МУК 4.1.2786-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 ноября 2010 года

Дата введения:
с момента утверждения

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Общие положения

Свидетельство об аттестации методики N 0037.16.07.10 от 19.07.2010.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств дифеноконазола в семенах рапса в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг, в зеленой массе и масле рапса в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Дифеноконазол.

Название вещества по ИЮПАК: 4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил]фенила.

Структурная формула (не приводится).

    C  H  Cl N O .
     19 17  2 3 3
    Мол. масса: 406,3.
    Кристаллическое   вещество   от   белого   до   светло-бежевого  цвета.
                                                                    -5
Температура  плавления:  78,6 °С. Давление паров при 25 °С: 3,3 х 10   мПа.
Коэффициент  распределения  н-октанол/вода: K   log Р = 4,20. Растворимость
                                             ow
(г/куб. дм) при 25 °С: этанол - 330, ацетон - 610, толуол - 490, н-гексан -
< 3,4, н-октанол - 95, вода - 0,015.
    Вещество  устойчиво  к гидролизу и фотолизу (при естественном солнечном
свете DT   = 145 дней).
        50
    Дифеноконазол быстро сорбируется почвой и медленно разрушается.
    Краткая токсикологическая характеристика
    Острая  пероральная  токсичность  (LD  ) для крыс - 1453, для мышей - >
                                         50
2000  мг/кг;  острая  дермальная  токсичность  (LD  ) для кроликов - > 2010
                                                  50
мг/кг;  острая ингаляционная токсичность (LC  ) для крыс - > 3300 мг/куб. м
                                            50
воздуха.  LC   для рыб 0,8 - 1,2 мг/куб. дм (96 ч). Фунгицид нетоксичен для
            50
птиц, пчел и дождевых червей.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в свекле сахарной, яблоках и грушах - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля.

Область применения препарата

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Применяется в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян сахарной свеклы, зерновых колосовых культур и рапса при норме расхода 45 - 60 г д.в./т семян, а также используется для обработки вегетирующих растений сахарной и столовой свеклы, картофеля, моркови и рапса, яблоневых и грушевых садов с нормой расхода до 100 г д.в./га.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

--------------+-------------+-------------+--------------+--------+--------
¦Анализируемый¦  Диапазон   ¦ Показатель  ¦ Стандартное  ¦Предел  ¦Предел ¦
¦   объект    ¦определяемых ¦  точности   ¦  отклонение  ¦повторя-¦воспро-¦
¦             ¦концентраций,¦  (граница   ¦повторяемости,¦емости, ¦изводи-¦
¦             ¦    мг/кг    ¦относительной¦  сигма , %   ¦r, %    ¦мости, ¦
¦             ¦             ¦погрешности),¦       r      ¦        ¦R, %   ¦
¦             ¦             ¦ +/- дельта, ¦              ¦        ¦       ¦
¦             ¦             ¦ %, Р = 0,95 ¦              ¦        ¦       ¦
+-------------+-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦Зеленая масса¦от 0,05 до   ¦50           ¦1,9           ¦5       ¦6      ¦
¦             ¦0,1 вкл.     ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
¦             +-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦             ¦более 0,1 до ¦25           ¦2,5           ¦7       ¦8      ¦
¦             ¦0,5          ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
+-------------+-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦Семена       ¦от 0,02 до   ¦50           ¦3,2           ¦9       ¦11     ¦
¦             ¦0,1 вкл.     ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
¦             +-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦             ¦более 0,1 до ¦25           ¦2,6           ¦7       ¦9      ¦
¦             ¦0,2          ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
+-------------+-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦Масло        ¦от 0,05 до   ¦50           ¦2,2           ¦6       ¦7      ¦
¦             ¦0,1 вкл.     ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
¦             +-------------+-------------+--------------+--------+-------+
¦             ¦более 0,1 до ¦25           ¦2,3           ¦6       ¦8      ¦
¦             ¦0,5          ¦             ¦              ¦        ¦       ¦
--------------+-------------+-------------+--------------+--------+--------

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

--------------+------------------------------------------------------------
¦Анализируемый¦        Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20        ¦
¦   объект    +-------+-------------+-----------+-----------+-------------+
¦             ¦Предел ¦  Диапазон   ¦  Полнота  ¦Стандартное¦Доверительный¦
¦             ¦обнару-¦определяемых ¦извлечения ¦отклонение,¦  интервал   ¦
¦             ¦жения, ¦концентраций,¦вещества, %¦   S, %    ¦  среднего   ¦
¦             ¦мг/кг  ¦    мг/кг    ¦           ¦           ¦ результата, ¦
¦             ¦       ¦             ¦           ¦           ¦   +/-, %    ¦
+-------------+-------+-------------+-----------+-----------+-------------+
¦Зеленая масса¦0,05   ¦0,05 - 0,5   ¦85,3       ¦2,9        ¦+/- 2,7      ¦
+-------------+-------+-------------+-----------+-----------+-------------+
¦Семена       ¦0,02   ¦0,02 - 0,2   ¦85,5       ¦3,1        ¦+/- 2,9      ¦
+-------------+-------+-------------+-----------+-----------+-------------+
¦Масло        ¦0,05   ¦0,05 - 0,5   ¦84,7       ¦2,9        ¦+/- 2,7      ¦
--------------+-------+-------------+-----------+-----------+--------------

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль дифеноконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян водным метанолом и из масла ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ЭЗД          номер Госреестра
(СКБ "Хроматэк", Россия)                            N 14516-95
Весы аналитические Sartorius 6110 с наибольшим
пределом взвешивания до 110 г и пределом
допустимой погрешности 0,0001 г                     ГОСТ 24104-2001

Весы лабораторные Meteer P-160 с наибольшим
пределом взвешивания до 160 г и пределом
допустимой погрешности 0,005 г                      ГОСТ 24104-2001

Набор гирь                                          ГОСТ 7328-2001
Колбы мерные вместимостью 2-100-2; 2-1000-2         ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5;
1-2-2-10                                            ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой
П-2-5-0,1; П-2-10-0,2                               ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000    ГОСТ 1770-74
Микрошприц МШ-1А                                    ТУ 64-1-2850

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт дифеноконазола (CAS
119446-68-3) с содержанием основного вещества
99,5% (Сингента, Швейцария)
Ацетон квалификации чда                             ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил квалификации хч                         ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная или деионизированная          ГОСТ 6709-72
н-Гексан квалификации хч                            ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый квалификации хч                    ГОСТ 4221-76
Калия перманганат квалификации хч                   ГОСТ 20490-75
Кислота серная квалификации хч                      ГОСТ 4204-77
Натрия сульфат безводный квалификации хч            ГОСТ 4166-76
Спирт метиловый (метанол) квалификации хч           ГОСТ 6995-77
Эфир диэтиловый квалификации хч                     ТУ 2600-001-45682126-06

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный (баллон) квалификации осч         ГОСТ 9293-74
Аппарат для встряхивания проб АВУ-1                 ТУ 64-1-1081-73
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson
Instr. Co. (США)
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая
нестерильная                                        ГОСТ 5556-81
Гомогенизатор "Omni-mixer" (Sorvall, США) или
гомогенизатор                                       МРТУ 42-1505
Дистиллятор Cyclon III, мод. 4 BD (Fistreem,
Великобритания)
Установка Elgastat B 114 с патроном Elgacan B
114 для получения деионизированной воды (Elga,
Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100 куб. см        ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные                     ГОСТ 25336-82
Воронка Бюхнера                                     ГОСТ 9147-80
Колба Бунзена                                       ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см         ГОСТ 9737-93
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25
и 100 куб. см                                       ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая капиллярная
кварцевая ZB-1 (типа SE-30), длина 15 м,
внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5
мкм, фирма Phenomenex (США), или аналогичная
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25
см, внутренним диаметром 8 - 10 мм
Мельница лабораторная электрическая                 ТУ 46-22-236-84
Патроны концентрирующие Диапак-диол (0,6 г)
/ЗАО "БиоХимМак СТ", Москва/                        ТУ 4215-001-05451931-94
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М
или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы
Buchi (Швейцария)                                   ТУ 25-11-917-76
Силикагель (60 - 80 меш) для адсорбционной
хроматографии (Вельм, Германия) I степени
активности
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см   ГОСТ 25336-82
Стекловата
Установка для перегонки растворителей с             ГОСТ 9737-93
дефлегматором                                       (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные "красная лента" обеззоленные       ТУ 6-09-2678-77
Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью
20 куб. см                                          ГОСТ 22090.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 3.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия выполнения измерений

6.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

6.2. Условия хроматографического анализа

Температура термостата испарителя 275 °С;

Температура детектора 320 °С.

Режим программирования температуры колонки:

начальная температура 200 °С (2 мин.), скорость подъема температуры до 270 °С (0 мин.) 20 °С/мин.;

от 270 до 280 °С (10 мин.), скорость подъема температуры 5 °С/мин.

Расход газов:

газа-носителя (азот) 2,5 куб. см/мин.;

поддувочного газа через детектор 25 куб. см/мин.

Деление потока: 1:1.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Время удерживания дифеноконазола: 8 мин. 20 с +/- 2%.

Линейный диапазон детектирования: (0,02 - 0,4) нг.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка ацетона

    Ацетон  перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10
г KMnO  и 2 г K CO ).
      4        2  3

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объема ацетона, высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 5 - 6 часов и затем активируют при температуре 130 °С в течение 5 часов.

7.2. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.3. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см ацетона и 6 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

7.4. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида с колонки.

7.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из патрона Диапак-диол

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон Диапак-диол, подготовленный по п. 7.3. Промывают патрон 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 20 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из патрона.

7.6. Приготовление градуировочных растворов

7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г дифеноконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Градуировочный раствор дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение месяца.

7.6.3. Градуировочные растворы дифеноконазола с массовой концентрацией (0,02 - 0,2) мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки смесью гексан - ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.7. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м градуировочным растворам (п. 7.6.3).

В испаритель (инжектор) хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют при условиях п. 6.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

7.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

                          S    - S
                           изм    гр
                          ---------- х 100 <= К  ,
                             S                 гр
                              гр

    где:
    S     и  S    -  значение  площади  пика  дифеноконазола  в образце для
     изм      гр
контроля,   измеренное   и   найденное   по  градуировочной  характеристике
соответственно, усл. ед.;
    К   - норматив контроля, К   = 0,5 ДЕЛЬТА, где:
     гр                       гр
    +/- дельта - границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

8. Отбор, подготовка и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре (-18) °С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция дифеноконазола

9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон - вода (8:2, по объему) и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон - вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/10 объема экстракта (эквивалентную 2 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 20 куб. см дистиллированной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 70 куб. см смеси метанол - вода (8:2, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см смеси метанол - вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, куда приливают 20 куб. см гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин. и после разделения фаз гексановую фракцию отбрасывают, а водно-метанольную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см ацетонитрила, перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в химический стакан через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 25 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила. Измеряют объем объединенного ацетонитрильного экстракта и 2/5 его части (эквивалентные 2 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, куда приливают 15 куб. см гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин. и после разделения фаз ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.3.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (5 - 10 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 20 куб. см дистиллированной воды, содержимое перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 9.1.3 и 9.2, растворяют в 0,6 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 25 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток экстрактов зеленой массы и семян растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10. Экстракт масла дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона Диапак-диол.

9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта масла в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.2). Патрон промывают 2,5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 9 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10.

10. Выполнение измерений

10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1 - 9.4), анализируют при условиях (п. 6.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца зеленой массы, семян и масла повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.4, 10.1.

11. Обработка результатов измерений

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание дифеноконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                               Н  х А х V
                                1
                           Х = ------------ х Р,
                               100 х Н  х m
                                      0

    где:
    Х - содержание дифеноконазола в пробе, мг/кг;
    Н  - площадь пика образца, мВ х с;
     1
    Н  - площадь пика стандарта, мВ х с;
     0
    А - концентрация стандартного раствора дифеноконазола, мкг/куб. см;
    V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
    m  - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта,
использованной   для   очистки   на  колонке  с  силикагелем  и  патроне  и
последующего хроматографического определения, г.
    Р - содержание дифеноконазола в аналитическом стандарте, %.

12. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                         2 х |Х  - Х | х 100
                               1    2
                         ------------------- <= r,                      (1)
                              (Х  + Х )
                                1    2

    где:
    Х , Х  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2
    r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма .
                                                                        r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

         _
        (Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг (куб. дм), при вероятности Р = 0,95,

    где:
    _
    Х   -   среднее   арифметическое  результатов  определений,  признанных
приемлемыми, мг/кг (куб. дм);
    ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);

ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,02 мг/кг для семян рапса <*>;

менее 0,05 мг/кг для зеленой массы и масла рапса <**>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для семян.

<**> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для зеленой массы и масла.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал дифеноконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания дифеноконазола учитывают разбавление.

14. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

    Величина добавки С  должна удовлетворять условию:
                      д

                       С  = ДЕЛЬТА  _ + ДЕЛЬТА  _ ,
                        д         л,Х         л,Х'

    где   +/-  ДЕЛЬТА  _  (+/-  ДЕЛЬТА  _ )  -  характеристика  погрешности
                     л,Х              л,Х'
(абсолютная погрешность) результатов  анализа,  соответствующая  содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания  компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг (куб. дм), при этом:

                        ДЕЛЬТА  = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
                              л

    где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);

                        ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

    дельта   -   граница  относительной  погрешности  методики  (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
    Результат контроля процедуры К  рассчитывают по формуле:
                                  к

                                 _    _
                            К  = Х' - Х - С ,
                             к             д

          _    _
    где   Х',  Х,  С  -  среднее  арифметическое  результатов  параллельных
                    д
определений (признанных приемлемыми  по  п.  12)  содержания  компонента  в
образце   с   добавкой,   испытуемом    образце,    концентрация    добавки
соответственно, мг/кг (куб. дм).
    Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                              _____________________
                             /     2            2
                       К = \/ДЕЛЬТА  _  + ДЕЛЬТА  _.
                                   л,Х'         л,Х

    Проводят  сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
                                                            к
контроля (К).
    Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                                |К | <= К,                              (2)
                                  к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                         2 х |Х  - Х | х 100
                               1    2
                         ------------------- <= R,                      (3)
                              (Х  + Х )
                                1    2

    где:
    Х ,  Х   - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг (куб.
     1    2
дм);
    R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,

табл. 1), %.

Приложение

Таблица

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦАХ (n = 5)

--------------+----------------+---------------+------------------
¦   Матрица   ¦    Внесено     ¦    Открыто    ¦  Доверительный  ¦
¦             ¦дифеноконазола, ¦дифеноконазола,¦интервал среднего¦
¦             ¦     мг/кг      ¦       %       ¦  результата, %  ¦
+-------------+----------------+---------------+-----------------+
¦Зеленая масса¦0,05            ¦83,4           ¦+/- 3,7          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,10            ¦84,6           ¦+/- 2,5          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,25            ¦85,6           ¦+/- 2,3          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,50            ¦87,6           ¦+/- 2,1          ¦
+-------------+----------------+---------------+-----------------+
¦Семена       ¦0,02            ¦84,0           ¦+/- 3,7          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,04            ¦84,4           ¦+/- 3,0          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,10            ¦85,4           ¦+/- 2,5          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,20            ¦88,2           ¦+/- 2,2          ¦
+-------------+----------------+---------------+-----------------+
¦Масло        ¦0,05            ¦82,8           ¦+/- 2,7          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,10            ¦83,6           ¦+/- 2,5          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,25            ¦85,4           ¦+/- 2,2          ¦
¦             +----------------+---------------+-----------------+
¦             ¦0,50            ¦87,0           ¦+/- 2,3          ¦
--------------+----------------+---------------+------------------

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: