МУК 4.1.2784-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 ноября 2010 года

Дата введения:
с момента утверждения

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Общие положения

Свидетельство об аттестации методики N 0036.16.07.10 от 19.07.2010.

Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой доли дифеноконазола в ягодах винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг, в виноградном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг методом капиллярной газожидкостной хроматографии.

Название вещества по ИСО: дифеноконазол.

Название вещества по ИЮПАК: 4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил] фенила.

Структурная формула (не приводится).

    C  H  Cl N O .
     19 17  2 3 3
    Мол. масса: 406,3.
    Кристаллическое   вещество   от   белого   до   светло-бежевого  цвета.
                                                                    -5
Температура  плавления:  78,6 °С. Давление паров при 25 °С: 3,3 х 10   мПа.
Коэффициент  распределения  н-октанол/вода: К   log Р = 4,20. Растворимость
                                             ow
(г/куб. дм) при 25 °С: этанол - 330, ацетон - 610, толуол - 490, н-гексан -
< 3,4, н-октанол - 95, вода - 0,015.
    Вещество  устойчиво  к гидролизу и фотолизу (при естественном солнечном
свете DT   = 145 дней).
        50
    Дифеноконазол быстро сорбируется почвой и медленно разрушается.
    Краткая гигиеническая характеристика:
    Острая  пероральная  токсичность  (LD  ) для крыс - 1453, для мышей - >
                                         50
2000  мг/кг;  острая  дермальная  токсичность  (LD  ) для кроликов - > 2010
                                                  50
мг/кг; острая  ингаляционная токсичность (LC  ) для крыс - > 3300 мг/куб. м
                                            50
воздуха.  LC   для рыб 0,8 - 1,2 мг/куб. дм (96 ч). Фунгицид нетоксичен для
            50
птиц, пчел и дождевых червей.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в яблоках, грушах, сахарной свекле - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля.

Область применения препарата:

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Применяется в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян сахарной свеклы, зерновых колосовых культур и рапса при норме расхода 45 - 60 г д.в./т семян, а также используется для обработки вегетирующих растений сахарной и столовой свеклы, картофеля, моркови и рапса, яблоневых и грушевых садов с нормой расхода до 100 г д.в./га.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

----------+------------+----------------+--------------+----------+--------
¦Анализи- ¦Диапазон    ¦Показатель точ- ¦ Стандартное  ¦Предел    ¦Предел ¦
¦руемый   ¦определяе-  ¦ности (граница  ¦  отклонение  ¦повторяе- ¦воспро-¦
¦объект   ¦мых концент-¦относительной   ¦повторяемости,¦мости, r, ¦изводи-¦
¦         ¦раций, мг/кг¦погрешности),   ¦  сигма , %   ¦%         ¦мости, ¦
¦         ¦            ¦+/- дельта, %,  ¦       r      ¦          ¦R, %   ¦
¦         ¦            ¦Р = 0,95        ¦              ¦          ¦       ¦
+---------+------------+----------------+--------------+----------+-------+
¦Ягоды    ¦от 0,02 до  ¦50              ¦2,4           ¦7         ¦8      ¦
¦винограда¦0,10 вкл.   ¦                ¦              ¦          ¦       ¦
¦         +------------+----------------+--------------+----------+-------+
¦         ¦св. 0,10 до ¦25              ¦1,9           ¦5         ¦6      ¦
¦         ¦0,20        ¦                ¦              ¦          ¦       ¦
+---------+------------+----------------+--------------+----------+-------+
¦Сок      ¦от 0,01 до  ¦50              ¦3,5           ¦10        ¦12     ¦
¦винограда¦0,1 вкл.    ¦                ¦              ¦          ¦       ¦
----------+------------+----------------+--------------+----------+--------

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

-------+-------------------------------------------------------------------
¦Анали-¦            Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20           ¦
¦зируе-+------------+--------------+-----------+------------+-------------+
¦мый   ¦   предел   ¦   диапазон   ¦  полнота  ¦стандартное ¦доверительный¦
¦объект¦обнаружения,¦ определяемых ¦извлечения ¦отклонение, ¦   интервал  ¦
¦      ¦   мг/кг    ¦концентраций, ¦вещества, %¦    S, %    ¦   среднего  ¦
¦      ¦            ¦    мг/кг     ¦           ¦            ¦ результата, ¦
¦      ¦            ¦              ¦           ¦            ¦    +/- %    ¦
+------+------------+--------------+-----------+------------+-------------+
¦Ягоды ¦0,02        ¦0,02 - 0,2    ¦88,6       ¦3,7         ¦+/- 3,4      ¦
+------+------------+--------------+-----------+------------+-------------+
¦Сок   ¦0,01        ¦0,01 - 0,1    ¦90,4       ¦2,7         ¦+/- 2,6      ¦
-------+------------+--------------+-----------+------------+--------------

2. Метод измерений

Метод основан на экстракции дифеноконазола из ягод ацетоном, из сока смесью гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему), очистке экстрактов, содержащих дифеноконазол, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол, с последующим измерением содержания дифеноконазола в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с электронозахватным детектором (ЭЗД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М"
с ЭЗД (СКБ "Хроматэк", Россия)                    номер Госреестра
                                                  N 14516-95
Весы аналитические Sartorius 6110 с наибольшим
пределом взвешивания до 110 г и погрешностью
0,0001 г                                          ГОСТ 24104-2001

Весы лабораторные Metler Р-160 с наибольшим
пределом взвешивания до 160 г и пределом
допустимой погрешности 0,005 г                    ГОСТ 24104-2001

Набор гирь                                        ГОСТ 7328-2001
Колбы мерные вместимостью 2-100-2; 2-1000-2       ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2;
1-2-2-5; 1-2-2-10                                 ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной
пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2                     ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500;
1-1000                                            ГОСТ 1770-74
Микрошприц МШ-1А                                  ТУ 64-1-2850

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт дифеноконазола
(CAS 119446-68-3) с содержанием основного
вещества 99,1% (Сингента, Швейцария)
Ацетон квалификации ч д а.                        ГОСТ 2603-79
Вода дистиллированная или деионизированная        ГОСТ 6709-72
н-Гексан квалификации хч                          ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый квалификации хч                  ГОСТ 4221-76
Калия перманганат квалификации хч                 ГОСТ 20490-75
Кислота серная квалификации хч                    ГОСТ 4204-77
Натрия сульфат безводный квалификации хч          ГОСТ 4166-76
Эфир диэтиловый квалификации хч                   ТУ 2600-001-45682126-06

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный (баллон) квалификации осч       ГОСТ 9293-74
Ванна ультразвуковая, модель D-50,
фирма Branson Instr. Co. (США)
Гомогенизатор "Omni-mixer" (Sorvall, США)
или гомогенизатор                                 МРТУ 42-1505
Дистиллятор Cyclon III, мод. 4 BD
(Fistreem, Великобритания)
Установка Elgastat В 114 с патроном Elgacan
В 114 для получения деионизированной воды
(Elga, Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100 куб. см      ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные                   ГОСТ 25336-82
Воронка Бюхнера                                   ГОСТ 9147-80
Колба Бунзена                                     ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10,
25 и 100 куб. см                                  ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая капиллярная
кварцевая ZB-1 (типа SE-30), длина 25 м,
внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки
0,5 мкм, фирма "Phenomenex" (США),
или аналогичная
Колонка хроматографическая стеклянная
длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм
Патроны концентрирующие Диапак-диол
(0,6 г) /ЗАО "БиоХимМак СТ", Москва/              ТУ 4215-001-05451931-94
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М
или ротационный вакуумный испаритель
В-169 фирмы Buchi (Швейцария)                     ТУ 25-11-917-76
Силикагель 60 (0,063 - 0,20 мм) для колоночной
хроматографии (Мерк, Германия)
Стаканы химические вместимостью                   ГОСТ 25336-82
100 и 500 куб. см
Стекловата
Установка для перегонки растворителей с           ГОСТ 9737-93
дефлегматором                                     (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные "красная лента" обеззоленные     ТУ 6-09-2678-77
Центрифуга J2-21 (Beckman, США) или
аналогичная
Шприц медицинский с разъемом Льюера
вместимостью 20 куб. см                           ГОСТ 22090.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 3.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия выполнения измерений

6.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

6.2. Условия хроматографического анализа:

    Температура термостата испарителя    265 °С;
    Температура детектора                300 °С.

Режим программирования температуры колонки:

начальная температура 200 °С (2 мин.), скорость подъема температуры до 275 °С (7 мин.) 20 °С/мин.;

от 275 °С до 290 °С (5 мин.), скорость подъема температуры 10 °С/мин.

Расход газов:

газа-носителя (азот) 2,5 куб. см/мин.;

поддувочного газа через детектор 25 куб. см/мин.

Деление потока: 1:1.

Время удерживания дифеноконазола: (8,5 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования: (0,02 - 0,25) нг.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка ацетона

    Ацетон  перегоняют над  перманганатом  калия и  поташом (на 1 л ацетона
10 г KMnO  и 2 г K CO ).
         4        2  3

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона, высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 5 - 6 ч и затем активируют при температуре 130 °С в течение 5 ч.

7.2. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.3. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему) и 6 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой из фракций определяют объем смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида с колонки.

7.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из патрона Диапак-диол

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон Диапак-диол, подготовленный по п. 8.3. Промывают патрон 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 20 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 3 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой из фракций определяют объем смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из патрона.

7.6. Приготовление градуировочных растворов

7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г дифеноконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Градуировочный раствор дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение месяца.

7.6.3. Градуировочные растворы дифеноконазола с массовой концентрацией (0,02 - 0,2) мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 8.6.2), доводят до метки смесью гексан - ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.7. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от массовой концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м градуировочным растворам (п. 7.6.3).

В испаритель (инжектор) хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют при условиях п. 6.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

7.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

                               |S    - S  |
                                 изм    гр
                               ------------ х 100 <= К  ,
                                    S                 гр
                                     гр

    где:
    S   ,  S    -  значение  площади  пика  дифеноконазола  в  образце  для
     изм    гр
контроля,   измеренное   и   найденное   по  градуировочной  характеристике
соответственно, усл. ед.;
    К   - норматив контроля;
     гр

К = 0,5 х дельта,

где +/- дельта - граница относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

8. Отбор, подготовка и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979) и правилами, определенными ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ" и ГОСТ 25892-83 "Сок виноградный. ТУ".

Пробы ягод хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре (-18) °С до анализа. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом ягоды измельчают.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция дифеноконазола

9.1.1. Ягоды. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Гомогенат переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин. при 5000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в химический стакан, а осадок в центрифужной пробирке промывают 50 куб. см ацетона и суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу. Экстракт и промывную жидкость объединяют, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 30 куб. см дистиллированной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С до водной фазы, которую переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Сок. Навеску (10 г) свежевыжатого виноградного сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 60 кв. см дистиллированной воды, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстрактам, полученным по п. п. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенным в делительные воронки, приливают по 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему) и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Далее проводят очистку по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,4 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,6 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и окончательную очистку экстрактов проводят по п. 9.4.

9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.3). Патрон промывают 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 8 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток экстрактов сока и ягод растворяют соответственно в 2,5 и 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10.

10. Выполнение измерений

10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1 - 9.4), анализируют при условиях (п. 6.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца ягод и сока повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.4, 10.1.

11. Обработка результатов измерений

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Массовую долю дифеноконазола X (мг/кг) в образцах ягод и сока рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                                 S  х А х V
                                  1
                            X = ------------ х Р,
                                100 х S  х m
                                       0

    где:
    S  - площадь пика дифеноконазола в образце, мВ х с;
     1
    S  - площадь пика дифеноконазола в градуировочном растворе, мВ х с;
     0
    А  -  массовая  концентрация  градуировочного  раствора дифеноконазола,
мкг/куб. см;
    V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
    m  - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта,
использованной   для   очистки   на  колонке  с  силикагелем  и  патроне  и
последующего хроматографического определения, г;
    Р - содержание дифеноконазола в аналитическом стандарте, %.

12. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                            2 х |X  - X | х 100
                                  1    2
                            ------------------ <= r,                    (1)
                                 (X  + X )
                                   1    2

    где:
    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2
    r  - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма .
                                                                         r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

          _
         (X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг (куб. дм), при вероятности Р = 0,95,

    где:
    _
    X   -   среднее   арифметическое  результатов  определений,  признанных
приемлемыми, мг/кг (куб. дм);
    ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);

ДЕЛЬТА = дельта х X / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,02 мг/кг для ягод винограда <*>.

менее 0,01 мг/кг для виноградного сока <**>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для ягод.

<**> 0,01 мг/кг - предел обнаружения для сока.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал дифеноконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания дифеноконазола учитывают разбавление.

14. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

    Величина добавки С  должна удовлетворять условию:
                      д

                       С  = ДЕЛЬТА    + ДЕЛЬТА    ,
                        д           _           _
                                  л,X         л,X'

    где +/- ДЕЛЬТА    (+/- ДЕЛЬТА    )   -    характеристика    погрешности
                    _              _
                  л,X            л,X'
(абсолютная погрешность)  результатов  анализа,  соответствующая содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания  компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг (куб. дм), при этом:

                        ДЕЛЬТА  = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
                              л

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);

ДЕЛЬТА = дельта х X / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

    Результат контроля процедуры К  рассчитывают по формуле:
                                  к

                                  _    _
                             К  = X' - X - С  ,
                              к             д

        _   _
    где X', X, С  - среднее    арифметическое   результатов    параллельных
                д
определений   (признанных  приемлемыми  по  п.  12)  содержания  компонента
в  образце   с   добавкой,   испытуемом   образце,   концентрация   добавки
соответственно, мг/кг (куб. дм).
    Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                              _____________________
                             /     2            2
                       К = \/ДЕЛЬТА     + ДЕЛЬТА   .
                                     _            _
                                   л,X'         л,X

    Проводят  сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
                                                            к
контроля (К).
    Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                              |К | <= К,                                (2)
                                к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                           2 х |X  - X | х 100
                                  1    2
                           ------------------- <= R,                    (3)
                                (X  + X )
                                  1    2

    где:
    X ,  X   - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг (куб.
     1    2
дм);
    R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,

табл. 1), %.

Приложение

Таблица

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦАХ (n = 5)

------------+----------------+-----------------+------------------
¦  Матрица  ¦    Внесено     ¦     Открыто     ¦  Доверительный  ¦
¦           ¦дифеноконазола, ¦дифеноконазола, %¦интервал среднего¦
¦           ¦     мг/кг      ¦                 ¦  результата, %  ¦
+-----------+----------------+-----------------+-----------------+
¦Ягоды      ¦0,02            ¦84,6             ¦+/- 2,7          ¦
¦винограда  +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,04            ¦88,6             ¦+/- 2,3          ¦
¦           +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,10            ¦89,2             ¦+/- 2,2          ¦
¦           +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,20            ¦92,0             ¦+/- 2,0          ¦
+-----------+----------------+-----------------+-----------------+
¦Виноградный¦0,01            ¦89,0             ¦+/- 4,0          ¦
¦сок        +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,02            ¦90,2             ¦+/- 3,2          ¦
¦           +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,05            ¦90,8             ¦+/- 2,6          ¦
¦           +----------------+-----------------+-----------------+
¦           ¦0,10            ¦91,6             ¦+/- 2,0          ¦
------------+----------------+-----------------+------------------

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: