Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 ноября 2010 года
Дата введения:
с момента утверждения
1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
5. Введены впервые.
Свидетельство об аттестации методики N 01.5.04.673 от 25.06.2010.
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств карбендазима в зерне гороха и масле рапса в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.
Действующее вещество: карбендазим.
Структурная формула (не приводится).
Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).
Молекулярная масса: 191,2.
Брутто-формула: C H N O .
9 9 3 2
Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок без цвета и запаха.
Температура плавления 302 - 307 °С (с разложением).
Давление пара 0,09 мРа (20 °С); 0,15 мРа (25 °С); 1,3 мРа (50 °С).
Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K lg P = 1,38
ow
(pH 5); 1,51 (pH 7); 1,49 (pH 9).
Растворимость в воде (мг/куб. дм, 24 °С): 29 (pH 4); 8 (pH 7); 7 (pH 8).
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 24 °С): диметилформамид - 5; ацетон - 0,3; этанол - 0,3; хлороформ - 0,1; этилацетат - 0,135; дихлорметан - 0,068; бензол - 0,036; циклогексан и диэтиловый эфир - < 0,01; н-гексан - 0,0005.
Субстанция карбендазима стабильна по крайней мере в течение 2 лет при
температуре хранения ниже 50 °С, а также после 7 дней интенсивного
облучения светом (20000 люкс). В щелочных растворах медленно разлагается.
При 22 °С DT превышает 350 дней (pH 5 и 7) и равен 124 дням (pH 9).
50
Будучи слабым основанием (рК 4,2), в кислых растворах образует стабильные
а
водорастворимые соли.
Краткая токсикологическая характеристика: острая оральная токсичность -
LD для крыс - 6400 мг/кг; для собак - более 2500 мг/кг; дермальная - LD
50 50
для кроликов более 10000 мг/кг; для крыс - более 2000 мг/кг; не оказывает
раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз; ингаляционная -
при использовании водной суспензии 10 г/л эффект не обнаружен для крыс,
кроликов, морских свинок и кошек. Период наблюдения 4 часа.
Область применения: фунгицид системного действия с длительным защитным и целебным эффектом. Эффективно подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых грибами из родов Septoria, Fusarium, Erysiphe и Pseudocercosprella на зерновых культурах; Sclerotinia, Alternaria и Cylindrosporium на семенах рапса.
В России для карбендазима установлены следующие гигиенические нормативы:
- ПДК в воде - 0,1 мг/куб. дм;
- ОДК в почве - 0,1 мг/кг;
- МДУ (мг/кг) - корнеплоды сахарной свеклы 0,1; зерно хлебных злаков 0,2.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Таблица 1
--------+--------------+--------------+--------------+--------+------------ ¦Объект ¦ Диапазон ¦Норматив точ- ¦Относительное ¦Предел ¦Предел ¦ ¦анализа¦ определяемых ¦ности (границы¦ стандартное ¦повторя-¦воспроизво-¦ ¦ ¦концентраций, ¦относительной ¦ отклонение ¦емости, ¦димости, R,¦ ¦ ¦ мг/кг ¦погрешности), ¦повторяемости,¦r, % ¦% ¦ ¦ ¦ ¦+/- дельта, % ¦ сигма , % ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ r ¦ ¦ ¦ +-------+--------------+--------------+--------------+--------+-----------+ ¦Зерно ¦0,05 - 0,1 ¦<= 50 ¦6,9 ¦19 ¦36 ¦ ¦гороха ¦0,1 - 0,5 ¦<= 25 ¦3,6 ¦10 ¦30 ¦ +-------+--------------+--------------+--------------+--------+-----------+ ¦Масло ¦0,05 - 0,1 ¦<= 50 ¦3,9 ¦11 ¦28 ¦ ¦рапса ¦0,1 - 0,5 ¦<= 25 ¦3,4 ¦9 ¦20 ¦ --------+--------------+--------------+--------------+--------+------------
Таблица 2
-------------+-------+------------+--------+-----------+------------------- ¦ Объект ¦Предел ¦Диапазон ¦Среднее ¦Стандартное¦ Доверительный ¦ ¦ анализа ¦обнару-¦определяемых¦значение¦отклонение,¦интервал среднего ¦ ¦ ¦жения, ¦концентра- ¦опреде- ¦ S ¦результата, +/- % ¦ ¦ ¦мг/кг ¦ций, мг/кг ¦ления, %¦ ¦ ¦ +------------+-------+------------+--------+-----------+------------------+ ¦Зерно гороха¦0,05 ¦0,05 - 0,5 ¦85,9 ¦10,3 ¦20 ¦ +------------+-------+------------+--------+-----------+------------------+ ¦Масло рапса ¦0,05 ¦0,05 - 0,5 ¦95,7 ¦9,2 ¦18 ¦ -------------+-------+------------+--------+-----------+-------------------
Методика основана на определении карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм карбендазима между двумя несмешивающимися фазами.
Идентификация карбендазима проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-80 pH-метр фирмы Hanna Instrument, мод. Р212 Колбы мерные на 10, 50, 100, 1000 куб. см ГОСТ 23932-90 Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91 Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см ГОСТ 23932-90.
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ", или хч ТУ 6-09-3534-87 Вода бидистиллированная деионизированная ГОСТ 6709-79 Гексан, хч ТУ 2631-003-05807999-98 Гидроксид натрия, 1 М водный раствор Карбендазим с содержанием основного вещества 99,4% Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166-76 Соляная кислота, 0,1 М водный раствор Трифторуксусная кислота, ч, 0,05%-ный водный раствор ТУ 6-09-3877-80 Этилацетат ГОСТ 223000-76 Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05%-ной трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90.
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82 Бидистиллятор Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R 205 Ультразвуковая баня УЗВ-1,3 ГОСТ Р МЭК 60335-2-15-98 Фильтры бумажные "красная лента" ТУ 6.091678-86.
Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Перед началом анализа колонку (Acquity BEH С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2.1. 0,05%-ный раствор трифторуксусной кислоты: 0,5 куб. см свежеперегнанной трифторуксусной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 100 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки 0,05%-ным раствором трифторуксусной кислоты.
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см: точную навеску карбендазима (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,4; 0,8; 1,2; 2,0 и 4,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.
7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 4,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,4 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 2,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 1,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 3 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
При изучении полноты определения карбендазима в зерне гороха и масле рапса используют ацетонитрильные растворы вещества.
7.4.1. Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
где S - площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|С - С |
к
-------- х 100 <= лямбда ,
С контр.
где:
С - аттестованное значение массовой концентрации карбендазима в
градуировочном растворе;
С - результат контрольного измерения массовой концентрации
к
карбендазима в градуировочном растворе;
лямбда - норматив контроля градуировочного коэффициента, %
контр.
(лямбда = 10% при P = 0,95).
контр.
Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 "Горох. Требования по заготовке и поставке".
Среднюю пробу зерна гороха измельчают, перемешивают и выделяют аналитические пробы. Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.
Отбор проб семян рапса для получения масла проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.
10 г измельченных семян гороха помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 5 куб. см воды и 50 куб. см этилацетата. Экстрагируют в ультразвуковой бане в течение 10 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента" и экстракцию повторяют с 50 куб. см этилацетата. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку и отделившийся водный слой отбрасывают. Из органического экстракта карбендазим экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Водный слой отделяют. Экстракцию повторяют еще 2 раза. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата <*>. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Этилацетатный экстракт помещают в делительную воронку, выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают, а органический промывают 25 куб. см воды, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают. Органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
--------------------------------
<*> Повторную экстракцию нужно проводить только после полного разделения фаз. Для ускорения процесса разделения можно в делительную воронку добавить 1 - 2 куб. см этилового спирта.
10 г масла растворяют в 90 куб. см гексана, помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Экстракцию повторяют еще два раза. Гексан отбрасывают. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Объединенный этилацетатный экстракт промывают 25 куб. см, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают, а органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05%-ной трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 280 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Время удерживания карбендазима (5,1 +/- 0,1) мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,4 - 4,0 мкг/куб. см.
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбендазима в зерне гороха или масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х К х V 100
x
X = ---------- х ---,
P f
где:
S - площадь пика карбендазима на хроматограмме испытуемого образца,
x
кв. мм (AU);
К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения
соответствующей градуировочной зависимости;
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб.
см;
P - навеска анализируемого образца, г;
f - полнота извлечения карбендазима, приведенная в табл. 2, %.
Содержание остаточных количеств карбендазима в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима с концентрацией 4,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r,
(X + X )
1 2
где:
X и X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
где:
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х X
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где ДЕЛЬТА - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>).
--------------------------------
<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения карбендазима в зерне гороха и масле рапса.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию:
д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА ,
д л,X л,X'
где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности
л,X л,X'
(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
ДЕЛЬТА = +/- 0,84 х ДЕЛЬТА,
л
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта х X
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где ДЕЛЬТА - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле:
к
К = X' - X - С ,
к д
где X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в
образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки
соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2
К = \/ ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . (1)
л,X' л,X
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
|К | <= К, (2)
к
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 |X - X | х 100
1 2
----------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X и X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: