Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды
Утверждаю
Начальник Главного Управления
карантинных инфекций
В.П.СЕРГИЕВ
7 апреля 1981 года
Разработаны:
В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, в Институте общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина АМН СССР, в Московском ордена Трудового Красного Знамени НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, в санитарно-эпидемиологической станции г. Москвы.
Рекомендованы к утверждению Лабораторным Советом при Главном Санэпидуправлении Минздрава СССР.
В последние годы постоянно увеличивается биологическое загрязнение окружающей среды, связанное с бурным ростом городов и развитием промышленности. Нарастает вирусное загрязнение сточных вод, открытых водоемов, почвы, а также в несколько меньшей степени - подземных водоисточников и атмосферного воздуха. Продолжается циркуляция энтеровирусов, вызывающих серьезные паралитические заболевания. Повсеместно регистрируются вирусные инфекции, при которых важную роль играют водный и пищевой пути передачи (вирусные кишечные инфекции, инфекционный гепатит, серозный менингит и др.).
В этих условиях особую актуальность приобретает вирусологический контроль за объектами окружающей среды и в первую очередь за водой открытых водоемов. Для дальнейшего совершенствования мер профилактики вирусных заболеваний и разработки критериев нормирования вирусного загрязнения окружающей среды необходимо расширение санитарно-вирусологических исследований.
Настоящие Методические рекомендации предназначены для проведения вирусологических исследований объектов окружающей среды вирусологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций.
Раздел "Санитарно-вирусологическое исследование воды" "Инструктивно-методических указаний по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной и вирусной природы в воде" (М., 1974) считать утратившим силу.
1. ОТБОР ПРОБ
При отборе проб для вирусологического исследования соблюдают некоторые общие требования, принимая меры предосторожности против контаминации материала. Пробы отбирают только в стерильную посуду, работу производят в халате и резиновых перчатках. После отбора проб перчатки обрабатывают спиртом, по окончании работы - халаты и перчатки подлежат стерилизации.
Пробы маркируют, указывая населенный пункт, точку отбора, дату (число, месяц, год). Материал доставляют в лабораторию в максимально короткий срок (не более 6 часов). Пробы воды доставляют в стеклянных емкостях с плотными резиновыми пробками, укрепленными лейкопластырем; пробы полужидких и твердых материалов - в полиэтиленовых пакетах или фольге. Пробы доставляют в лабораторию в сумках-холодильниках или пенопластовых коробках с сухим или мокрым льдом (последний должен быть упакован в пластиковый пакет). Доставленный материал немедленно обрабатывают или хранят при температуре +4 +/- 0,1 °С одни сутки, при температуре -20 +/- 0,1 °С в течение 7 суток. Каждую пробу регистрируют в рабочем журнале.
1.1. Сточные воды
Исследования сточных вод проводят с целью изучения циркуляции энтеровирусов среди населения данного населенного пункта, степени инфицирования сточных вод, эффективности работы очистных сооружений и т.п. Пробы сточной воды отбирают на очистных сооружениях до и после очистки. При длительном сроке наблюдения отбор проб для вирусологических исследований осуществляют 1 - 2 раза в месяц. При исследовании по эпидпоказаниям кратность отбора проб определяется совместно с эпидемиологом.
Отбор проб с помощью марлевых тампонов
Нарезают марлю на салфетки размером 10 x 10 см, укладывают их друг на друга в 48 слоев, протягивают капроновую леску через все слои марли, закрепляют ее на тампоне крепким узлом, упаковывают тампон в бумагу, стерилизуют, оставляя конец лески в 1,5 м снаружи.
В точке отбора проб закрепляют свободный конец лески на проволоке, укрепленной над коллектором, снимают обертку, тампон погружают в ток сточных вод на 3 - 7 суток. После экспозиции тампон извлекают, переносят в герметичный полиэтиленовый мешочек или стеклянную банку.
Отбор проб сточных вод в посуду
Жидкость из общего потока сточных вод отбирают с помощью специального отборника-батометра в стерильные матрасы объемом 1,0 - 1,5 л, которые заполняют жидкостью на две трети.
1.2. Вода поверхностных и подземных водоемов (моря, водохранилища, искусственные и естественные водоемы, озера, реки, артезианские скважины, колодцы)
Исследование воды поверхностных и подземных водоемов производят при выборе источника для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, для оценки санитарного состояния мест отдыха по эпидпоказаниям.
При выборе поверхностных источников водоснабжения точки забора проб воды намечают в соответствии с пунктом 3.2 ГОСТ 17.1.3.03-77 "Охрана природы. Гидросфера. Правила выбора и оценка качества источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения". При выборе подземных источников водоснабжения точки отбора проб намечают в соответствии с пунктом 3 того же ГОСТа.
При выборе источника централизованного водоснабжения пробы отбирают 1 - 2 раза в месяц.
Для исследования воды по эпидпоказаниям и в зонах отдыха точки отбора проб и кратность определяют совместно с эпидемиологом. Отбор проб воды поверхностных водоемов целесообразно производить с мостов, помостов, плавсредств. Отбор проб непосредственно с берега нежелателен.
Воду в намеченных точках забирают с помощью батометра. Пробы поверхностных вод отбирают с глубины 10 - 15 см от поверхности воды, придонные - 30 - 50 см от дна.
При исследовании воды артезианских скважин пробы отбирают после длительной откачки воды до постоянного динамического уровня. Стерильные бутыли заполняют водой, плотно закрывают стерильной пробкой. Объем одной пробы - 3,0 л.
1.3. Питьевая вода
Исследования питьевой воды в разводящей водопроводной сети проводят по эпидпоказаниям по согласованию с эпидемиологом.
Воду отбирают непосредственно в бутыли или через резиновые шланги, соблюдая стерильность. Кран концевого участка периферийной водопроводной сети (или отводящий кран на этапе обработки воды на водозаборных сооружениях) трижды обжигают спиртовым факелом и спускают воду в течение 15 минут. Объем одной пробы - 10,0 л.
1.4. Почва и осадок сточных вод
Исследование почвы и осадка сточных вод проводят по эпидпоказаниям по согласованию с эпидемиологом.
На территории обследования, вблизи источника загрязнения, для сбора почвы намечают участки в форме квадрата со стороной 5 метров. В качестве контроля намечают участок, расположенный вдали от источника загрязнения. Последний должен иметь такую же почвенную структуру.
При обследовании детских учреждений на игровых площадках и в песочницах намечают несколько участков сбора, каждый из которых имеет форму квадрата со стороной 2 метра.
Образцы проб отбирают шпателем с глубины 0 - 20 см, в количестве 30 г в пяти точках, расположенных по углам и в центре намеченного участка. Пробы, собранные с одного участка, смешивают вместе в стерильном полиэтиленовом мешке или фольге. Мешок заклеивают лейкопластырем, удалив из него воздух.
На отстойниках, иловых площадках, иловых прудах иловый осадок отбирают с помощью черпака в стерильную банку. Отбор осуществляют в 3 - 4 точках. Общий объем пробы 0,5 л.
1.5. Воздух
Исследование атмосферного воздуха проводят по эпидпоказаниям, в местах дождевания сточными водами, в случаях появления заболеваний среди обслуживающего персонала или населения, проживающего в зоне влияния дождевальных установок. Места отбора проб согласовываются с эпидемиологом.
Пробы атмосферного воздуха отбирают на расстоянии 100, 500 и 1000 м от источника распыления воды при помощи пробоотборника аэрозоля бактериологического (ПАБ-1). Принцип работы прибора основан на том, что взвешенные в воздухе частицы при прохождении через прибор получают отрицательный заряд и оседают на положительно заряженном электроде, выполненном в виде поддона с улавливающей жидкостью. Если в аэрозоле содержатся вирусные частицы, они перейдут в улавливающую жидкость. Производительность прибора 125 - 150 л/мин.
Прибор устанавливают в исследуемой точке, в осадитель вставляют поддон, в который аккуратно заливают улавливающую жидкость (мясопептонный бульон или 0,5-процентный гидролизат лактоальбумина) в объеме 25,0 - 30,0 мл. Отбор пробы проводится в течение 7 - 8 мин., исследуется 1 - 2 куб. м воздуха. По окончании работы отключают воздуходувку, выдвигают поддон и жидкость переливают в стерильный флакон.
Исследование воздуха закрытых помещений проводят по эпидпоказаниям. Пробы воздуха отбирают в трех точках помещения при помощи приборов ПОВ-1 или ПАБ-1. Засасывающее устройство приборов устанавливают на уровне 1 - 1,5 м от пола. В качестве улавливающей жидкости в приборах используется смесь среды 199 и 6-процентного раствора декстрана (полиглюкин) в соотношении 2:1. Исследуется 0,5 - 1 куб. м воздуха. Пробы, отобранные в одном помещении, объединяют в общую емкость.
1.6. Пищевые продукты
Исследование пищевых продуктов производится по эпидпоказаниям, места отбора проб и кратность отбора определяются эпидемиологом.
Жидкие пищевые продукты отбирают расфасованными в стандартной упаковке или отливают в объеме 200,0 - 300,0 мл в стерильную банку. Твердые пищевые продукты отбирают в количестве 25 - 30 г в обработанную спиртовым пламенем фольгу, тщательно упаковывая каждую пробу.
1.7. Овощи
Исследование овощей осуществляют по эпидпоказаниям, кратность отбора определяется эпидемиологом. Образцы корнеплодов (1 - 2) отбирают в пяти точках, расположенных по углам и в центре участка. Пробы, отобранные с одного участка, объединяют вместе и они составляют один образец. Отобранные овощи помещают в стерильные полиэтиленовые мешочки или стерильную фольгу. Полиэтиленовые мешочки заклеивают лейкопластырем. Образец, помещенный в фольгу, тщательно заворачивают.
1.8. Смывы с предметов обихода
Исследование смывов с предметов обихода производят по эпидпоказаниям.
Место отбора проб и кратность определяются эпидемиологом. Заготавливают
марлевые салфетки размером 5 x 10 см, кипятят их в 5-процентном растворе
бикарбоната натрия (NaHCO ) в течение 5 мин., промывают в 0,3-процентном
3
растворе серной кислоты (H SO ), затем вновь кипятят в свежей
2 4
дистиллированной воде в течение 5 мин., замачивают в новой порции
дистиллированной воды и оставляют на сутки. Салфетки складывают в 3 - 4
слоя, высушивают, стерилизуют. Стерильным пинцетом берут марлевую салфетку,
погружают ее в пробирку с 5,0 мл раствора фосфатного буфера, pH 8,2 (см.
Приложение 6.3), хорошо смачивают тампон. Увлажненным тампоном проводят
несколько раз по поверхности объекта, захватывая возможно большую поверхность. Затем тампон погружают в пробирку с остатками буфера и плотно закрывают резиновой пробкой.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Для проведения вирусологического исследования используют:
Аппарат для встряхивания жидкостей в колбах и пробирках универсальный АВУ-10П или АВУ-6П.
Весы равноплечие ручные ВР-100 по ГОСТ 395-54.
Весы лабораторные по ГОСТ 19491-74.
Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75.
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-81.
Гомогенизатор или размельчитель тканей РТ-1 или РТ-2.
Держатель фильтров размером 30, 70, 140 мм.
Инструменты зажимные медицинские с кремальерой по ГОСТ 21238-77.
Изотермические сумки.
Колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 10394-72.
Колбы стеклянные с градуированной горловиной по ГОСТ 12738-77.
Лейкопластырь по ГОСТ 97709-81.
Магнитный смеситель с магнитом цилиндрическим ММ3-94-5245.
Микроскоп МБИ-1 по ГОСТ 8284-78 или серии БИОЛАМ типа Р (рабочие).
Марля медицинская по ГОСТ 9412-77.
Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.
Насос вакуумный портативный по ГОСТ 21710-76.
Ножницы медицинские по ГОСТ 21239-77.
Осветитель ОИ-19.
Потенциометр постоянного тока измерительный по ГОСТ 9245-79.
Прибор для отбора проб воздуха ПОВ-1.
Прибор для отбора аэрозолей ПАБ-1.
Перчатки хирургические резиновые А7 по ГОСТ 3-75.
Полиэтиленовая пленка по ГОСТ 7852-76.
Пробки конусные по ГОСТ 7852-76.
Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241-77.
Приборы медицинские стеклянные по ГОСТ 20292-74Е.
Бюретки.
Посуда мерная лабораторная.
Пипетки вместимостью 1,0 - 5,0 - 10,0 с ценой деления на 0,1 мл на полное выливание.
Пастеровские пипетки.
Флаконы стеклянные вместимостью 50,0 и 100,0 мл.
Пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75.
Разновесы по ГОСТ 7328-73.
Склянки с тубусом по ГОСТ 10238-74.
Скальпель и ножи медицинские по ГОСТ 21240-77.
Стекла предметные по ГОСТ 9284-75.
Стекла покровные по ГОСТ 6672-75.
Сосуды стеклянные лабораторные по ГОСТ 10565-75.
Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 10973-75.
Термостат электрический для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до температуры 50 °С с ценой деления 0,2 °С.
Ткани фильтровальные из стеклянных крученых комплексных нитей по ГОСТ 10146-74 (стекловата).
Ткань фильтровальная ФП (Петрянова) марки: ФПП-3/20-3; ФПП-70-0,5; ФПП-15-1,5.
Фольга алюминиевая для упаковки по ГОСТ 745-79.
Холодильник бытовой электрический с температурой в камере 4 - 6 °С.
Холодильный прилавок или шкаф с температурой в камере от -20 до -22 °С.
Центрифуга лабораторная рефрижераторная ЦЛР-1МР. ТУ 42-2145-67.
Цилиндры измерительные емкостью 500,0 мл по ГОСТ 1770-74Е.
Чашки Петри по ГОСТ 10973-75.
Агар микробиологический по ГОСТ 7206-71.
Алюминий сернокислый по ГОСТ 3758-75.
Аминоуксусная кислота (глицин) по ГОСТ 5860-75.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Гептан нормальный эталонный по ГОСТ 5395-70.
Декстрины по ГОСТ 6034-74.
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75.
Калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 3204-76.
Калий гидрат окиси по ГОСТ 4203-65.
Кислота уксусная по ГОСТ 61-75.
Кислота серная по ГОСТ 4204-77.
Магний хлористый кристаллический по ГОСТ 4209-77.
Натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280-76.
Натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-66.
Натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245-66.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773-76.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77.
Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201-79.
Нейтральный красный.
Полиэтиленгликоль с м.в. 6000, 4000.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.
Фреон 113 (1,1,2-трихлортрифлюорэтан).
Эфир этиловый и бутиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300-76.
Мясопептонный бульон по ГОСТ 20730-74.
Раствор Эрла 10-кратный.
Раствор версена.
Раствор трипсина 0,25-процентный.
Раствор Хенкса, pH 7,4.
Раствор Эрла, pH 7,6.
Среда с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, pH 7,0.
Среда с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Эрла, pH 7,6.
Среда 199 на растворе Хенкса, pH 7,2.
Среда 199 на растворе Эрла.
Среда Игла, pH 7,2.
Среда Игла МЕМ для культуры клеток, pH 7,2.
Сыворотка крупного рогатого скота без консерванта.
3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Обработка материала
3.1.1. Обработка сточных вод
3.1.1.1. Осветление и очистка сточных вод от грубой взвеси:
а) Проб сточных вод, отобранных с помощью марлевого тампона.
В полиэтиленовый мешочек с тампоном добавляют 10,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4. Жидкость тщательно перемешивают, отжимая тампон снаружи мешочка.
Через 1 - 2 минуты, когда жидкость хорошо перемешается, из тампона отжимают всю жидкость, тампон отбрасывают. В отжатой жидкости измеряют pH, адъюстируют до 8,0 - 8,4, добавляя по каплям 1 М раствор NaOH или 1 М раствор HCl (см. Приложение 6.3). Об уровне pH судят по изменению цвета индикаторной бумаги. Из общего количества отливают жидкость в объеме 100,0 мл в стерильный широкогорлый центрифужный стакан и центрифугируют при 3500 об./мин. в течение 20 мин., 20,0 - 50,0 мл надосадочной жидкости переносят в стерильный центрифужный стакан, замораживают и хранят одни сутки при температуре -20 °С. По истечении этого времени пробы переносят в условия комнатной температуры +20 +/- 5 °С, жидкость оттаивает и ее центрифугируют при 3500 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость переносят в стерильный центрифужный стакан и добавляют к нему равный объем этилового эфира. Смешивание двух фаз до гомогенной суспензии осуществляют при помощи неповрежденной пипетки на 5,0 мл. На ее нерабочем конце укрепляют резиновый баллончик на 25,0 мл. Нажатием баллончика достигается получение тонкой и сильной струи. Эта процедура приводит к тщательному перемешиванию сточной жидкости с эфиром в течение 2 - 4 минут. Пробы оставляют при температуре +4 +/- 0,1 °С на 12 - 20 часов. На следующий день меняют резиновые пробки на марлевые и смесь снова центрифугируют, как описано выше. При этом образуется два слоя жидкости, и на их границе появляется кольцо жировой субстанции. Пройдя пипеткой это кольцо, осторожно отбирают со дна жидкость, переносят ее в чашку Петри, по 5,0 - 8,0 мл на чашку. Чашки оставляют приоткрытыми и время от времени покачивают. Через 2 - 2,5 часа, когда эфир испарится, жидкость одной пробы объединяют, переносят во флакон.
Пробы используют для извлечения энтеровирусов (см. пункт 4.1) или продолжают дальнейшую обработку (см. пункт 3.1.1.2).
б) Проб сточных вод, отобранных в посуду.
Сточной воде, отобранной в посуду, дают отстояться в холодильнике при +4 +/- 0,1 °С в течение 30 минут, затем верхний слой сточной жидкости в объеме 1,0 л отливают и используют для дальнейшей обработки (см. пункт 3.1.1.2). Загрязненные сточные воды черного цвета предварительно центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут, затем используют надосадочную жидкость в объеме 1,0 л.
3.1.1.2. Концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации сточных вод через фильтры из материала ФП.
а) Подготовка фильтрационной установки.
Фильтр из материала ФП закладывают в держатель Зейтца или любой другой держатель фильтра, фильтр прикладывают к решетке любой стороной, так как поверхности фильтра идентичны. Диаметр фильтра может быть равен 3,0 - 14,0 см.
б) Фильтрация.
Обследуемую пробу воды, прошедшую предварительную обработку (см. пункт 3.1.1.1), пропускают через фильтрационную установку с помощью отрицательного или положительного давления в 0,5 атм. После того как вся проба воды пропущена через фильтр, его вынимают стерильным пинцетом из держателя, помещают в стерильную чашку Петри.
в) Элюция.
На фильтр наносят 1 М раствор NaCl (элюент) из расчета 2,0 мл жидкости на 10,0 кв. см поверхности фильтра (т.е. 2,0 мл жидкости на фильтр, диаметр которого равен 3,0 см).
Фильтр промывают, пипетируя жидкость в течение 2 - 3 минут, тем самым осуществляют элюцию вирусных частиц. Жидкость сливают во флакон (элюат первый), фильтр заливают свежей порцией элюента в том же объеме и процедуру элюции вирусных частиц с фильтра повторяют (элюат второй). Элюат первый и второй объединяют вместе, производят очистку проб от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4).
3.1.2. Обработка воды поверхностных и подземных водоемов
3.1.2.1. Осветление и очистка проб воды поверхностных и подземных водоемов.
Жидкости, отобранной в бутыль, дают отстояться в холодной камере при +4 +/- 0,1 °С в течение 30 минут, затем верхний слой жидкости в объеме 2,0 л отливают и используют для дальнейшей обработки.
3.1.2.2. Концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации воды через фильтры из материала ФП (см. пункт 3.1.1.2), с помощью адсорбции на ионообменной смоле (см. пункт 3.1.3.2).
3.1.2.3. Концентрирование вирусных частиц с помощью осаждения сернокислым алюминием.
а) Осаждение вирусных частиц.
Температуру пробы сточной воды доводят до +20 +/- 1 °С в водяной бане
или термостате, к 1,0 л воды добавляют 2,0 мл 10-процентного раствора
сернокислого алюминия (Al (SO ) ), тщательно перемешивают с помощью
2 4 3
электрической мешалки любой марки, pH воды адъюстируют до значений 5,4 -
5,8, добавляя по каплям 1 М раствор HCl или 1 М раствор NaOH.
б) Обработка осадка.
Воду оставляют при комнатной температуре на 4 часа или при +4 +/- 0,1 °С на 18 часов для оседания хлопьевидного осадка. Надосадочную жидкость отбрасывают, осторожно сливая воду с помощью водоструйного насоса или через край. Осадок переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 10 - 15 минут.
в) Элюция вирусных частиц.
Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в 3,0 - 5,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4.
г) Повторная элюция вирусных частиц.
В день использования материала для заражения культуры клеток элюат центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 15 минут, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в 4,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4, содержащего в 1,0 мл 1000 ед. пенициллина, 1 мг стрептомицина, 1000 ед. нистатина, pH элюата адъюстируют до значения 7,0 - 7,3 с помощью 1 М раствора HCl или 1 М раствора NaOH.
В качестве элюентов, кроме раствора Хенкса, используют мясопептонный бульон, 0,5 М раствор фосфатного буфера, pH 8,2 (см. Приложение 6.3).
Производят очистку материала от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4).
Пробы воды, обработанные солями алюминия, хранят только при температуре +4 +/- 0,1 °С, не подвергая заморозке.
3.1.3. Обработка питьевой воды
3.1.3.1. Концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации через фильтры из материала ФП (см. пункт 3.1.1.2), осаждения сернокислым алюминием (см. пункт 3.1.2.3).
3.1.3.2. Концентрирование вирусных частиц с помощью ионообменной смолы.
Этот способ применяют при исследовании воды, имеющей уровень мутности не выше 2 - 5 мг/л.
в) Пропускание через колонку воды из водопроводной сети.
Колонку с ионообменной смолой подключают к водопроводному крану с помощью резинового шланга, воду пропускают в течение рабочего дня. Скорость тока воды в бюретку регулируют водопроводным краном, так чтобы столбик смолы был постоянно прикрыт водой.
г) Элюция вирусных частиц со смолы.
Бюретку продувают грушей для удаления остатков воды, затем заливают 10,0 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера, pH 8,2, закрывают резиновой пробкой и тщательно встряхивают. Буфер оставляют в колонке при температуре +18 +/- 5 °С на 1 час или при температуре +4 +/- 0,1 °С на 16 - 18 часов, затем производят одномоментный отбор всего элюата.
Производят очистку материала от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4).
3.1.4. Обработка почвы
3.1.4.1. Десорбция вируса с поверхности частиц почвы в жидкую фазу.
Навеску почвы в 10 г помещают в стерильный центрифужный флакон емкостью 100,0 мл, добавляют 20,0 мл раствора фосфатного буфера, pH 8,2. Полученную взвесь взбалтывают вручную в течение 2 - 3 мин., центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут. Фильтрат освобождают от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4). Надосадочную жидкость используют для выделения вируса или для дальнейшей обработки.
3.1.4.2. Концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации жидкой фазы через фильтры материала ФП (см. пункт 3.1.1.2) или с помощью осаждения сернокислым алюминием (см. пункт 3.1.2.3).
3.1.5. Обработка осадка сточных вод
3.1.5.1. Десорбция вируса с поверхности частиц ила в жидкую фазу.
Общую пробу объемом 0,5 л перемешивают, делают навеску 20 - 30 г, добавляют элюент из расчета 1:10. В качестве элюента используют смесь из мясопептонного бульона - 90-процентного и 0,5 М раствора фосфатного буфера, pH 8,2 - 10-процентного. Адъюстируют pH жидкости до значений 8,6 - 8,8 с помощью 1 М раствора HCl или 1 М раствора NaOH. Пробу обрабатывают на шуттель-аппарате в течение 10 минут, вновь адъюстируют pH жидкости до указанных значений, центрифугируют при 3500 об./мин. в течение 30 мин. Отбирают надосадочную жидкость, адъюстируют pH до значений 7,0 - 7,4, освобождают от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4) и используют для выделения вируса или для дальнейшей обработки.
3.1.5.2. Концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации жидкой фазы через фильтры из материала ФП (см. пункт 3.1.1.2) или с помощью осаждения сернокислым алюминием (см. пункт 3.1.2.3).
3.1.6. Обработка проб воздуха
3.1.6.1. Концентрирование вирусных частиц с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГа).
В пробирки с улавливающей жидкостью добавляют 1 каплю 5 М раствора NaCl и 3 - 4 мл 30-процентного раствора ПЭГа с м.в. 4000 или 6000 до помутнения суспензии. Полученную суспензию тщательно встряхивают вручную и центрифугируют при 1500 об./мин. в течение 20 - 30 мин. В пробирке образуется два слоя жидкости, разделенные прозрачным пограничным кольцом. Верхний слой жидкости отбирают аккуратно пипеткой и отбрасывают, оставляя над пограничным кольцом столбик в 1,0 - 2,0 мл. Оставшийся материал отбирают, очищают и хранят при температуре -20 +/- 0,1 °С до исследования. Очистку материала от бактериальной флоры и белка проводят в соответствии с Приложением 6.4.
3.1.7. Обработка проб пищевых продуктов
3.1.7.1. Обработка жидких молочных продуктов (молока, молочнокислых продуктов).
Обработка производится одним из двух способов в зависимости от имеющихся в наличии реактивов.
Способ 1.
В пробу продукта объемом 100,0 мл добавляют сухой ПЭГ с м.в. 4000 или 6000 в количестве 5 г и сухой NaCl в количестве 1,82 г, растворяют ингредиенты, слегка взбалтывая флакон вручную. После растворения ингредиентов пробу оставляют при температуре +4 +/- 0,1 °С на 1 час, затем центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 минут и надосадочную жидкость отбрасывают. Получают осадок в количестве примерно 25 г. Дальнейшая процедура изложена в пункте 3.1.7.2.
Способ 2.
В пробу продукта объемом 10,0 мл вносят 0,3 г кристаллического
лимонно-кислого натрия (Na C H O x 5,5H O). Жидкость в колбе перемешивают
3 6 5 7 2
на магнитной мешалке в течение 20 минут, затем добавляют 10,0 мл фреона 113
с удельным весом 1,36 и гомогенизируют смесь ингредиентов при 4000 - 5000
об./мин. в течение 1 - 2 мин. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин. в
течение 30 минут. Надосадочную жидкость слегка опалесцирующего вида
переносят в стерильный флакон, очищают от бактериальной флоры (см.
Приложение 6.4) и хранят при -20 +/- 0,1 °С до исследования.
3.1.7.2. Обработка полутвердых пищевых продуктов (творог, творожные продукты, мясные и рыбные полуфабрикаты, хлеб).
а) Экстракция вирусных частиц в жидкую фазу и осветление пробы.
Способ 1.
Навеску продукта в количестве 25 г помещают в стерильную колбу на 250,0 мл, добавляют 100,0 мл 0,1 М раствора гликоколевого буфера, pH 8,8 (см. Приложение 6.3). Колбу с жидкостью встряхивают на шуттель-аппарате в течение 5 мин. После того как проба отстоится при температуре +/-4 +/- 0,1 °С в течение 15 минут, надосадочную жидкость фильтруют через воронку со стекловатой, применяя в последнем случае положительное или отрицательное давление в 0,5 атм. Фильтр используют для концентрирования вирусных частиц (см. пункт 3.1.7.2б).
Способ 2.
Навеску продукта в количестве 25,0 г помещают в стерильный стакан от
гомогенизатора и заливают 25,0 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера, pH 8,2
или 0,1 М раствора гликоколевого буфера, pH 8,8. Гликоколевый буфер
используют для более кислых продуктов (сметана, творог, хлеб). Одновременно
к пробе добавляют 25,0 мл фреона 113, 0,5 г сухого хлористого магния (MgCl
2
x 6H O). Пробу гомогенизируют при 4000 - 8000 об./мин. в течение 2 минут.
2
Гомогенат центрифугируют при 3500 об./мин. в течение 30 минут. Надосадочная
жидкость имеет прозрачный слегка опалесцирующий вид. В том случае, если
надосадочная жидкость имеет мутный вид, обработку фреоном 113 повторяют, не
добавляя больше буфер и хлористый магний.
Осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость переносят в 50,0 мл флакон, используют для концентрирования вирусных частиц (см. пункт 3.1.7.2б).
б) Концентрирование вирусных частиц из пищевого экстракта с помощью полиэтиленгликоля.
К экстракту добавляют ПЭГ с м.в. 4000 - 6000 до получения 10-процентной концентрации и сухой хлористый натрий (NaCl) до получения 0,5 М раствора (см. Приложение 6.3). Пробу встряхивают вручную в течение 1 - 2 минут до полного растворения ингредиентов, выдерживают при +4 +/- 0,1 °С в течение 60 минут, а затем центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 15 минут. Надосадочную жидкость осторожно сливают и отбрасывают. Осадок ресуспендируют в 2,0 мл раствора Эрла, pH 7,6 или в 2,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4. Материал очищают от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4) и хранят при -20 +/- 0,1 °С до исследования.
3.1.7.3. Обработка твердых пищевых продуктов (крупа, сыры, мясная туша и др.).
К навеске продукта в количестве 50 г добавляют 100,0 мл 0,1 М раствора гликоколевого буфера, pH 8,8 или 100,0 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера, pH 8,2 (см. Приложение 6.3). Колбу с жидкостью и продуктом встряхивают в шуттель-аппарате в течение 20 минут. Пробе дают отстояться при температуре +4 +/- 0,1 °С в течение 15 минут, затем надосадочную жидкость фильтруют через воронку со стекловатой. Фильтрат используют для дальнейшей процедуры (см. пункт 3.1.7.1б).
3.1.8. Обработка проб овощей
3.1.8.1. Десорбция вирусных частиц с поверхности овощей в жидкую фазу.
4 - 5 корнеплодов, составляющих один образец, помещают в стерильную широкогорлую банку объемом 1,0 л, заливают 100,0 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера, pH 8,2, закрывают отверстие стерильной фольгой и взбалтывают вручную в течение 5 минут. Жидкость сливают и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут. Осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость освобождают от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4) и используют для выделения вируса (см. пункт 4.1) или для дальнейшей обработки (см. пункт 3.1.8.2).
3.1.8.2. Концентрирование вирусных частиц из жидкой фазы с помощью фильтрации через фильтры материала ФП (см. пункт 3.1.1.2) или с помощью осаждения сернокислым алюминием (см. пункт 3.1.2.3).
3.1.9. Обработка смывов с предметов обихода
3.1.9.1. Десорбция вирусных частиц из тампона в жидкую фазу.
В стерильных условиях тампон извлекают из пробирки и с помощью пинцета тщательно отжимают жидкость из него в чашку Петри. Жидкость из чашки Петри и остатки жидкости из пробирки объединяют вместе, очищают от бактериальной флоры (см. Приложение 6.4) и хранят при температуре -20 +/- 0,1 °С до исследования.
3.1.9.2. Концентрирование вирусных частиц из жидкой фазы с помощью фильтрации через фильтры материала ФП (см. пункт 3.1.1.2) или с помощью осаждения сернокислым алюминием (см. пункт 3.1.2.3).
3.2. Приготовление культур клеток различного происхождения
Для выделения энтеровирусов из объектов окружающей среды используют любую культуру клеток, первичную или перевиваемую, обладающею восприимчивостью ко всем или большинству из известных цитопатогенных энтеровирусов.
В процессе культивирования чувствительность перевиваемых клеток может значительно измениться. Поэтому периодически производят титрование стандартных штаммов энтеровирусов на применяемых в лаборатории культурах клеток для определения их чувствительности. Все этапы работы с культурой клеток требуют соблюдения стерильных условий: выполнения всех процедур у огня, использования стерильных инструментов, посуды, питательных сред и т.д.
3.2.1. Клетки человеческого происхождения
3.2.1.1. Первичные культуры кожно-мышечных клеток плода человека (культура клеток человеческих фибробластов).
Ткани туловища и конечностей плода 2 - 5 месяцев беременности измельчают ножницами до кусочков размером 3 - 4 мм и промывают 3 раза в растворе Хенкса, pH 7,4.
Измельченную ткань трипсинизируют. К ткани, находящейся в трипсинизационной колбе, добавляют 50,0 мл 0,25-процентного раствора трипсина и перемешивают в течение 5 минут на столике магнитной мешалки с помощью цилиндрического стерильного магнита, помещенного внутрь колбы. После осаждения ткани надосадочную жидкость отбрасывают.
50,0 - 100,0 мл свежего 0,25-процентного раствора трипсина добавляют к ткани и перемешивают на магнитном смесителе при комнатной температуре в течение 20 минут. Полученную суспензию, состоящую из клеток, переливают в центрифужный стакан, клетки осаждают центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в небольшом объеме - 20,0 - 50,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4, и помещают в холодильник до смешения с клетками последующих экстракций.
К ткани, оставшейся в колбе, добавляют свежий раствор трипсина и производят экстракцию, как описано выше. Экстракцию повторяют 2 - 3 раза.
Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 20 минут, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в 15,0 мл среды для выращивания клеток, осаждают центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в среде для выращивания клеток до концентрации 200 - 300 тыс. клеток в 1,0 мл (см. Приложение 6.5).
В качестве среды для выращивания клеток используют среду с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, pH 7,0, среду 199 на растворе Хенкса, pH 7,2, в каждую из которых добавляют сыворотку крупного рогатого скота - 10-процентную и антибиотики из расчета по 25 тыс. единиц пенициллина и 25 мг стрептомицина на 100,0 мл среды.
Суспензию клеток дозируют: по 2,0 мл в пробирки, по 10,0 мл в плоскостенные флаконы емкостью 50,0 мл, по 100,0 - 150,0 мл в плоскостенные флаконы емкостью 1,5 л.
Через 4 - 5 суток культивирования клеток в термостате при температуре +37 +/- 0 °С на стекле образуется сливной слой клеток.
3.2.1.2. Первичная культура почечных клеток плода человека.
Культура почечных клеток плода человека обладает восприимчивостью ко всем или большинству известных цитопатогенных энтеровирусов.
Почки плода человека (от 3 - 5 месяцев беременности) помещают в чашку Петри, удаляют капсулы и лоханки и измельчают ткань при помощи ножниц до кусочков размером 3 - 4 мм. Измельченную ткань подвергают трипсинизации методом, указанным в разделе 3.2.1.1. Дальнейшая процедура приготовления клеточной суспензии, выращивания клеток на стекле указана в том же разделе.
3.2.1.3. Перевиваемые линии клеток человеческого происхождения.
Культуры перевиваемых клеточных штаммов обладают различной чувствительностью к отдельным энтеровирусам и имеют более узкий спектр восприимчивости, чем первичные или диплоидные культуры. Поэтому при выделении энтеровирусов наилучший эффект дает использование нескольких перевиваемых линий.
Разнообразные клетки человеческого происхождения, как нормальные, так и опухолеродные, поддерживают путем последовательных пассажей. Наиболее широко применяют в вирусологии клеточные линии HeLa из клеток карциномы шейки матки, KB - из карциномы носоглотки, HEp-2 - из человеческого эпителия, FL - клетки амниотической оболочки человеческой плаценты. По чувствительности к различным вирусам все эти линии сходны. Культуры клеток перечисленных линий приготавливают следующим образом.
Клетки однослойной культуры диспергируют раствором версена. Для этого удаляют из флакона среду, на которой клетки выращены, промывают клеточный слой раствором версена 1 - 2 раза. Версен добавляют так, чтобы все участки клеточного слоя были покрыты жидкостью. Культуру инкубируют при температуре +37 +/- 0,1 °С в течение 15 - 20 минут.
Встряхивают флакон, тем самым снимают клетки со стекла, пипетируют клеточную взвесь, добиваясь получения однородной суспензии.
Суспензию клеток центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в среде для выращивания клеток до концентрации 200 тыс. клеток в 1,0 мл (см. Приложение 6.5).
В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла МЕМ для культуры клеток, pH 7,2, среду с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, pH 7,0, и на растворе Эрла, pH 7,15, в каждую из которых добавляют сыворотку крупного рогатого скота - 10-процентную и антибиотики (см. пункт 3.2.1.1).
Суспензию клеток разливают в посуду, как указано в разделе 3.2.1.1.
Через 4 - 5 дней культивирования клеток в термостате при температуре +37 +/- 0,1 °С на стекле образуется сливной слой клеток.
Иногда используют несколько упрощенную процедуру перевивания клеток (см. пункт 3.2.2.2).
3.2.2. Клетки обезьяны
3.2.2.1. Первичная культура клеток почек обезьяны.
Культура клеток почек обезьяны обладает восприимчивостью ко всем или большинству известных цитопатогенных энтеровирусов.
Почки обезьяны помещают в чашку Петри, удаляют капсулу и лоханки и измельчают ткань ножницами до кусочков размером 3 - 4 мм. Измельченную ткань подвергают трипсинизации методом, указанным в разделе 3.2.1.1. Клетки суспендируют до концентрации 200 - 300 тыс./мл в среде для выращивания клеток (см. Приложение 6.5).
В качестве среды для выращивания клеток используют среду с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, pH 7,0, с добавлением сыворотки крупного рогатого скота - 7-процентной и антибиотиков (см. пункт 3.2.1.1).
Суспензию клеток разливают в посуду, как указано в разделе 3.2.1.1.
Через 6 - 7 суток культивирования в термостате при температуре +37 +/- 0,1 °С на стекле образуется сливной слой клеток.
3.2.2.2. Перевиваемые линии клеток обезьяньего происхождения.
Наиболее широко применяют в вирусологии клеточные линии: BS-C-1 почечных клеток зеленых мартышек, Vero почечных клеток африканских зеленых мартышек, пригодные для выделения вируса полиомиелита, некоторых вирусов Коксаки A, всех вирусов Коксаки B и большинства вирусов ECHO.
Чаще используют следующую процедуру перевивания клеток. Флакон с культурой клеток микроскопируют и, в зависимости от качества монослоя, намечают пропорцию разведения клеток при процедуре перевивания. При хорошем плотном монослое клетки перевивают из расчета 1:4 или 1:5. Это значит, что клетки, снятые с одного флакона, перевивают на 4 или 5 таких же флаконов после разведения клеточной взвеси в соответствующем объеме среды. Если во флаконе, с которого идет перевивание клеток, содержится 10,0 мл среды, то эти же клетки после диспергирования суспендируют в 40,0 или 50,0 мл среды для выращивания клеток.
Клетки однослойной культуры снимают со стекла трипсин-версеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25-процентного раствора трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30 - 35 °С, теплой смесью заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. Через 2 - 5 минут визуально устанавливают появление небольших разрушений монослоя на стекле в виде "окошек", "дорожек". Трипсин-версен сливают из флакона, флакон помещают на горизонтальную поверхность монослоем клеток вниз. Через 3 - 5 минут флакон энергично встряхивают вручную, при этом клетки отторгаются от стекла. Во флакон вносят 5,0 - 10,0 мл среды для выращивания клеток, клетки диспергируют, хорошо пипетируя клеточную взвесь. Затем вносят дополнительное количество питательной среды до расчетного объема.
В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла МЕМ, pH 7,2, с добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота - 10-процентной и антибиотиков (см. пункт 3.2.1.1).
Взвесь клеток разливают в стерильную посуду, как указано в пункте 3.2.1.1.
Через 2 - 4 суток культивирования клеток при температуре +37 +/- 0,1 °С производят смену питательной среды. В качестве среды для поддержания роста клеток используют: среду с 0,5-процентным гидролизата лактальбумина на растворе Эрла, pH 7,6, среду 199 на растворе Эрла, среду Игла без глютамина. Глютамин в замороженном состоянии хранят в отдельной расфасовке и добавляют непосредственно перед работой.
На 5 - 7 сутки на стекле формируется сплошной клеточный слой.
4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗОВ
4.1. Выделение цитопатогенных энтеровирусов из обработанного материала на культуре клеток
4.1.1. Выделение цитопатогенных энтеровирусов из обработанного материала на культуре клеток под жидкой поддерживающей средой
Производят предварительное отмывание культуры клеток от сыворотки. Из флакона или пробирки с монослоем культуры клеток удаляют среду для выращивания клеток, вносят 5,0 - 7,0 мл раствора Хенкса, pH 7,4, или раствора Эрла, pH 7,6, покачивают флакон, удаляют отмывающий раствор.
На монослой культуры клеток наносят исследуемый обработанный материал, инкубируют клетки при +37 +/- 0,1 °С в течение 60 минут, после чего жидкость удаляют, вносят среду, поддерживающую рост клеток, без сыворотки. Инкубирование культур производят при +37 +/- 0,1 °С. Зараженные культуры микроскопируют через день. Если дегенерация охватывает примерно 50% клеток, вируссодержащую жидкость собирают и хранят при температуре -20 +/- 0,1 °С до исследования.
Объем заражающей дозы материала зависит от величины монослоя: 0,2 мл на культуру клеток, выращенную в пробирке, 1,0 мл - на культуру клеток, выращенную в 50,0 мл плоскостенном флаконе, 2,0 мл - на культуру клеток, выращенную в 100,0 мл флаконе.
Материал проводят через дополнительный пассаж при ранней дегенерации (в пределах 18 часов после заражения), которая часто связана с токсичностью материала, при поздней дегенерации (спустя 7 суток после заражения) и при отсутствии дегенерации на 10 сутки после заражения.
Процедура дополнительного пассирования материала аналогична вышеуказанной в данном разделе, за исключением двух моментов: 1) объем заражающей дозы 0,2 - 0,5 мл; 2) после инкубации заражающий материал не удаляют с монослоя.
4.1.2. Выделение цитопатогенных энтеровирусов из обработанного материала на культуре клеток под плотным агаровым покрытием
Методику применяют в том случае, если предполагают, что исследуемый материал насыщен энтеровирусами.
Производят отмывание культуры клеток, как указано в разделе 4.1.1. На монослой культуры клеток, выращенной в 50,0 мл или 100,0 мл плоскостенном флаконе, наносят 1,0 мл исследуемого образца, культуру инкубируют при +37 +/- 0,1 °С в течение 60 минут, затем жидкость удаляют из флакона пастеровской пипеткой. Монослой заливают агаровым покрытием, имеющим температуру +37 +/- 0,1 °С, из расчета 7,0 мл на флакон. Агаровое покрытие составляют по прописи Уоллис и Мелник:
10-кратный раствор Эрла - 18,0 мл.
Трижды дистиллированная вода - 59,4 мл.
Сыворотка крупного рогатого скота - 4,0 мл.
Нейтральный красный 1:1000 - 3,0 мл.
Сода одноосновная 7,5-процентная (NaHCO ) - 10,8 мл.
3
Агар "Дифко" 1,5-процентный - 90,0 мл.
При приготовлении ингредиентов см. Приложение 6.8.
Через 30 - 60 минут после внесения агарового покрытия флаконы переворачивают монослоем вверх для того, чтобы конденсационная влага не попадала на бляшки и не размывала их. Поворачивать флаконы рекомендуется, совершая быстрое движение, устанавливающее флакон вертикально пробкой вверх, а затем горизонтально. При повороте флакона через его боковую поверхность агаровое покрытие может соскользнуть с клеточного монослоя. С момента внесения агарового покрытия флаконы держат под светонепроницаемым материалом, так как нейтральный красный на свету может ингибировать образование бляшек. Бляшка - видимое на глаз светлое пятно на розовом фоне монослоя. Бляшка является негативной колонией, которая образуется вследствие того, что клетки, разрушенные действием одной вирусной частицы, становятся не способными сорбировать нейтральный красный.
Зараженные культуры инкубируют при +37 +/- 0,1 °С. Подсчет количества бляшек осуществляют на 3, 4, 5, 7 сутки от момента заражения.
4.1.3. Разделение смеси различных типов энтеровирусов
а) Метод бляшек.
По мере появления бляшек их снимают, т.е. агар над бляшкой удаляют пастеровской пипеткой, втягивая агаровый столбик в пипетку, а затем переносят его в 1,0 мл раствора Эрла, pH 7,6. Агар над бляшками удаляют по мере их появления ежедневно, до 8 - 9 суток, при этом каждую бляшку маркируют, учитывают срок ее появления, форму, размеры. Материал каждой бляшки однократно замораживают и оттаивают для разрушения агара, а затем используют для заражения культуры клеток, выращенной в одной пробирке. Дальнейшая процедура, как в разделе 4.1.1. Штамм вируса, выделенный из бляшки, типируют одним из методов, указанных ниже. Из каждой пробы идентифицируют материал 1 - 2 бляшек, наиболее различающихся по форме и срокам их появления.
Дальнейшее выделение вирусов из той же пробы осуществляют, подавляя уже установленный тип вируса специфической антисывороткой. 1,0 мл исходной пробы смешивают с 1,0 мл антисыворотки в ее рабочем разведении. Смесь инкубируют при температуре +37 +/- 0,1 °С 90 минут, а затем 1,0 мл смеси используют для заражения культуры клеток. Дальнейшая процедура, как указано в разделе 4.1.1.
Выделение бляшек при подавлении антисывороткой или смесью антисывороток установленных типов вирусов повторяют до тех пор, пока не выявляются все бляшкообразующие типы вирусов. Небляшкообразующие цитопатогенные энтеровирусы выявляют по наличию цитопатогенного эффекта в культуре клеток под жидкой поддерживающей средой при отсутствии бляшек под плотным агаровым покрытием.
б) Метод конечного разведения.
Проводят титрование материала, т.е. приготавливают ряд 10-кратных его разведений (см. Приложение 6.6). Материалом каждого разведения в объеме 0,1 или 0,2 мл заражают культуру клеток в 10 пробирках. Цитопатические изменения, возникшие не более чем в одной пробирке из десяти (т.е. 10%), свидетельствуют о наличии в вируссодержащей жидкости 1 вирусной частицы и возможности использования материала для исследования.
4.2. Титрование цитопатогенных энтеровирусов на культуре клеток
Для получения данных о количестве цитопатогенных энтеровирусов в материале чаще всего используют два метода количественной индикации вируса на культуре клеток - метод бляшек и метод конечного разведения, основанные на цитопатогенном действии вирусных частиц на культуру клеток.
При использовании метода бляшек определяют наибольшее разведение вируссодержащего материала, при заражении которым на культуре клеток получают легко сосчитываемое количество бляшек под агаровым покрытием. Путем пересчета определяют количество бляшкообразующих единиц вируса в 1,0 мл исходного материала. При использовании метода бляшек единицей измерения количества вируса в образце является число бляшкообразующих единиц в 1,0 мл материала - БОЕ/мл.
При использовании метода конечного разведения определяют наибольшее
разведение вируссодержащего материала, при котором возникает дегенерация в
50% пробирок с зараженной культурой клеток. Количество вируса в этом
разведении называют 50-процентной тканевой цитопатогенной дозой. При
использовании метода конечного разведения единицей измерения количества
вируса в образце является 50-процентная тканевая цитопатогенная доза -
ТЦД .
50
1 БОЕ примерно равна 1 - 2 ТЦД .
50
4.2.1. Определение количества вируса в вируссодержащем материале при использовании метода бляшек
Готовят серию последовательных 10-кратных разведений вируссодержащей жидкости так, как это указано в Приложении 6.6. Отмывают культуру клеток так, как указано в пункте 4.1.1. Каждое разведение вируссодержащей жидкости в объеме 0,1 или 0,2 мл вносят в 2 - 4 плоскостенных флакона с культурой клеток, выпуская жидкость из пипетки легкой стрункой, чтобы не повредить монослой. Флаконы слегка покачивают, чтобы равномерно распределить вируссодержащую жидкость по монослою. Зараженные флаконы инкубируют при +37 +/- 0,1 °С в течение 60 минут, а затем заливают агаровым покрытием так, как это указано в пункте 4.1.3.
Количество бляшек подсчитывают на 3, 4, 5, 7 сутки. Разведение вируссодержащей жидкости, при котором на монослое 50,0 мл плоскостенного флакона появилось 15 - 20 бляшек, считают оптимальным для определения титра вируса.
4.2.2. Расчет титра вируса в бляшкообразующих единицах (БОЕ)
При определении титра вируса для повышения точности в расчетах используют результаты, получаемые в двух разведениях: 1. В разведении, при котором появилось оптимальное для подсчета число бляшек; 2. Последующего за ним разведения, при котором появились единичные бляшки.
Пример.
При титровании вируссодержащего материала методом бляшек использовали
по 3 флакона с культурой клеток для заражения материалом каждого
разведения. Объем заражающей дозы - 0,2 мл. На флаконах, зараженных
-6
материалом в разведении 10 , появилось 15, 16, 20 бляшек; на флаконах,
-7
зараженных материалом в разведении 10 - 2, 3, 1 бляшка.
Результаты данного титрования будут разработаны во всех примерах раздела.
По данным титрования производят расчет титра вируса.
4.2.2.1. Определение среднеарифметического числа бляшек во флаконах.
_
Средне-арифметическое X бляшек во флаконах, зараженных вируссодержащей
жидкостью каждого из указанных разведений, определяют по формуле:
n
SUM X
_ i=1 i
X = ------,
n
где:
n - число параллельных флаконов;
X - число бляшек во флаконе с номером i данного разведения
i
(i = 1 - n).
Пример. Обозначают:
_
X - среднеарифметическое число бляшек во флаконах, зараженных
i
материалом из того разведения, при котором появились единичные бляшки
-7
(10 ),
X = 2, 3, 1; n = 3; i = 1 - 3;
i
_
X - среднеарифметическое число бляшек во флаконах, зараженных
2
материалом из того разведения, при котором появилось оптимальное число
-6
бляшек (10 ),
X = 15, 16, 20; n = 3; i = 1 - 3;
i
Определяют:
_ 2 + 3 + 1 _ 15 + 16 + 20
X = --------- = 2; X = ------------ = 17.
1 3 2 3
4.2.2.2. Определение среднеквадратического отклонения.
Среднеквадратическое отклонение S определяют по формуле:
n _2 _2
SUM X - n X
2 i=1 i
S = -------------;
n - 1
где:
n - число флаконов, которые были использованы для заражения одним
разведением;
X - число бляшек во флаконе с номером i.
i
Пример.
2 2 2 2
2 (2 + 3 + 1 ) - 3 x 2
S = ----------------------- = 1;
1 3 - 1
2 2 2 2
2 (15 + 16 + 20 ) - 3 x 17 225 + 256 + 400 - 3 x 289
S = --------------------------- = ------------------------- = 7.
2 3 - 1 2
4.2.2.3. Определение значения весов.
По таблицам 11 - 15 (см. Приложение 6.1) определяют значение весов (W). Для проведения всех последующих вычислений подбирают таблицу в зависимости от числа n, т.е. от числа флаконов, которые были использованы для заражения одним разведением.
2
1. S = 1;
1
n = 3.
2
По таблице 12, при n = 3, от обозначения S продолжают горизонтальную
1
линию и находят цифру, равную 1,0 или близкую к ней по значению. В данном
примере найденное значение равно 1,00. Под этой цифрой находят значение
W .
1
2
2. S = 7;
2
n = 3.
2
По таблице 12, при n = 3, под обозначением S продолжают вертикальную
2
линию и находят цифру 7,0 или наиболее близкую к ней. В данном примере
найденное значение равно 5,00.
Рядом с этой цифрой справа находят значение W . В данном примере
2
W = 60,00.
2
4.2.2.4. Определение ошибки титрования.
По таблицам 11 - 15 определяют ошибку титрования m (см. Приложение 6.1)
на пересечении вертикальной линии, идущей от значения W , и горизонтальной
1
линии, идущей от значения W .
2
В данном примере:
W = 3,00;
1
W = 60,00;
2
n = 3.
В таблице 12, при n = 3, на пересечении вертикальной линии, идущей от
значения W = 3,00, и горизонтальной линии, идущей от значения W = 60,00,
1 2
находят значение ошибки титрования m = 0,54.
4.2.2.5. Определение средневзвешенного титра вируса.
Средневзвешенный титр вируса определяют по формуле:
_
X
_ 2
X W + -- W
1 1 10 2
Z = -------------.
W + W
1 2
В данном примере:
_
X = 2;
1
_
X = 17;
2
W = 3;
1
W = 60;
2
m = 0,54;
17
2 x 3 + -- x 60
10
Z = --------------- = 1,71.
3 + 60
7
Значение среднего титра в данном примере 1,71 x 10 БОЕ в объеме 0,2 мл
7,93+/-0,54
при ошибке m = 0,54 или 10 БОЕ/мл или 7,93 +/- 0,54 БОЕ/мл,
выраженное в lg.
4.2.2.6. Условия, необходимые для учета результатов титрования вируса.
Результаты титрования не учитывают, если нарушены следующие условия.
1. Отношение количества бляшек в двух соседних разведениях должно быть примерно равно 10.
2. Отношение размаха выборки (максимальное число бляшек на флаконе минус минимальное число бляшек на флаконе среди параллельных флаконов одного разведения) к среднему числу бляшек на флаконе должно быть меньше 3.
4.2.3. Определение количества вируса в вируссодержащем материале при использовании метода конечного разведения
Готовят серию последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала так, как это указано в Приложении 6.6. Каждое разведение вируссодержащей жидкости в объеме 0,1 или 0,2 мл вносят в 4, 5 или 6 пробирок с культурой клеток. Процедура заражения, как указано в пункте 4.2.1. Состояние культур периодически проверяют под микроскопом, отмечая на 4 и 7 сутки пробирки с дегенерацией клеток.
4.2.4. Расчет титра вируса в тканевых
цитопатогенных дозах (ТЦД )
50
Титр вируса в ТЦД определяют методом пробитов, используя специальные
50
таблицы 16 - 18 (см. Приложение 6.2). Для проведения всех последующих
манипуляций подбирают таблицу в зависимости от числа n, т.е. от числа
пробирок, которые были использованы для заражения одним разведением. При
титровании десятикратных разведений вируссодержащего материала на 4
пробирках (n = 4) используют данные таблицы 16, на 5 пробирках (n = 5) -
данные таблицы 17, на 6 пробирках (n = 6) - данные таблицы 18.
Полученные результаты сопоставляют с данными левой части таблицы, где
указано число пробирок, в которых наступила дегенерация клеток в четырех
последних разведениях вируссодержащего материала. В правой части таблицы
находят соответствующий им титр вируса в ТЦД , выраженных в lg, с ошибкой
50
титрования (m). Истинный титр определяют, суммируя найденные по таблице
значение и логарифм разведения, с которого начали определять титр.
Пример.
Определяют значение титра вируса в ТЦД при следующих результатах
50
титрования каждого разведения на 4 пробирках и объеме заражающей дозы - 0,2
мл.
----------------------------------------+----T----+----T----+----- ¦ ¦ -1¦ -2¦ -3¦ -4¦ -5¦ ¦Разведение вируссодержащего материала ¦10 ¦10 ¦10 ¦10 ¦10 ¦ +---------------------------------------+----+----+----+----+----+ ¦Число пробирок с культурой клеток, в ¦4 ¦4 ¦3 ¦1 ¦0 ¦ ¦которых наступила дегенерация ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ----------------------------------------+----+----+----+----+-----
При n = 4.
По таблице 16, где n = 4, находят строку, соответствующую результатам
титрования в 4-х последних разведениях, т.е. 4, 3, 1, 0. Определяют lg
титра и ошибку титрования 1,5 +/- 0,2. К найденному значению прибавляют
десятичный логарифм разведения, с которого начали определять титр, в данном
случае 2. Титр вируса в 0,2 мл вируссодержащей жидкости равен 2 + 1,5 +/-
0,2 = 3,5 +/- 0,2 (в lg). Очевидно, что в объеме 0,2 мл содержится 3200 +/-
0,2 ТЦД ; в 1,0 мл вируссодержащей жидкости вируса будет в 5 раз больше,
50
4,2+/-2,0
т.е. 3,5 + lg 5 +/- 0,2 = 3,5 + 0,7 +/- 0,2 (в lg) или 10 ТЦД
50
в 1,0 мл, или 4,2 +/- 0,2 ТЦД , выраженных в lg.
50
Результаты титрования не учитываются, если нарушены условия пункта 4.2.2.6.
4.3. Идентификация выделенных цитопатогенных агентов
4.3.1. Идентификация выделенных цитопатогенных агентов в реакции нейтрализации
Для идентификации выделенных штаммов чаще всего применяют реакцию
нейтрализации. Реакция нейтрализации основана на способности иммунной
сыворотки превращать в неинфекционный или нейтрализовать соответствующий ей
тип вируса. При применении реакции нейтрализации с использованием культуры
клеток для идентификации энтеровирусов основной эффект заключается в
разрушающем цитопатогенном действии вируса на клетки, при отсутствии такого
эффекта от действия вируса, нейтрализованного сывороткой. При постановке
реакции нейтрализации на культуре клеток соблюдают количественные и
объемные соотношения вируссодержащей жидкости и сыворотки. В реакцию
включают материал, содержащий 100 БОЕ или 100 ТЦД вируса, и сыворотку,
50
содержащую 20 вируснейтрализующих единиц, в равных жидкостных объемах.
4.3.1.1. Техника постановки реакции нейтрализации.
Все манипуляции при постановке реакции требуют соблюдения строгих стерильных условий.
а) Приготовление рабочих разведений вируссодержащего материала.
Соблюдая правила техники приготовления разведений (см. Приложение 6.6),
готовят разведение вируссодержащей жидкости каждого исследуемого штамма
так, чтобы в 0,1 мл конечного разведения содержалось 100 ТЦД или 100 БОЕ.
50
В качестве разбавителя используют раствор Эрла, pH 7,6. Конечный объем
рабочего разведения вируссодержащей жидкости должен быть не менее 1,0 мл.
Пример 1.
6 5
Титр вируссодержащей жидкости <...> 10 БОЕ/1,0 мл или 2 x 10 БОЕ/0,1
5,3
мл или 1 x 10 БОЕ/мл.
Чтобы в 0,1 мл вируссодержащей жидкости содержалось 100 БОЕ, необходимо
-3,3
приготовить разведение 10 . Готовят серию последовательных десятикратных
-3
разведений вируссодержащей жидкости до разведения 10 (см. Приложение
6.6). Последнее разведение разводят еще в два раза, так как логарифм 0,3
равен 2 (см. Приложение 6.6).
Пример 2.
7,5 6,5
Титр вируссодержащей жидкости 10 ТЦД /мл или 10 ТЦД /0,1 мл.
50 50
Для того чтобы в 0,1 мл вируссодержащей жидкости содержалось 100 ТЦД ,
50
-4,5
необходимо приготовить разведение 10 . Готовят серию последовательных
-4
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное