобы путем разведения крови (1:10 - 1:60) преодолеть естественные бактерицидные свойства крови. Для нейтрализации антибактериальных факторов крови, включая комплемент, рекомендуется, по возможности, применять полианитол-сульфонат натрия 0,025 - 0,03%.

5. Для взятия крови необходимо пользоваться стерильным шприцем. Системы для одноразового пользования или шприцы, простерилизованные в централизованной стерилизационной, освобождают от упаковки только непосредственно перед употреблением. При отсутствии централизованной стерилизационной надо прокипятить 20-граммовый (для детей 10-граммовый) шприц и соответствующие иглы с мандреном для венопункции в течение 30 - 45 минут в отдельном стерилизаторе. По окончании стерилизации слить воду и остудить шприц, не открывая стерилизатора. Собрать шприц с помощью стерильного пинцета, насадить иглу и вытащить мандрен. Нельзя пользоваться шприцем со "стерильного стола" в перевязочной, т.к. на нем могут оказаться бактерии из воздуха. По той же причине нельзя проверять проходимость простерилизованного шприца и иглы воздухом.

6. Кровь на посев берут у постели больного или в перевязочной стерильным шприцем или системой для взятия крови одноразового пользования с соблюдением всех правил асептики и засевают тут же у постели больного. Взятие крови и ее посев осуществляют, как правило, два человека. Пока один человек обрабатывает кожу больного над пунктируемой веной, пунктирует вену и берет кровь, другой - над пламенем спиртовки открывает пробки флаконов, подставляет флаконы со средой под струю крови из шприца или системы, обжигает горлышки и пробки флаконов и закрывает их.

    Кожу   над  пунктируемой  веной  обрабатывают  70%  спиртом,  затем  5%
настойкой  йода,  затем  снова  спиртом. При наличии у больного постоянного
подключичного  катетера или капельницы в вене можно воспользоваться ими для
получения крови. Некоторому количеству крови дают свободно стечь в пробирку
(эту  кровь  можно использовать для биохимических анализов), затем набирают
кровь  в  шприц  для  посева.  Для полноценного бактериологического анализа
нужно  получить  12  -  20  мл  крови,  которую  тут  же  засевают на набор
питательных  сред. Для получения "толстой капли" одну каплю крови из шприца
или  системы  помещают  на  предметное  стекло и подсушивают ее на воздухе,
                                                                __
фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (спирт - эфир аа) и затем
окрашивают  спиртово-водным  раствором  метиленового  синего (96% этилового
спирта  - 10 мл, метиленового синего - 1 г, дистиллированной воды - 100 мл)
или  по  Романовскому-Гимза. Врач-бактериолог должен следить за соблюдением
правил  асептики  на  всех  этапах  взятия  и  посева крови. Если возникает
подозрение,   что   в   какой-то   момент   в  посев  крови  могли  попасть
микроорганизмы  из  внешней  среды  (с  кожи  больного, с рук персонала, из
воздуха  и  т.п.)  и  нет  возможности  повторить  посев,  следует  сделать
специальную   пометку  на  соответствующем  флаконе,  чтобы  соответственно
оценить результаты посева.

Посев исследуемого материала

Рекомендуется производить посев крови на несколько питательных сред, чтобы обеспечить возможность роста максимально большему числу возможных возбудителей. Минимально следует использовать две среды: "двойную среду" и "среду для контроля стерильности".

Питательные среды для первичного посева:

1. "Двойная среда", состоящая из скошенного во флаконе 150 мл 1,7% - 2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь засевают в жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 37 °C. Флаконы ежедневно просматривают, при этом, наклоняя флакон, смачивают поверхность скошенного агара бульоном. Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и, следовательно, уменьшает риск загрязнения при пересевах.

2. "Среда для контроля стерильности". Эту среду следует обогатить, добавив дрожжевой экстракт до 20 г на 1 литр (не менее 15 г) и агар до 5 г на 1 литр (не менее 4,25 г). Добавляют к среде 0,001 г резазурина - индикатора кислорода. Анаэробные условия контролируют по розовому окрашиванию среды. При покраснении более 20% столбика среды можно ее регенерировать на водяной бане в течение 20 минут при 100 °C. Однако, эту операцию можно производить только один раз. Среда дает возможность получить рост некоторых анаэробных и полуанаэробных микроорганизмов.

3. "Среда со стаканчиком" (А.И. Сироко, 1969 г.), - для предварительного лизиса форменных элементов крови. Для приготовления этой среды во флаконы с широким горлом (диаметром 30 мм), емкостью 250 мл наливают 50 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% агара. В этот флакон пинцетом опускают стеклянный стаканчик или пробирку длиной 70 мм и диаметром 20 - 22 мм, в которой находится 12 мл концентрированной питательной среды: (состав: на 100 мл перевара Хоттингера с остаточным азотом 750 - 800 мг%, 2 г глюкозы, 2 г хлористого натрия, pH 7,5 - 7,4). Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм.

Для получения гемокультуры в "среде со стаканчиком" в агаризованную воду помещают 3 - 5 мл крови. Оставляют флакон при комнатной температуре на 30 - 40 минут для гемолиза форменных элементов крови. Затем, наклоняя флакон, выливают содержимое стаканчика в водный раствор с кровью, флакон ставят в термостат. Посев гемолизированной крови позволяет выявить бактериемию в ряде случаев, тогда когда на других средах роста нет. Высвобождение микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах или подвергшихся незавершенному фагоцитозу, а также снижение антибактериальной активности гемолизированной крови, делает эту среду особенно ценной при заболевании, для которого характерна незавершенность фагоцитарной реакции.

4. Полужидкая среда Тароцци с 0,5% глюкозы и 0,1% агара во флаконах по 300 или 150 мл. Во флаконы сеют 5 мл и 3 мл крови (соответственно количеству среды) (см. раздел 3.2).

5. Жидкая среда Сабуро служит для выявления грибковых септических состояний.

Приготовление: на 1 литр дистиллированной воды берут 10 г пептона, 25 г хлористого натрия, 40 г глюкозы. Разливают во флаконы по 150 - 200 мл, стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут (pH 5,5). В жидкую среду Сабуро засевают 3 - 4 мл крови.

Культивирование. Засеянные кровью среды инкубируют в течение 6 недель в термостате при 37 °C. Просматривают ежедневно в течение первых 8 дней. При появлении видимого роста делают мазки, окрашивают их по Граму, и, в соответствии с данными бактериоскопии, делают высевы на среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам и проводят идентификацию выделенных бактерий. При подозрении на анаэробную флору делают параллельные высевы для культивирования в аэробных и анаэробных условиях.

При отсутствии видимого роста на 3, 5, 8 день из всех сред, кроме "двойной среды" и "среды для контроля стерильности", делают высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром и мазки на стеклах, которые окрашивают по Граму. Посевы на чашках инкубируют при 37 °C в аэробных или анаэробных условиях соответственно предположительному заключению о характере флоры в мазках по Граму. Выращенные бактерии идентифицируют, определяют их свойства, чувствительность к антибактериальным препаратам, фагам и т.п.

При отсутствии роста на 9 - 10 день дают отрицательный ответ. Однако флаконы с засеянной средой выбрасывать не рекомендуется. Необходимо продолжать держать их в термостате в течение 4 - 6 недель, проверяя появление роста 2 - 3 раза в неделю. За это время может быть выявлен замедленный рост персистирующих бактерий, бактерий в L-форме и т.п. При этом, если флаконы закрыты ватно-марлевыми пробками, их нужно запарафинировать смесью воска (1/3) и парафина (2/3) для предотвращения высыхания среды. При отсутствии на средах видимого роста микроорганизмов в первые двое суток следует особенно строго соблюдать правила, обеспечивающие стерильность, т.к. возможность попадания посторонней флоры во время повторных пересевов возрастает с каждым последующим пересевом.

Оценка результатов

При наличии роста результаты оцениваются в зависимости от вида выделенных бактерий, скорости и массивности роста. Рост на всех используемых средах, в большинстве случаев, должен быть расценен как явная бактериемия, если нет оснований считать, что во время взятия крови произошло загрязнение бактериями внешней среды. При соблюдении всех правил асептики, выделение даже таких "непатогенных" видов как эпидермальный стафилококк или кишечная палочка следует считать проявлением бактериемии. У целого ряда больных, для которых характерно понижение иммунореактивности организма (у онкологических, ожоговых больных, при лучевой болезни и т.п.), эти и другие так называемые "непатогенные" микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.

При появлении роста на одной, двух или трех средах следует соотносить результаты посева с клиническими данными и с результатами предыдущих (и последующих) бактериологических исследований. Наличие в других материалах от того же больного идентичных штаммов микроорганизмов свидетельствует о том, что выделение этих микробов в посеве крови не случайно.

При отсутствии роста в аэробных условиях и наличии грамотрицательных палочек в осадке при посеве на среду Тароцци следует повторно сеять кровь в анаэробных условиях с целью выделения анаэробов, особенно неспорообразующих видов бактероидов, клостридий и др.

Рекомендуется производить повторные посевы крови, которые позволяют не только подтвердить бактериологический диагноз, но и проводить контроль эффективности лечения.

1.2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ

Спинномозговую жидкость исследуют во всех случаях предполагаемого менингита как первичного процесса, так и осложнения после черепно-мозговой травмы, нейрохирургической операции или наличия инфекционного очага в организме.

Наиболее частыми возбудителями менингита у новорожденных являются: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus (гр. B, D), Listeria monocitogenes. У детей раннего возраста: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis.

У лиц пожилого возраста и ослабленного контингента больных возникновение менингита может быть как результатом заражения N. meningitidis, S. pneumoniae, так и проявлением внутригоспитальной инфекции, вызванной H. influenzae, S. pneumoniae, Salmonella. Этиологическим фактором менингитов, развившихся после черепно-мозговой травмы или как осложнение после нейрохирургических операций, чаще всего являются Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, S. pyogenes, P. aeruginsa, E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens.

Как правило, менингит вызывается только одним микроорганизмом.

Взятие исследуемого материала

Для бактериологического анализа обычно используют спинномозговую жидкость, взятую при люмбальной пункции или при пункции боковых желудочков мозга.

Взятие спинномозговой жидкости проводят как можно раньше, желательно до начала антибактериального лечения.

Взятие спинномозговой жидкости производит врач. Проба отбирается со строгим соблюдением правил асептики. Свежевзятый ликвор из шприца без иглы над спиртовкой вносят в стерильную, желательно центрифужную пробирку в количестве 1 - 2 мл. Ликвор для исследования немедленно доставляют в лабораторию, где тотчас, пока спинномозговая жидкость теплая, ее подвергают анализу, т.к. некоторые микроорганизмы, например, N. minigitidis, при охлаждении погибают. При отсутствии такой возможности материал сохраняют при 37 °C в течение нескольких часов. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термос или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °C.

Микроскопия исследуемого материала

Спинномозговую жидкость центрифугируют 5 минут при 3500 об./мин. и из осадка делают мазки. Если присланная жидкость мутная, мазки готовят без центрифугирования.

1. При исследовании ликвора с неопределенным возбудителем или на менингококк мазки после высушивания фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим или по Граму в модификации Калины.

Окраска по Граму в модификации Калины препаратов из ликвора и культур.

Приготовление растворов

А. 0,5% спиртовой раствор бриллиантового зеленого:

бриллиантового зеленого 0,05 г;

спирта этилового чистого 10,0 мл.

Хранить во флаконе с резиновой пробкой.

Б. Основной реактив:

0,5% спиртовой раствор йодистого калия - 96 мл;

5% спиртовой раствор основного фуксина - 2 мл;

5% спиртовой раствор йода - 2 мл.

0,5% спиртовой раствор йодистого калия готовят при подогревании в водяной бане. После полного растворения навески йодистого калия в спирте раствор соединяют с раствором фуксина и йода. Полученную смесь хранят во флаконе из темного стекла с притертой или резиновой пробкой.

В. Раствор спирта:

спирта этилового 96% - 30 мл;

дистиллированной воды - 70 мл.

Г. Водный раствор фуксина:

основной фуксин Циля - 1 мл;

дистиллированной воды - 9 мл.

Раствор готовят ежедневно.

Окраска мазка

На обезжиренное стекло наносят каплю воды. В ней суспендируют культуру и туда же вносят петлей каплю раствора бриллиантовой зелени. После высыхания препарат фиксируют над пламенем. Затем на препарат наливают основной реактив на 1,5 - 2 минуты, после чего краску сливают и стекло в наклонном положении промывают водой.

Далее препарат в наклонном положении промывают в спирте до отхождения облачков краски и немедленно отмывают водой. Затем производят докрашивание препарата водным раствором фуксина в течение 2 минут, окончательную промывку водой и подсушивание. При микроскопировании грамотрицательные бактерии выглядят ярко-розовыми, грамположительные - зеленовато-черными или темно-фиолетовыми. Желательно для контроля на каждом стекле делать мазок культур стафилококков или кишечной палочки.

2. Для обнаружения микобактерий туберкулеза мазки готовят из фибринозной пленки или осадка после центрифугирования. Препарат из фибринозной пленки следует готовить тонким, осторожно растягивая ее слегка подогретой бактериологической петлей или растирая между двумя предметными стеклами. Мазки красят по Цилю-Нильсену.

Результаты микроскопии окрашенного мазка спинномозговой жидкости в ряде случаев позволяют установить наличие туберкулезных бацилл, менингококков или условно-патогенных бактерий, вызвавших гнойный менингит. В соответствии с этими результатами вносят коррективы в ход бактериологического исследования. Результаты микробиологического исследования сообщаются лечащему врачу как предварительные данные. Окончательный ответ при бактериоскопическом исследовании выдается только при обнаружении Mycobacterium tuberculosis.

Посев исследуемого материала

Так как гнойные менингиты имеют различную этиологию, то при исследовании спинномозговой жидкости с неопределенным возбудителем необходимо производить посев ликвора на несколько питательных сред с целью выделения более широкого спектра возбудителей.

Питательные среды для первичного посева

    1. Сывороточный агар.                          ¬
    2. 5% кровяной агар.                           ¦
    3. "Среда для контроля стерильности".          ¦ (см. раздел 3.2)
    4. Агар с гретой кровью (шоколадный агар).     ¦
    5. Простой агар.                               -

6. Полужидкий агар для обогащения ликвора, приготовленного на бульоне из перевара Хоттингера или рыбного гидролизата. К 4 мл 0,1% полужидкого питательного агара (pH 7,4) добавляют 1 мл предварительно инактивированной лошадиной или бычьей сыворотки с консервантом или без него.

    Культивирование.  Проводят  посев  2  -  4  капель гнойного ликвора или
ресуспензированного  осадка  на  чашку  со свежеприготовленным сывороточным
агаром,  на  чашку с кровяным агаром, простым агаром, на среду для контроля
стерильности.  Капли  материала  слегка  растирают  подогретым  шпателем на
поверхности  агара.  После  этого  одну  чашку  с простым агаром помещают в
термостат  в  обычной  атмосфере  при  37  °C,  а  2  другие инкубируют при
повышенной  концентрации  CO .  Для  этого  чашки  помещают  в эксикатор, в
                            2
котором   создается  повышенное  содержание  CO   за  счет  горящей  свечи.
                                               2
Инкубация   при   повышенных   концентрациях   CO   способствует  выявлению
                                                 2
патогенных  нейссерий,  пневмококков,  листерий  и др. При подозрении на H.
influenzae производят посев на чашку с шоколадным агаром.

В пробирку, к оставшемуся от посева и микроскопирования осадку, добавляют 5 мл стерильного 0,1% полужидкого агара и помещают в термостат для накопления.

На второй день просматривают сделанные накануне посевы спинномозговой жидкости. При появлении роста на плотных питательных средах изучают характер роста, морфологию выросших бактерий при окраске по Граму.

У бактерий, выросших на плотных питательных средах, определяют чувствительность к антибиотикам, а также проводят отсевы на элективные среды для получения чистой культуры с последующей их идентификацией.

При отсутствии роста колоний на твердых средах делают высев из среды накопления на чашку с сывороточным агаром и кровяную чашку.

Твердые среды с посевами ликвора при отсутствии роста на протяжении 24 часов надо инкубировать в течение 3 - 6 дней. При отрицательных результатах высевы повторяют через 8 - 10 дней.

Оценка результатов исследования

Спинномозговая жидкость является стерильной средой, поэтому выделение любого микроорганизма должно расцениваться как положительный результат. Редко нахождение условно-патогенных микроорганизмов и сапрофитов, которые ранее никогда не выявлялись, может вызвать сомнение и расцениваться как загрязнение или в момент взятия пробы, или при повторных высевах со среды обогащения. В таких случаях большое значение имеют клинические данные.

При вторичных менингитах, обусловленных инфекцией гнойновоспалительных процессов различной локализации (абсцесс, флегмона, отит, синусит, язвы от пролежней, фурункулы) необходимо провести микробиологическое исследование этого очага, потому что возможна вероятность обнаружения идентичных микроорганизмов и в спинномозговой жидкости.

У детей параллельно с исследованием спинномозговой жидкости необходимо проводить исследование гемокультур, так как менингиты часто связаны с бактериемией, и она предшествует появлению микроорганизмов в спинномозговой жидкости. При хронических процессах с временным улучшением желательно провести микробиологические исследования ликвора после окончания антибактериального лечения.

1.3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖЕЛЧИ

Желчь исследуют при воспалительных заболеваниях желчного пузыря и желчных протоков (холециститы, холангиты, желчно-каменная болезнь). В норме желчь стерильна, но при инфицировании желчи в 70% - 80% случаев высевают Escherichia coli, Enterococcus, несколько реже Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, а также Salmonella (при временном и хроническом бактерионосительстве). Из анаэробных микроорганизмов выделяют Clostridium perfringens, в 10% - 20% случаев желчно-каменной болезни - Peptococcaceae. В отдельных случаях встречается смешанная аэробная и анаэробная инфекция.

Взятие исследуемого материала

Желчь собирают при зондировании в процедурном кабинете отдельно по порциям A, B и C в три стерильные пробирки, либо во время операции с помощью шприца в одну пробирку, соблюдая правила асептики. Полученные порции желчи доставляют в лабораторию не позднее 1 - 2 часов от момента взятия, следя за тем, чтобы пробирки находились в строго вертикальном положении.

Посев исследуемого материала

Питательные среды для первичного посева: (см. раздел 3.2).

1. 5% кровяной агар.

2. Среда Эндо.

3. "Среда для контроля стерильности" или среда Тароцци.

4. Селенитовый бульон для накопления сальмонелл или шигелл.

Культивирование. По 0,1 мл каждой порции желчи высевают на чашку с кровяным агаром; по 0,5 мл - на чашку со средой Эндо; в соотношении 1:9 - в селенитовый бульон (среда накопления). Для обеспечения роста анаэробов посев производят на "среду для контроля стерильности" или в две пробирки со средой Тароцци, одну из пробирок прогревают на водяной бане 20 минут при 80 °C для уничтожения аэробной флоры. Посев и исходный материал (все порции сливают в одну пробирку) помещают в термостат при 37 °C. На второй день. Учитывают результаты первичных посевов. В случае бактериального роста на кровяном агаре подсчитывают количество колоний каждого вида, пересчитывают на 1 мл исследуемого материала и после бактериоскопии окрашенных по Граму мазков проводят дальнейшую идентификацию культур и определяют чувствительность к антибиотикам.

При подозрении на рост анаэробных культур посевы инкубируют в анаэростате, заполненном инертным газом. В случае выделения анаэробов проводят их дальнейшее изучение. При отсутствии роста на среде Тароцци наблюдение ведут 5 дней.

С целью выделения сальмонелл в последующие 3 дня делают высевы на элективные среды (висмут - сульфитный агар) как со среды накопления, так и из нативной желчи, которая в течение трех дней выдерживается в термостате.

Оценка результатов

Наиболее достоверным является исследование желчи, полученной во время операции. При дуоденальном зондировании возможна контаминация желчи микрофлорой ротовой полости и верхних отделов пищеварительного тракта. Так, стафилококки и стрептококки находят в дуоденальном содержимом значительно чаще, чем в желчном пузыре при оперативном вмешательстве. Поэтому следует с особой осторожностью подходить к определению этиологической роли указанных микроорганизмов при холециститах и холангитах. Необходимо проводить количественное определение каждого вида бактерий в 1 мл желчи, т.к. по степени микробного обсеменения можно судить о локализации воспалительного процесса и более объективно оценивать его динамику при повторных исследованиях. Выделение золотистого стафилококка в значительном количестве может свидетельствовать о наличии печеночного или диафрагмального абсцесса. Обнаружение в дуоденальном содержимом сапрофитных нейссерий и дрожжеподобных грибов свидетельствует о контаминации желчи микрофлорой ротовой полости.

1.4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЧИ

Исследование мочи направлено на выделение возбудителя заболевания и на количественное определение степени бактериурии.

Моча здорового человека стерильна. Однако при прохождении через мочеиспускательный канал она может загрязняться вегетирующей в нем микрофлорой. В дистальном отделе уретры в норме обнаруживают следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermis, Streptococcus faecalis, микроорганизмы семейства и родов: Corynebacterium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Bacteroides и некоторые другие виды.

Возбудителями воспалительных процессов в мочевой системе наиболее часто являются условно-патогенные бактерии Escherichia coli, S. faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Citrobacter, Klebsiella pneumoniae, Serratia, несколько реже - Staphylococcus aures, S. epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Mycoplasma. Представители рода Salmonella и семейства Mycobacteriaceae также могут быть выделены из мочи при заболеваниях мочевой системы.

Взятие исследуемого материала

Исследованию подлежит средняя порция свободно выпущенной мочи, взятой в количестве 3 - 5 мл в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Катетеризация мочевого пузыря для рутинного исследования не применяется, так как она может привести к инфицированию мочевых путей. К катетеризации мочевого пузыря прибегают в некоторых случаях для уточнения локализации инфекции - в мочевом пузыре или в почках. С этой целью мочевой пузырь опорожняют катетером и промывают раствором антибиотика, после чего с интервалом в 10 минут берут пробы мочи для исследования. Если инфекция локализуется в почках, микроорганизмы содержатся во всех порциях мочи. При инфекции мочевого пузыря моча остается стерильной.

В отдельных случаях делают надлобковую пункцию мочевого пузыря, при которой получают наиболее достоверные результаты.

Материал для исследования следует брать до начала антибактериальной терапии или в интервалах между курсами лечения.

Содержащиеся в моче микробы быстро размножаются при комнатной температуре, что может дать ложные результаты при определении степени бактериурии. В связи с этим, от момента взятия пробы мочи до начала ее исследования в лаборатории должно проходить не более 1 - 2 часов при хранении при комнатной температуре и не более суток - при хранении в холодильнике.

Посев исследуемого материала

Питательные среды

    1. Питательный агар.                        ¬
    2. 5% кровяной агар.                        ¦ (см. раздел 3.2)
    3. Сахарный бульон.                         -

Выделение микроорганизмов из мочи (качественное исследование) не позволяет отдифференцировать бактериурию, возникающую в результате загрязнения мочи нормальной микрофлорой дистального отдела уретры, от бактериурии, развивающейся при инфекционных процессах в мочевыводящей системе, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы. С этой целью применяют количественные методы исследования, основанные на определении числа микробных клеток в 1 мл мочи (степень бактериурии).

Метод секторных посевов. Платиновой петлей, диаметром 2 мм, емкостью 0,005 мл, производят посев мочи (30 - 40 штрихов) на сектор A чашки Петри с простым питательным агаром. После этого петлю прожигают и производят 4 штриховых посева из сектора A в сектор I и аналогичным образом - из сектора I во II и из II в III. Чашки инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа, после чего подсчитывают число колоний, выросших в разных секторах. Определение степени бактериурии по количеству выделенных колоний производят согласно таблице 1.

Таблица 1

-----------+-----------------------------------------+------------
¦    A     ¦      Количество колоний в секторах      ¦Количество ¦
¦          +-------------+-------------+-------------+ бактерий  ¦
¦          ¦      I      ¦     II      ¦     III     ¦в 1 мл мочи¦
+----------+-------------+-------------+-------------+-----------+
¦1 - 6     ¦-            ¦-            ¦-            ¦менее 1000 ¦
¦8 - 20    ¦-            ¦-            ¦-            ¦3000       ¦
¦20 - 30   ¦-            ¦-            ¦-            ¦5000       ¦
¦30 - 60   ¦-            ¦-            ¦-            ¦10000      ¦
¦70 - 80   ¦-            ¦-            ¦-            ¦50000      ¦
¦100 - 150 ¦5 - 10       ¦-            ¦-            ¦100000     ¦
¦не сосч.  ¦20 - 30      ¦-            ¦-            ¦500000     ¦
¦-"-       ¦40 - 60      ¦-            ¦-            ¦1 млн.     ¦
¦-"-       ¦100 - 140    ¦10 - 20      ¦-            ¦5 млн.     ¦
¦-"-       ¦не сосч.     ¦30 - 40      ¦-            ¦10 млн.    ¦
¦-"-       ¦-"-          ¦60 - 80      ¦колонии един.¦100 млн.   ¦
-----------+-------------+-------------+-------------+------------

Метод секторных посевов позволяет не только определить степень бактериурии, но и выделить возбудителя заболевания в чистой культуре.

При латентном течении уроинфекции, а также после лечения антибактериальными препаратами рекомендуется производить посев по 0,1 мл цельной мочи на плотные питательные среды и в пробирку с 0,25% сахарным бульоном. Посевы инкубируют при 37 °C 24 часа. При отсутствии роста на 5% кровяном агаре чашки выдерживают 3 суток в термостате, т.к. может наблюдаться замедленный рост стрептококков.

Подсчитывают количество колоний, выросших на плотных питательных средах и пересчитывают обсемененность на 1 мл мочи. Из сахарного бульона делают высев на чашку с 5% кровяным агаром. Колонии, выросшие на плотных питательных средах, отсевают в пробирки со скошенным агаром, выделенную чистую культуру идентифицируют и определяют ее чувствительность к антибактериальным препаратам.

Ускоренные методы основаны на определении продуктов метаболизма, образующихся при размножении микроорганизмов в моче. Они дают менее точные результаты, чем метод секторных посевов, и чаще используются при массовых профилактических обследованиях больших контингентов людей, для экспресс-диагностики. При положительном результате, полученном ускоренными методами, необходимы дальнейшие исследования с помощью более точного метода секторных посевов.

При использовании ускоренных методов лаборатория дает предварительный ответ через день после получения результатов определения степени бактериурии и окончательный - через 4 дня: после выделения чистой культуры микроорганизмов, их идентификации и определения чувствительности к антибактериальным препаратам.

Нитритный тест. Нитриты, являющиеся продуктами метаболизма представителей семейства Enterbacteriaceae, могут быть обнаружены в моче с помощью реактива Грисса. Готовят два раствора:

а) 1,25 г сульфаниловой кислоты растворяют в 500 мл 30% уксусной кислоты;

б) 2,5 г альфа-нафтиламина растворяют в 500 мл 30% уксусной кислоты.

Оба раствора хранят в защищенном от света месте.

    Непосредственно  перед  исследованием  оба  раствора смешивают в равных
количествах,   1 мл  смеси  добавляют  к  1  мл  мочи.  Появление  красного
                                                                          5
окрашивания  свидетельствует  о  присутствии  в  1  мл  мочи  не  менее 10
микробных клеток.

Эффективность метода может быть значительно повышена добавлением в мочу нитратов с последующей инкубацией при 37 °C в течение 2 - 4 часов перед постановкой нитритного теста.

ТТХ-тест. Трифенилтетразолий хлористый (ТТХ) под действием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов переходит из бесцветного в красный нерастворимый в воде трифенилформазан. Интенсивность окраски находится в прямой зависимости от степени бактериурии.

Готовят три раствора: 1. Насыщенный раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия. 2. 750 мг ТТХ растворяют в 100 мл раствора 1. 3. Рабочий раствор - 4 мл раствора 1 смешивают со 100 мл раствора 2. Хранят растворы в прохладном защищенном от света месте. Срок хранения растворов 1 и 2 - до 2-х месяцев, рабочего раствора - не более 2-х недель.

При постановке реакции пользуются стерильной посудой.

    К  2  мл  мочи  прибавляют  0,5  мл  рабочего раствора и помещают после
перемешивания  в термостат при 37 °C. После 4-часовой  инкубации  учитывают
результаты.  Появление  на  дне  пробирки красного осадка свидетельствует о
                               5
наличии в 1 мл мочи не менее 10  микробных клеток.

Оценка результатов исследования

Основной задачей при интерпретации полученных данных является доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. Учитывают комплекс тестов: степень бактериурии, вид выделенных культур, повторность их выделения в процессе заболевания, присутствие в моче монокультуры или ассоциации микроорганизмов.

Степень бактериурии позволяет дифференцировать инфекционный процесс в мочевых путях от контаминации мочи нормальной микрофлорой. С этой целью используют следующие критерии:

                                                  3
    1.  Степень  бактериурии,  не  превышающая  10  микробных клеток в 1 мл
мочи,  свидетельствует  об  отсутствии  воспалительного  процесса  и обычно
является результатом контаминации мочи.
                                         4
    2.  Степень  бактериурии,  равная  10   микробных  клеток  в 1 мл мочи,
расценивается как сомнительный результат. Исследование следует повторить.
                                            5
    3. Степень бактериурии, равная и выше 10  микробных клеток в 1 мл мочи,
указывает на наличие воспалительного процесса.

Изменение степени бактериурии в процессе заболевания может быть использовано для контроля за течением процесса и эффективностью терапии: уменьшение степени бактериурии свидетельствует о благоприятном течении заболевания и эффективности использованных лекарственных препаратов.

Следует иметь в виду, что в некоторых случаях - у больных, получающих антибактериальную терапию, при плохом оттоке мочи, при низком ее удельном весе и pH ниже 5 - может наблюдаться низкая степень бактериурии при имеющемся заболевании. Поэтому, помимо степени бактериурии, следует изучать вид выделенных из мочи микроорганизмов. Эшерихии, протей, синегнойная палочка, клебсиеллы чаще выделяются из мочи больных уроинфекцией. Дифтероиды, лактобациллы, грамположительные палочки обычно выделяются из мочи здоровых людей.

При трактовке результатов исследования следует учитывать повторность выделения одного и того же вида микроорганизмов: повторное выделение из мочи культуры одного вида, типа, варианта говорит о наличии инфекционного процесса.

Учитывается также присутствие в моче монокультуры или ассоциации микроорганизмов. Монокультура чаще выделяется при острых воспалительных процессах и коррелирует с высокой степенью бактериурии. Ассоциации микроорганизмов чаще встречаются при хронических процессах и коррелируют с низкой степенью бактериурии.

При окончательной трактовке результатов микробиологического исследования необходимо учитывать данные клиники и другие лабораторные анализы.

В окончательном ответе, который выдается лабораторией, указывается степень бактериурии, вид выделенных культур и их чувствительность к лекарственным препаратам.

1.5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Возбудителями гнойно-воспалительных процессов дыхательных путей чаще всего являются условно-патогенные микроорганизмы следующих родов и видов: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, Corynebacterium, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Candida, Actinomyces и др.

При направленном исследовании могут быть выделены Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерии, Mycoplasma, Bacteroides.

Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов.

В отделяемом зева, трахеи, бронхов, носа в норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus, Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumonia, S. pyogenes.

Мокрота, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, может контаминироваться вегетирующей в них микрофлорой.

Взятие исследуемого материала

Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1 - 2 часа.

Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.

Промывные воды бронхов. При отсутствии или скудном количестве мокроты производят смыв из бронхов физиологическим раствором, однако, при этом микробиологическая ценность исследования снижается из-за разведения секрета (часто значительного) и бактерицидного действия раствора на чувствительные микроорганизмы, поэтому нередко концентрация бактерий в бронхиальном содержимом в 10 - 1000 раз ниже, чем в мокроте. Кроме того, трудоемкость эндоскопического взятия материала и тяжесть манипуляции для больного ограничивает проведение повторных исследований в динамике заболевания.

При бронхоскопии рекомендуется вводить не более 5 мл физиологического раствора с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.

Пунктат инфильтрата или абсцесса легкого. Исследование пунктата наиболее эффективно до прорыва инфильтрата или абсцесса в дренирующий бронх. При трансторакальной пункции получают материал непосредственно из очага поражения и избегают его обсеменения посторонней микрофлорой.

Глотка, ротовая полость и нос. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 часа после еды стерильным ватным тампоном или ложечкой со слизистой оболочки или ее пораженных участков у выходов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом.

Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном. Тампон осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до его окончания. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами. При подозрении на клебсиеллы, независимо от места локализации процесса, исследуют материал из носоглотки и обеих половин носовой полости.

Микроскопия исследуемого материала

Из мокроты или материала, взятого стерильным ватным тампоном, одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму).

Микроскопическое исследование является важным ориентиром. При просмотре мазков из мокроты оценивают общую картину микрофлоры: наличие скоплений грамположительных кокков (Staphylococcus, Micrococcus); цепочек грамположительных кокков (Streptococcus); мелких ланцетовидных, окруженных зоной неокрасившейся капсулы (S. pneumoniae); грамотрицательных кокков (Neisseria); грамотрицательных палочек с закругленными концами, окруженных капсулой в виде светлого ореола (Klebsiella и др.); грамотрицательных палочек (E. coli, P. aeruginosa и др.); мелких грамотрицательных палочек в виде скоплений (Haemophylus); мицелия в бластоспор гриба.

При исследовании мокроты обращают внимание на наличие гранулоцитов, которые всегда можно обнаружить при воспалительных процессах в нижних отделах дыхательного тракта. Их отсутствие и большое количество эпителиальных клеток в мокроте свидетельствует о том, что материал взят неправильно (с примесью слюны) и требуется его повторное взятие. При острой инфекции в мокроте, как правило, обнаруживают не более 1 - 2 типов бактерий, локализованных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы, попавшие из ротовой полости, чаще располагаются около эпителиальных клеток, и ими следует пренебречь.

По результатам микроскопии могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

Посев исследуемого материала

Питательные среды.

Основная питательная среда: 5% кровяной агар (см. раздел 3.2).

Могут быть использованы дополнительные питательные среды:

1. Среда ВНИИП: агар-агар, 2 г; гидролизат Хоттингера или казеина (1,8 - 2,0 г/л аминного азота), 75 мл; гидролизат бычьих сердец (1,4 - 1,8 г/л аминного азота), 25 мл; экстракт пекарских дрожжей, 0,5 г. К среде добавляют дефибринированную кровь лошади, барана, кролика, 5 мл.

    2. Желточно-солевой агар.                        ¬
    3. Агар с гретой кровью (шоколадный агар).       ¦ (см. раздел 3.2)
    4. Среда Эндо.                                   ¦
    5. Среда Сабуро.                                 -

Культивирование

Мокроту выливают в чашку Петри. С помощью стерильных металлических толстых игл с утолщенными концами (типа зубного зонда) выбирают 2 - 3 гнойных комочка мокроты. С целью очистки комочков мокроты от наслоившихся обитателей верхних дыхательных путей и ротовой полости их трехкратно отмывают в стерильном физиологическом растворе, после чего засевают на питательные среды.

В чашки Петри посев производят стеклянным стерильным шпателем, равномерно растирая материал по поверхности питательной среды. Посевы помещают в термостат при 37 °C.

Содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому, засевают как мокроту, но без предварительного отмывания гнойных комочков физиологическим раствором. При отсутствии комочков гноя и слизи производят посев материала, набирая его пастеровской пипеткой.

Материал из глотки, носа и ротовой полости засевают так же, как мокроту. При наличии соответствующего указания лечащего врача для выделения возбудителей дифтерии, озены, гнойного менингококкового ринита необходимо производить исследование материала, руководствуясь соответствующими Приказами <*>.

--------------------------------

<*> Исследование на менингококковую инфекцию - Приказ МЗ СССР N 98 от 29 января 1981 г.

Исследование на дифтерию - Приказ МЗ СССР N 580 от 26 июня 1974 г.

Посев производят на среды, хранившиеся при комнатной температуре или согретые в термостате. При посеве тампоном материал втирают в среду со всей поверхности тампона на небольшом участке в 1 - 2 кв. см, а затем штрихами по всей поверхности питательной среды. Посевы помещают в термостат при 37 °C.

Посевы исследуемого материала (мокрота, содержимое бронхов, отделяемое зева, носа, ротовой полости) просматривают после 18 - 24-часовой инкубации при 37 °C. Учитывают количество выросших колоний, соотношение отдельных ассоциантов, описывают характер колоний. Выделяют чистые культуры микроорганизмов, проводят их идентификацию и определяют чувствительность к антибактериальным препаратам.

Количественный метод <**>

--------------------------------

<**> Рекомендуется как дополнительный метод.

    Мокрота. Берут 1 мл мокроты, добавляют 9 мл питательного бульона или 2%
                                            -1
пептонной  воды  (разведение  1:9,  т.е.  10  ) и гомогенизируют в банке со
стеклянными бусами 20 мин. Гомогенизацию можно проводить в ступке, растирая
мокроту  со  стерильным  кварцевым  песком,  добавляя питательный бульон до
конечного  разведения  1:9.  Из  полученной  эмульсии мокроты (1:9) готовят
                                                                        -7
серийные  разведения  в бульоне (0,5 мл  мокроты + 4,5 мл бульона) до 10  ,
каждый  раз меняя пипетки. Посев осуществляют в обратном порядке с большего
                                                       -7    -5    -3    -1
разведения. Засевают по 0,1 мл из разведений мокроты 10  , 10  , 10  , 10
на  чашку с 5% кровяным агаром и агаром с гретой кровью. Параллельный посев
из  указанных  разведений  на кровяном агаре помещают в эксикатор с горящей
свечой.  Посев  на  желточно-солевой  агар,  среду  Эндо и Сабуро делают из
исходного  разведения  1:9.  Инкубируют  в течение суток при 37 °C. На 2-ые
сутки   чашки  просматривают  и  подсчитывают  каждый  вид  микроорганизма.
Количество  микроорганизмов определяют в максимальном разведении мокроты, в
котором еще удалось обнаружить данный вид бактерий.
    Например.  На  кровяном  агаре выросли 3 колонии пневмококка при посеве
                               -5
0,1  мл мокроты с разведения 10  . Следовательно, в 1 мл мокроты содержится
                          5
3  x 10 и умноженное на 10  (степень разведения) = 3000000 пневмококков или
        6
3  x  10 .  Диагностически  значимым  является  обнаружение  пневмококка  и
гемофильной  палочки  (до  антибактериальной  терапии)  в  1  мл  мокроты в
                 6
концентрации   10    и   выше.   Аналогичные  концентрации  значимы  и  для
условно-патогенных  микроорганизмов  в  случае 2 - 3-кратного обнаружения с
интервалом 3 - 5 дней.
    Содержимое  бронхов.  При количественном подсчете бактерий бронхиальные
смывы,   представляющие  собой  гомогенную  взвесь,  условно  принимают  за
разведение 1:9. Диагностически значимым является обнаружение пневмококков и
                                                                         4
гемофильной  палочки  (до  антибактериальной  терапии)  в концентрации 10 .
Аналогичные концентрации значимы и для условно-патогенных микроорганизмов в
случае 2 - 3-кратного обнаружения с интервалом 3 - 5 дней.

Мазки из гортани и зева. При количественном исследовании тампоны тщательно суспендируют в 1 мл бульона и условно принимают за разведение 1:9.

Дальнейшее исследование этих материалов проводят как количественное определение мокроты.

Оценка результатов

При воспалительных процессах дыхательных путей, когда высеваются условно-патогенные микроорганизмы, интерпретация полученных результатов представляет определенные трудности. Следует учитывать, что наличие или отсутствие в исследуемом материале микроорганизмов не может иметь решающего значения для диагноза.

Особое значение принадлежит количественной оценке роста различных видов микроорганизмов, выросших при первичном посеве на плотных питательных средах. Для ориентировочной оценки количественного роста микроорганизмов в ассоциации целесообразно пользоваться следующими критериями:

I - очень скудный рост             - рост единичных колоний (до 10);
II - скудный рост                  - рост 10 - 25 колоний;
III - умеренный рост               - рост множества сосчитываемых колоний
                                     (не менее 50);
IV - обильный рост                 - сплошной рост несосчитываемых колоний.

III и IV степени роста обычно свидетельствуют об этиологической роли данного микроорганизма, I и II степени - о носительстве или контаминации.

О возбудителе необходимо судить на основании комплекса исследований: данных микроскопии первичных мазков, результатов посева на плотные питательные среды (количественная оценка роста различных видов микроорганизмов, однородность популяции при посеве на плотные питательные среды), учета анамнеза, клинических проявлений заболевания и результатов комплексной терапии.

Количественный метод обеспечивает выделение чистых культур микроорганизмов и дает возможность судить более точно об этиологической значимости выделенных микроорганизмов.

Следует подчеркнуть достаточную информативность и высокую корреляцию качественного и количественного методов посева при правильном их выполнении.

1.6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ОТКРЫТЫХ ИНФИЦИРОВАННЫХ РАН

При появлении гнойно-воспалительного процесса в ране раневое отделяемое, гной, кусочки инфицированных тканей (грануляции, мышцы и т.п.) подвергают микробиологическому исследованию.

Возбудителями гнойно-воспалительных процессов могут быть представители различных родов, подавляющее большинство которых относят к так называемой "условно-патогенной" микрофлоре (аэробной, микроаэрофильной и анаэробной). Среди них чаще встречаются виды родов: Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Aeromonas, Alcaligenes, Acetobacter, Haemophilus, Peptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium, Bacteroides, Nocardia, Listeria, Fusobacterium, Neisseria, Mycrococcus, Mycoplasma. Реже - Yersinia, Ervinia, Salmonella, Acinetobacter, Moraxella, Brucella, Candida, Actinomyces.

Микроорганизмы могут вызывать и поддерживать гнойный процесс как в монокультуре, так и в ассоциации.

Взятие исследуемого материала

Взятие материала производит лечащий врач при соблюдении правил асептики. При взятии материала из раны стерильным ватным тампоном кожу вокруг раны предварительно обрабатывают спиртом или другим антисептиком, некротические массы, детрит и гной удаляют стерильной салфеткой. Взятие материала стерильным тампоном производят круговыми вращательными движениями от центра к периферии поверхности раны. Материал берут двумя тампонами, один из которых используют для микроскопии, а другой - для посева.

При наличии в ране дренажей для активной аспирации отделяемого последнее отсасывают шприцем и в количестве 1 - 2 мл помещают в стерильную пробирку. Кусочки тканей, гной, промывную жидкость из дренажа также берут в стерильные пробирки при соблюдении всех правил асептики.

Не более чем через 1 час после взятия весь материал доставляют в микробиологическую лабораторию для немедленного посева. При невозможности доставить материал в течение этого времени, он должен храниться в холодильнике, но не более двух часов.

Микроскопия исследуемого материала

Материал, взятый одним из стерильных ватных тампонов, "размазывают" по стерильному предметному стеклу, окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом. При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологическую характеристику (грамположительные и грамотрицательные палочки, кокки и др.) и степень обсемененности. В соответствии с результатами микроскопии могут быть внесены коррективы в ход бактериологического исследования.

Посев исследуемого материала

Питательные среды

    1. 5% кровяной агар.                         ¬
    2. Сахарный бульон.                          ¦ (см. раздел 3.2)
    3. "Среда для контроля стерильности".        -

Материал, взятый другим ватным стерильным тампоном из того же участка раны, засевают на чашку с 5% кровяным агаром, на "среду для контроля стерильности" и сахарный бульон, а твердые кусочки тканей (секвестры, кусочки кожи, мышц и пр.) засевают на "среду для контроля стерильности" и сахарный бульон.

Посев на чашку с агаром производят методом "тампон-петля": тампоном проводится "дорожка" по диаметру чашки, затем другой стороной тампона в обратном направлении засевается еще одна "дорожка", параллельная первой. После этого материал рассевают по чашке при помощи петли штрихами, перпендикулярными к "дорожкам". Такой посев позволяет выделить микроорганизмы в виде отдельных колониеобразующих единиц даже из ассоциации микроорганизмов.

Засеянные жидкие и плотные питательные среды термостатируют при 37 °C в течение 18 - 24 часов. При обнаружении роста производят отсев отдельных колоний на элективные среды с целью их идентификации. Отмечают, растут ли микроорганизмы в виде монокультуры или в ассоциации. При обнаружении ассоциации на плотной питательной среде отмечают преимущественный рост какого-либо представителя ассоциации (если это наблюдается).

При отсутствии роста в первые сутки посевы оставляют в термостате, ежедневно просматривают и при визуальном обнаружении роста также производят соответствующие отсевы. Ответ об отсутствии роста выдают через 5 суток термостатирования.

В ответе лаборатории указывают, какие виды микроорганизмов выделены, в каком количестве (слабый, умеренный или обильный рост на плотной питательной среде).

При выделении ассоциации микроорганизмов в ответе перечисляют все виды микроорганизмов, входящие в ассоциацию, и отмечают, имеется ли преимущественный рост какого-либо из представителей ассоциации.

1.7. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ГЛАЗ

Микробиологическое исследование проводится при заболеваниях конъюнктивы, век, слезных мешков, роговицы. Следует учитывать, что в норме только с конъюнктивы и в небольшом количестве регулярно выделяются Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudodiphteriticum, непатогенные микроорганизмы семейства Neisseriaceae, Sarcina. У отдельных лиц временно могут выделяться Staphylococcus aureus, микроорганизмы семейства Streptococcaceae (S. pneumoniae, S. feacalis, S. viridans), представители семейства Enterobacteriaceae, рода Haemophilus, микоплазмы.

Причиной конъюнктивитов в преобладающем количестве случаев являются стафилококки (79,2%). Staphylococcus aureus чаще обнаруживается при остром (43,6%), а Staphylococcus epidermidis - хроническом конъюнктивите (83,5%). Другими возбудителями острых гнойных и хронических конъюнктивитов являются Neisseria gonorrhoeae, Moraxella lacunata, Branhamella catarrhalis, Corynebacterium diphteriae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Haemophilus aegypticus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, микроорганизмы семейств Enterobacteriaceae, родов Proteus, Klebsiella, Escherichia. Реже встречаются Listeria monocytogenes, грибы рода Candida, Aspergillus.

Помимо вышеперечисленных микроорганизмов, являющихся возможными возбудителями воспалительных процессов не только глаз, но и других систем и органов человека, известны микроорганизмы, обуславливающие только конъюнктивиты. К ним относятся Haemophilus aegypticus, Moraxella lacunata, Branchamella catarrhalis.

Взятие материала

Материал забирают с пораженных мест в разгар воспалительного процесса с соблюдением правил асептики. Не менее чем за 5 - 6 часов до исследования отменяют все медикаменты и процедуры. Взятие материала производит врач-окулист.

1. Конъюнктива. Отделяемое берут с конъюнктивы платиновой петлей, предварительно прожженной в пламени спиртовки и остуженной, или стеклянными стерильными палочками. При наличии достаточно обильного гнойного отделяемого используют стерильные ватные тампоны, которыми берут гной с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. Необходимо следить, чтобы при моргании ресницы не касались тампона (придерживать веки руками).

2. Край век. Корочки гноя удаляют пинцетом. Берут материал из язвочки у основания ресниц.

3. Роговица. Материал на исследование, после обезболивания, можно взять платиновой петлей или другим подходящим инструментом. Если больной применяет контактные линзы, необходимо исследовать их внутреннюю поверхность. Взятый влажным тампоном материал наносят на поверхность предметного стекла, обезжиренного и прокаленного над пламенем горелки. Мазки высушивают, стекло маркируют, на его обратной стороне обводят границы мазка.

В кабинете врача производят посев на сывороточный бульон и тиогликолевый бульон. Мазок и посевы затем доставляются в лабораторию для исследования.

Микроскопия исследуемого материала

Бактериоскопия окрашенного материала.

Присланные в лабораторию мазки фиксируют на пламени и окрашивают по методу Грама или метиленовым синим. Микроскопия окрашенных мазков позволяет предположить наличие тех или иных видов бактерий, вызвавших заболевание глаз.

Для обнаружения Mycobacterium tuberculosis окраску проводят по методу Циль-Нильсона.

Бактериоскопию нативного материала проводят при подозрении на кандидоз методом "раздавленной капли" (см. раздел 1.8).

Результаты бактериоскопии могут быть сообщены врачу в виде предварительного ответа. Дальнейший ход микробиологического исследования в ряде случаев определяется видом предполагаемых возбудителей.

Посев исследуемого материала

Питательные среды

    1. 5% кровяной агар.                         ¬ (см. раздел 3.2)
    2. "Среда для контроля стерильности".        -

Первичные посевы на жидких питательных средах, присланные в лабораторию, помещают в термостат при 37 °C.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: