Временные методические указания по определению метаболитов ФОП, производных тио- и дитиофосфорных кислот в биоматериале методом тонкослойной и газожидкостной хроматографии

Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6072-91

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткая характеристика препарата

Производные тио- и дитиофосфорных кислот являются основными метаболитами фосфорорганических пестицидов. Характеристика метаболитов ФОП представлена в таблице 1.

Таблица 1

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ

----------------------------------+-----------+----T--------------+------------
¦       Химическое название       ¦Структурная¦Мол.¦ T. кип., °C  ¦Показатель ¦
¦                                 ¦  формула  ¦вес ¦              ¦преломления¦
¦                                 ¦           ¦    ¦              ¦ при 20 °C ¦
+---------------------------------+-----------+----+--------------+-----------+
¦0,0-Диметилтиофосфорная кислота  ¦CH O       ¦142 ¦62 - 63 °C    ¦1,5343     ¦
¦                                 ¦  3  \ /S  ¦    ¦4,5 мм рт. ст.¦           ¦
¦                                 ¦      P/   ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦     / \   ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦CH O    OH ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦  3        ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦           ¦    ¦              ¦           ¦
¦0,0-Диэтилтиофосфорная кислота   ¦C H O      ¦170 ¦81 - 82 °C    ¦1,5076     ¦
¦                                 ¦ 2 5  \ /S ¦    ¦5 мм рт. ст.  ¦           ¦
¦                                 ¦       P/  ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦      / \  ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦C H O    OH¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦ 2 5       ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦           ¦    ¦              ¦           ¦
¦0,0-Диметилдитиофосфорная кислота¦CH O       ¦158 ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦  3  \ /S  ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦      P/   ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦     / \   ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦CH O    SH ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦  3        ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦           ¦    ¦              ¦           ¦
¦0,0-Диэтилдитиофосфорная кислота ¦C H O      ¦186 ¦97 - 98 °C    ¦1,5105     ¦
¦                                 ¦ 2 5  \ /S ¦    ¦2 мм рт. ст.  ¦           ¦
¦                                 ¦       P/  ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦      / \  ¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦C H O    SH¦    ¦              ¦           ¦
¦                                 ¦ 2 5       ¦    ¦              ¦           ¦
----------------------------------+-----------+----+--------------+------------

    Метаболиты  ФОП  практически нерастворимы в воде, растворимы в
ацетоне, диэтиловом  эфире,  этилацетате,  спиртах. ЛД   для белых
                                                      50
крыс диметилдитиофосфорной кислоты  - 1460 мг/кг, карбофоса - 2000
мг/кг (перорально).

2. Методика определения метаболитов ФОП, производных тио и дитиофосфорных кислот в биологическом материале

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении алкилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот методом тонкослойной и газожидкостной хроматографии после экстракции всех анализируемых соединений из биосубстратов этилацетатом (10 мл x 3).

ТСХ-определение проводят на пластинках "Силуфол" в подвижной фазе (ПФ) гексан:ацетон (3:1). В качестве проявляющих реагентов использовали:

1) 4-(п-нитробензил)пиридин + тетраэтиленпентамин (синие пятна на белом фоне);

2) тиокетон Михлера + хлорамин (салатовые пятна на желтом фоне);

3) 2,6-дибром-N-хлорхинонимин (красно-кирпичные пятна на белом фоне);

4) бромкрезоловый зеленый (желтые пятна на зеленом фоне);

5) нингидрин (красные пятна на белом фоне);

6) диметиламинобензальдегид (белые пятна на желтом фоне).

ГЖХ-определение проводят на газовом хроматографе "Цвет-100", снабженном термоионным детектором. В качестве неподвижной фазы используют 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS. Разделение данных метаболитов проводят в изотермическом режиме при T к. = 120 °C, T исп. = 160 °C.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода определения метаболитов ФОП при внесении веществ In vitro в организм и ткани животных, мочу, кровь приведена в таблице 2.

Таблица 2

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ТСХ И ГЖХ АЛКИЛПРОИЗВОДНЫХ ТИО- И ДИТИОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ В БИОСУБСТРАТАХ <*> ПРИ ВНЕСЕНИИ ВЕЩЕСТВ (P = 0,95, N = 3)

----+----------------+----------------------------+-----------------------------
¦ N ¦  Определяемое  ¦             ТСХ            ¦            ГЖХ             ¦
¦п/п¦    вещество    +------+-------+------+------+------+-------+------+------+
¦   ¦                ¦нижний¦среднее¦относ.¦довер.¦нижний¦среднее¦относ.¦довер.¦
¦   ¦                ¦предел¦значен.¦станд.¦интер-¦предел¦значе- ¦станд.¦интер-¦
¦   ¦                ¦обна- ¦опреде-¦откло-¦вал   ¦обна- ¦ние    ¦откло-¦вал   ¦
¦   ¦                ¦руже- ¦ления, ¦нение ¦сред- ¦руже- ¦опреде-¦нение ¦сред- ¦
¦   ¦                ¦ния,  ¦%      ¦      ¦него, ¦ния,  ¦ления, ¦      ¦него, ¦
¦   ¦                ¦мг/л  ¦       ¦      ¦%     ¦мг/л  ¦%      ¦      ¦%     ¦
+---+----------------+------+-------+------+------+------+-------+------+------+
¦1. ¦Диметилтиофос-  ¦0,01  ¦68     ¦5,1   ¦2,3   ¦0,001 ¦69     ¦5,3   ¦2,4   ¦
¦   ¦форная кислота  ¦      ¦       ¦      ¦      ¦      ¦       ¦      ¦      ¦
¦2. ¦Диэтилтиофосфор-¦0,01  ¦69     ¦4,7   ¦2,5   ¦0,001 ¦70     ¦4,6   ¦2,5   ¦
¦   ¦ная кислота     ¦      ¦       ¦      ¦      ¦      ¦       ¦      ¦      ¦
¦3. ¦Диметилдитиофос-¦0,02  ¦71     ¦3,8   ¦1,7   ¦0,001 ¦72     ¦5,0   ¦2,5   ¦
¦   ¦форная кислота  ¦      ¦       ¦      ¦      ¦      ¦       ¦      ¦      ¦
¦4. ¦Диэтилдитиофос- ¦0,02  ¦70     ¦4,6   ¦2,0   ¦0,001 ¦71     ¦5,1   ¦2,4   ¦
¦   ¦форная кислота  ¦      ¦       ¦      ¦      ¦      ¦       ¦      ¦      ¦
----+----------------+------+-------+------+------+------+-------+------+-------

2.1.3. Избирательность метода

Фосфорорганические пестициды не мешают определению амилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот.

2.2. Реактивы и растворы

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76.

Этиловый спирт - ректификат 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.

Сульфат натрия хч, ГОСТ 4166-76, безводный.

4-(п-Нитробензил)пиридин ч, ТУ 6-09-1593-74.

Тетраэтиленпентамин ч, ТУ 6-09-8293-73.

Тиокетон Михлера.

Хлорамин.

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-0563-73.

Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-4530-77.

Нингидрин, ТУ 6-09-10-1384-79.

Диметиламинобензальдегид чда, ТУ 6-09-3272-77.

Проявляющие реактивы: N 1 - 0,2% раствор 4-(п-нитробензил)пиридина в ацетоне и 10% раствор тетраэтиленпентамина в ацетоне; N 2 - 0,1% водный раствор хлорамина и 0,1% метанольный раствор тиокетона Михлера; N 3 - 0,5% раствор 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане; N 4 - 0,3% раствор бромкрезолового зеленого в 80% метаноле смешивают с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора; N 5 - 0,25% раствор нингидрина в спирте; N 6 - 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле смешивают перед употреблением с 1 мл ледяной уксусной кислоты.

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79, свежеперегнанный.

Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78, свежеперегнанный.

Метиловый спирт хч, ГОСТ 6996-77.

Натрий гидроксид хч, ГОСТ 4328-77.

Уксусная кислота осч, ГОСТ 18270-72, ледяная.

Неподвижная фаза: 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм, Хемапол, ЧССР).

    Азот  особой  чистоты,  содержание  O   не  более 0,003%, ГОСТ
                                         2
9293-79.

Водород газообразный из баллона, ГОСТ 3022-80.

Воздух газообразный из баллона, ГОСТ 9-010-80, или нагнетаемый компрессором.

Основные стандартные растворы метаболитов ФОП в ацетоне по 100 мкг/мл. Хранят в холодильнике 2 мес. Рабочие стандартные растворы метаболитов ФОП, производных тио- и дитиофосфорной кислот по 100 мкг/мл и 1 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение 2-х месяцев.

2.3. Приборы и посуда

Газовый хроматограф с термоионным детектором (ТИД) марки "Цвет-100".

Микроизмельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1505-79.

Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1-М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный.

Микрошприцы на 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2-833.024.

Механический встряхиватель, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Хроматографическая камера с притертой крышкой, ГОСТ 25336-82.

Мерные колбы, ГОСТ 1770-74 на 100 и 50 мл.

Пипетки на 1, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Пробирки с пробками на шлифах, градуированные, ГОСТ 1770-74, на 10 мл.

Круглодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100, 50 мл.

Плоскодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100 мл.

Чашки Петри, ГОСТ 25336-82.

Мерные цилиндры, ГОСТ 1770-74, на 100 мл.

Делительные воронки на 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82.

2.4. Подготовка и определение

2.4.1. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб для определения микроколичеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, продуктах питания и объектах окружающей среды", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 за N 2051-79.

2.4.2. Подготовка к определению

Хроматографические камеры за 1 час до начала хроматографирования заполняют смесью растворителей гексан - ацетон (3:1) для подвижной фазы. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше чем 1 см от уровня дна камеры. Для ГЖХ-определения колонка заполняется общепринятым в хроматографии способом, кондиционируется в течение 48 часов при температуре на 20° выше рабочей температуры колонки.

2.5. Описание определения

2.5.1. Экстракция и очистка экстракта

Органы и ткани (печень, почки, легкие, головной мозг)

Исследуемые органы и ткани измельчают в микроизмельчителе тканей или на мясорубке. Отбирают 2 - 5 г средней пробы, заливают в зависимости от взятой навески 15 - 50 мл этилацетата и оставляют на 1 час, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой, или ставят на 30 мин. на аппарат для встряхивания. Затем растворитель сливают в круглодонную колбу для упаривания, фильтруя экстракт через фильтр с безводным сульфатом натрия. Заливают пробу новой порцией растворителя и экстрагируют еще 30 мин. Экстракт объединяют. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 40 - 45 °C до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) этилацетата. Доводят объем в пробирке этилацетатом точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

Кровь. 2 - 5 мл цельной крови выливают в фарфоровую чашку. Затем прибавляют при непрерывном помешивании безводный сернокислый натрий (20 г) и тщательно растирают пестиком. Приливают 20 - 30 мл этилацетата и перемешивают пробу с этилацетатом в течение 10 мин. Сливают этилацетат в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C до 1 - 2 мл. Переносят остаток в мерную пробирку и доводят объем в пробирке этилацетатом до 2 мл. Аликвоту хроматографируют.

Моча. 20 мл мочи переносят в делительную воронку, прибавляют 80 мл этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 2 мин. Дают отстояться. Отделяют верхний слой этилацетата, сливая его через сернокислый натрий. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают, как описано для крови.

2.5.2. Хроматографическое определение

Условия хроматографического определения

ТСХ

Остаток после концентрирования рабочей пробы наносят с помощью капилляра на пластинку "Силуфол". Аналогичным путем наносят серию стандартных растворов.

Хроматограмму развивают в системе гексан - ацетон (3:1). После развития хроматограммы пластинку сушат, а затем проявляют одним из проявляющих реагентов.

    При проявлении пластин проявляющим реагентом N 1 хроматограмму
сначала  обрабатывают  0,2%  раствором 4-(п-нитробензил)пиридина в
ацетоне.  Затем  помещают  в  термостат  при  температуре 110 °C в
течение 10 мин. и обрызгивают 10% раствором тетраэтиленпентамина в
ацетоне.  Метаболиты  проявляются  в виде насыщенно-синих пятен на
белом  фоне  с R : ДМТФ - 0,22; ДЭТФ - 0,60; ДМДТФ - 0,36; ДЭДТФ -
                f
0,80. Линейный диапазон определения 0,1 - 2 мкг.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 2 хроматограмму обрабатывают 0,1% водным раствором хлорамина и через 10 мин. 0,1% раствором тиокетона Михлера в метаноле или этаноле. Зоны локализации метаболитов обнаруживаются в виде салатных пятен на желтом фоне. Линейный диапазон определения 0,1 - 10 мкг.

При проявлении пластин проявляющим реагентом N 3 пластины обрабатывают 0,5% раствором 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане и нагревают 3 - 5 мин. при температуре 110 - 140 °C. Изучаемые соединения образуют красные пятна на белом фоне. Линейный диапазон - 1 - 20 мкг.

Проявляющий реактив N 4 готовят перед опрыскиванием смешиванием 0,3% раствора бромкрезолового зеленого в 80% метаноле с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора. После опрыскивания тио- и дитиофосфорные кислоты проявляются в виде желтых пятен на зеленом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 20 мкг.

При проявлении пластинки проявляющим реактивом N 5 10 мл 0,25% раствора нингидрина в спирте смешивают с 1 мл концентрированной уксусной кислоты и обрабатывают пластинку. Метаболиты ФОП проявляются в виде красных пятен на белом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 10 мкг.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 6 смешивают 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле с 1 мл ледяной уксусной кислоты и равномерно обрабатывают пластинку. Затем помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 110 °C, на 7 - 10 мин. Метаболиты образуют белые пятна на желтом фоне.

ГЖХ

Хроматограф марки "Цвет-100" с термоионным детектором.

Колонка стеклянная спиральная, длина 1 м, диаметр 3 мм, заполненная 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм).

                                                      -10
    Рабочая шкала электрометра при работе с ТИД 2 x 10    А.

Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/час.

Расход газа-носителя азота 22 мл/мин., водорода - 14 - 17 мл/мин., воздуха - 400 мл/мин.

Температура колонки 120 °C, температура испарителя 160 °C.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных выше условиях ГЖХ-определения приведены в таблице 3.

Таблица 3

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ, ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ФОП

--------------------------+-----T-----------+--------+-------+-----------------
¦        Вещество         ¦T уд.¦Неподвижная¦ T кол.,¦T исп.,¦  Нижний предел ¦
¦                         ¦     ¦   фаза    ¦   °C   ¦  °C   ¦обнаружения, мкг¦
+-------------------------+-----+-----------+--------+-------+----------------+
¦0,0-диметилтиофосфорная  ¦1,25 ¦3% OV-17   ¦120     ¦160    ¦0,02            ¦
¦кислота                  ¦     ¦           ¦        ¦       ¦                ¦
¦0,0-диметилдитиофосфорная¦1,56 ¦3% OV-17   ¦120     ¦160    ¦0,05            ¦
¦кислота                  ¦     ¦           ¦        ¦       ¦                ¦
¦0,0-диэтилтиофосфорная   ¦2,85 ¦3% OV-17   ¦120     ¦160    ¦0,02            ¦
¦кислота                  ¦     ¦           ¦        ¦       ¦                ¦
¦0,0-диэтилдитиофосфорная ¦2,11 ¦3% OV-17   ¦120     ¦160    ¦0,05            ¦
¦кислота                  ¦     ¦           ¦        ¦       ¦                ¦
--------------------------+-----+-----------+--------+-------+-----------------

2.6. Обработка результатов

Метод ТСХ

Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов.

Содержание метаболитов в анализируемой пробе X в мг/кг вычисляют по формуле:

                               C x V
                           X = ------,
                               V  x P
                                a

    где:
    C  -  количество  метаболита,  найденного в хроматографируемой
пробе, мкг;
    V - общий объем раствора, мл;
    V  - объем аликвоты, отобранный для хроматографирования, мл;
     a
    P - навеска пробы, г.

ГЖХ

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов (см. табл. 3). Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из 5 определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получают слишком большие пики, пробу разбавляют ЭА. Для определения метаболитов ФОП анализ проб следует проводить при температуре колонки (120 °C), использовав соответствующие стандарты (см. табл. 3).

Расчет результатов анализа проводят по следующей формуле:

                          C   x V  x H x V
                           ст    1        3
                      X = -----------------,
                            V  x H   x P
                             2    ст

    где:
    X - содержание метаболита в пробе, мг/кг (мг/л);
    C    - количество метаболита в стандартном растворе, введенном
     ст
в хроматограф, мкг/мл;
    V   -  объем  стандартного раствора, введенного в хроматограф,
     1
мкл;
    H     -   высота  пика  стандартного  раствора,  введенного  в
     ст
хроматограф, мм;
    H - высота пика исследуемого раствора, мм;
    V  - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;
     2
    V  - объем анализируемого экстракта, мл;
     3
    P - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл).

3. Техника безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими веществами.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: