МУ 1.2.2741-10. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
23 сентября 2010 года

1. Авторский коллектив: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт питания РАМН; Государственное учебно-научное учреждение Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН; Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы" (ФГУП ВНИИМС); Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха (ИНБИ РАН); Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН; ООО "Интерлаб". Разработаны в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2010 гг.".

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 23 сентября 2010 г.

3. Введены в действие с 10 октября 2010 г.

4. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают требования к методам отбора от лабораторных животных проб биологических материалов, предназначенных для определения абиогенных (техногенных) и биогенных наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения с учетом данных о путях поступления наноматериалов в организм и предполагаемых органах, в которых может происходить их накопление.

1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются в ходе проведения исследований по оценке безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с воздействием наночастиц и наноматериалов на организм человека.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства методов и средств отбора проб в ходе оценки безопасности наноматериалов и нанотехнологий для состояния здоровья человека и компонентов естественных биоценозов.

1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов.

II. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2.2. Федеральный закон от 2 января 2000 г. N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов".

2.3. Федеральный закон от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений".

2.4. Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании".

2.5. Федеральный закон от 10 января 2002 г. N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды".

2.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 987 "О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов".

2.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 988 "О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий".

2.8. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".

2.9. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных".

2.10. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении Правил лабораторной практики".

2.11. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации и Главного государственного инспектора Российской Федерации по охране природы от 10.11.1997 N 25 и от 10.11.1997 N 03-19/24-3483 "Об использовании методологии оценки риска для управления качеством окружающей среды и здоровья населения в Российской Федерации".

2.12. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы".

2.13. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов".

2.14. СП 2.2.2.1327-03 "Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту".

2.15. СанПиН 2.1.7.1322-03 "Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления".

2.16. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".

2.17. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2.18. Методические указания МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

2.19. Методические рекомендации МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo".

2.20. Методические рекомендации МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека".

2.21. Методические рекомендации МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах".

2.22. Методические указания МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

2.23. Методические указания МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории".

2.24. Руководство Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха помещений".

2.25. ГОСТ 8.207-76 "Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения".

2.26. ГОСТ 26678-85 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".

2.27. ГОСТ 3-88 "Перчатки хирургические резиновые. Технические условия".

2.28. ГОСТ 20015-88 "Хлороформ. Технические условия".

2.29. ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректифицированный из пищевого сырья. Технические условия".

2.30. ГОСТ 21241-89 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

2.31. ГОСТ 21239-93 "Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний".

2.32. ГОСТ 30393-95 "Инструменты хирургические. Скальпели со съемными лезвиями. Присоединительные размеры".

2.33. ГОСТ 24104-2001 "Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия".

2.34. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

2.35. ГОСТ 1770-74 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия".

2.36. ГОСТ 9293-74 "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

2.37. ГОСТ 12.2.003-91 "Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности".

2.38. ГОСТ 12.2.052-81 "Система стандартов безопасности труда. Оборудование, работающее с газообразным кислородом. Общие требования безопасности".

2.39. ГОСТ 12.1.004-91 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2.40. ГОСТ 4233-77 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

2.41. ОСТ 11-029.003-80 "Изделия электронной техники. Вода, применяемая в производстве. Марки, технические требования, методы очистки и контроля".

2.42. ГОСТ 5833-75 "Реактивы. Сахароза. Технические условия".

2.43. ГОСТ 4198-75 "Реактивы. Калий фосфорно-кислый однозамещенный. Технические условия".

2.44. ГОСТ 2493-75 "Реактивы. Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный. Технические условия".

2.45. ГОСТ 6259-75 "Реактивы. Глицерин. Технические условия".

2.46. ГОСТ 4172-76 "Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный. Технические условия".

2.47. ГОСТ 1625-89 "Формалин технический. Технические условия".

2.48. ГОСТ 4517-87 "Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе".

2.49. ГОСТ Р 50444-92 "Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия".

2.50. ГОСТ Р 51350-99 "Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 1. Общие требования".

2.51. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

III. Общие положения

3.1. Цель и назначение пробоотбора

3.1.1. Целью отбора проб является получение представительной и усредненной пробы, которая наиболее полно позволит выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы, введенные лабораторным животным, в составе их органов и тканей, а также в выделениях (экскретах) в ходе проведения исследований по токсиколого-гигиенической характеристике наночастиц или наноматериалов.

3.1.2. Назначение процедуры отбора проб заключается в отборе для заданной цели тех органов, тканей и иных биологических материалов, которые наиболее пригодны для анализа и в которых с наибольшей вероятностью можно выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы.

3.1.3. Биологические образцы, полученные от животных, которым по условиям эксперимента были введены наночастицы (наноматериалы), могут содержать эти наночастицы (наноматериалы) и поэтому должны рассматриваться как объекты, обладающие повышенной биологической опасностью. Особенности процедур отбора проб должны обеспечивать снижение риска воздействия наночастиц и наноматериалов, а также инфицированных микроорганизмами образцов на персонал организаций (лабораторий), проводящих отбор проб и последующие исследования биологических показателей, а также на население и окружающую среду до приемлемого уровня.

3.2. Требования к организации, осуществляющей отбор проб

3.2.1. Организации, осуществляющие отбор проб, должны быть уполномочены в установленном порядке на право проведения медико-биологических исследований на лабораторных животных и обладать системой контроля качества, обеспечить независимость и прозрачность процедуры пробоотбора.

3.2.2. Организации, осуществляющие отбор проб, должны быть оснащены необходимым оборудованием, в т.ч. средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке.

3.2.3. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) средств измерений и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

Персонал, проводящий отбор проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должен иметь профессиональную подготовку в области работы с лабораторными животными и пройти инструктаж по вопросам техники безопасности и методам преодоления последствий возможных нештатных ситуаций.

3.3. Перечень объектов и материалов, подлежащих пробоотбору

3.3.1. Для выявления и идентификации биогенных наноматериалов в лабораторных животных проводят отбор следующих биологических материалов:

- соскобы со слизистых оболочек, отделяемое эрозивно-язвенных элементов, соскобы с конъюнктивы и т.д.;

- мазки, смывы (из носоглотки, зева и т.д.);

- мокрота, бронхоальвеолярный лаваж;

- кровь, плазма, сыворотка крови;

- моча, различные биологические жидкости (лимфа, слюна, желчь, слезная жидкость, молоко);

- фекалии;

- биоптаты (кусочки тканей и органов).

Перечень биологических материалов, отбираемых с целью определения наночастиц и наноматериалов, может изменяться по указанию организации, проводящей анализ наноматериалов в образцах, в зависимости от предполагаемой локализации исследуемого наноматериала в организме и используемых методов анализа.

3.3.2. Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация исследуемого наноматериала в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, которые могут вызвать искажение результатов проводимых анализов.

3.3.3. Методы, применяемые при отборе проб биологических материалов, их консервации, транспортировании и хранении, должны исключать или сводить к минимуму возможные изменения физико-химического состояния наночастиц и наноматериалов, присутствующих в образцах.

3.3.4. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся), в связи с чем ее собирают в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА.

Важно: гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя, т.к. он является ингибитором ПЦР!

3.4. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики

3.4.1. В процессе отбора проб для характеристики действия наноматериалов в лабораторных животных необходимо руководствоваться правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями Приказа Минздрава России от 19 июня 2003 г. N 267.

3.4.2. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики обеспечивает:

- надлежащее качество процедуры пробоотбора;

- документальное сопровождение всех этапов пробоотбора;

- совместимость различных методов пробоотбора между собой и отсутствие неконтролируемых влияний процедур пробоотбора на количество и физико-химическое состояние определяемых наноматериалов;

- репрезентативность отбираемых проб;

- гуманное обращение с лабораторными животными.

3.4.3. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики применительно к процедурам отбора биологических образцов включает:

- назначение руководителем организации лиц, ответственных за мониторинг качества и репрезентативности отбираемого биологического материала (из числа сотрудников, не участвующих в исследовании);

- систему регистрации отбираемых образцов, их хранение и транспортирование в условиях, исключающих возможность порчи, изменения физико-химических свойств анализируемых наноматериалов;

- наличие и соблюдение стандартных операционных процедур (СОП) на все производственные операции, включая: составление списка (перечня) отбираемых проб, отбор, идентификацию, маркировку, предварительную обработку проб, использование и хранение исследуемых веществ; обслуживание и градуировку средств измерения (весов, пипеток, дозаторов), применяемых при пробоотборе; приготовление реактивов, кормов; протоколирование отбора проб; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию биологических образцов (если это необходимо); ликвидацию последствий нештатных ситуаций;

- наличие средств измерений, прошедших поверку (калибровку) в установленном порядке;

- эксплуатацию оборудования в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению, регулярную фиксацию результатов поверки средств измерений и текущего ремонта оборудования в специальном журнале;

- наличие помещения для лабораторных животных (вивария), обеспечивающего изоляцию (карантин) поступающих животных, больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций; позволяющего осуществлять раздельное содержание различных видов животных и животных одного вида, которым были введены различные наноматериалы; соответствующего санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям;

- наличие отдельных помещений, инвентаря и оборудования для приготовления кормов для лабораторных животных, а также для работы с опасными для здоровья и жизни человека объектами исследования, соответствующих установленным санитарно-эпидемиологическим требованиям.

3.5. Соблюдение мер конфиденциальности

3.5.1. Сотрудники, принимающие участие в процессе отбора проб для выявления наноматериалов в лабораторных животных, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе процедуры отбора проб, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.5.2. Организация, уполномоченная на проведение пробоотбора для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должна обеспечить конфиденциальность полученных в ходе пробоотбора данных и результатов в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.6. Организация защиты проб от несанкционированных внешних воздействий

3.6.1. Организация, уполномоченная на проведение пробоотбора для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должна обеспечить их защиту от несанкционированных внешних воздействий.

3.6.2. Контейнер с пробой необходимо запечатать либо упаковать в сейф-пакет, опломбировать или опечатать его таким способом, чтобы не допустить несанкционированного вскрытия пробы или чтобы несанкционированное вскрытие легко определялось.

3.7. Ответственность организации, производящей отбор проб

3.7.1. Ответственность за качественный отбор проб, репрезентативность отобранной пробы, оформление документов на пробы и их сохранность, а также за соблюдение правил техники безопасности в процессе отбора проб несут организации, осуществляющие пробоотбор.

3.7.2. Ответственность за сохранность проб и документации на пробы при перевозке, соблюдение правил техники безопасности при перевозке несут организации, осуществляющие перевозку проб.

IV. Технология (процедура) пробоотбора

4.1. Составление плана (схемы) отбора проб

4.1.1. План (схема) отбора проб составляется перед началом исследований и должен включать следующие данные:

- наименование выявляемого наноматериала, оценка его потенциальной опасности согласно МР 1.2.2522-09, свойства наноматериала (согласно данным производителя (поставщика) продукции и (или) литературным данным);

- вид отбираемых проб (исследуемого материала);

- методику отбора проб;

- количество отбираемых проб;

- инструкции по разделению отобранной пробы на части (выделению контрольной пробы при необходимости);

- тип и характеристики тары для отбора проб;

- расшифровку маркировки тары для отбора проб;

- специальные меры предосторожности при работе с наноматериалами, соблюдение стерильности;

- условия хранения и транспортирования проб;

- инструкции по очистке и хранению оборудования для отбора проб, инактивации биоматериалов.

4.2. Протоколирование отбора проб

4.2.1. Процедура отбора проб должна быть запротоколирована по окончании процесса. В протоколе (акте) отбора проб указывают:

- название организации, производившей отбор проб;

- фамилии сотрудников, проводящих отбор проб;

- цель отбора пробы;

- номер пробы;

- наименование отбираемого биологического материала;

- размер образца, единица измерения (объем или масса);

- наименование введенного наноматериала;

- дату введения наноматериала;

- метод отбора пробы;

- метод консервации пробы;

- количество отобранных образцов (реплик пробы), в т.ч. лабораторных, контрольных;

- дату и время отбора проб;

- сведения о нумерации, опломбировании, опечатывании проб;

- наименование лаборатории - получателя пробы;

- перечень анализируемых компонентов в составе проб;

- отметки о дополнительных сопроводительных документах (при необходимости);

- способ отправки проб;

- отметку о месте хранения контрольной пробы (при необходимости);

- подписи сотрудников, осуществляющих отбор проб и их доставку в лабораторию, проводящую анализ наноматериалов.

4.2.2. Протокол (акт) отбора проб составляется в двух экземплярах, один из которых остается в организации, производившей пробоотбор, а другой передается организации, осуществляющей проведение лабораторных исследований.

4.2.3. При отборе однородных серийных проб возможно составление единого протокола (акта) на серию проб (образцов) с обязательным указанием порядка нумерации и общей численности индивидуальных проб.

4.3. Меры по обеспечению репрезентативности пробоотбора

4.3.1. Для медико-биологических исследований достоверными (достаточными) считаются доверительные границы, установленные с вероятностью безошибочного прогноза не менее 95%. При этом вероятность выхода средней величины в генеральной совокупности за пределы доверительных границ будет равна или менее 5%, т.е. уровень значимости - p <= 0,05.

    В  случае  если  тест  проведен  на  N животных, для каждого из которых
определено  значение  исследуемого  фактора  X  (содержания наноматериала в
                                              n
образце),  принимают  гипотезу  о нормальном распределении фактора X. Далее
                                    _      n
рассчитывают  среднее  по  выборке  X  =  SUM X   и несмещенную  выборочную
                                          i=1  i
           2     1    n        _ 2
дисперсию S  = ----- SUM (X  - X) .
               N - 1 i=1   i
    В  этом  случае  вероятность нахождения истинного значения исследуемого
                          _                 S                     S
параметра  X   интервале (X - t          х ---; X + t          х ---) равна
            0                  0,025,N-1     _       0,025,N-1     _
                                           \/N                   \/N
0,95,  где  t          - коэффициент Стьюдента с N - 1 степенью свободы для
             0,025,N-1
квантиля распределения, равного 0,025 (2,5%).
    Таким  образом,  число  экспериментов  N для определения доверительного
интервала  для  истинного  значения  зависит  не только от требуемой ширины
интервала,  но и от выборочной дисперсии для выборки X , которая может быть
                                                      i
установлена опытным путем. Задаваясь величиной доверительного интервала (d)
10%  от  выборочного  среднего  (X), определяют их фактические значения для
выборки  из  10  животных  (N  =  9;  t  =  2,68),  сравнивают  с  заданным
соотношением,  после  чего в случае если d > 0,1X, численность  обследуемой
группы животных увеличивают.

4.3.2. Количество животных, используемых в эксперименте, должно быть минимальным, однако достаточным для получения статистически достоверных результатов. Численность экспериментальной группы животных определяется в соответствии с п. 4.5.1. Для снижения числа животных в группе следует добиваться минимальной дисперсии определяемого показателя, для чего использовать животных высокого качества, свободных от специфических патогенов (SPF) и (применительно к мелким лабораторным животным) принадлежащих к определенной генетической линии.

4.4. Методы гуманной эвтаназии животных

4.4.1. Эвтаназию лабораторных животных проводят в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных". Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных при проведении забоя животных и отбора проб.

4.4.2. Оптимальным и универсальным методом эвтаназии животных является 3-кратная передозировка наркоза. Допускается эвтаназия мелких животных с помощью ингаляционного наркоза (хлороформ или эфир) без предварительного введения других видов анестетиков.

4.4.3. Умерщвление и вскрытие животных проводят в отдельном специально оборудованном помещении (секционной) в пределах клиники лабораторных животных (вивария). Манипуляции с животными должны исключать возможность продолжительных стрессорных воздействий. Следует производить манипуляции с животными таким образом, чтобы этого не могли наблюдать остальные животные.

4.5. Методы препарирования биологического материала для определения биогенных наноматериалов (рекомбинантные вирусы, рекомбинантные вирусные белки, псевдовирусные частицы)

4.5.1. При отборе проб следует использовать следующее основное и вспомогательное лабораторное оборудование:

- ламинарный шкаф биологической безопасности, класс II, с вертикальным восходящим потоком воздуха БОВ-001-АМС ("Миасский завод медицинского оборудования", Россия) или аналогичный;

- облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 по ТУ 16-535-84;

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85;

- морозильная камера, обеспечивающая температуру -20 °С или ниже (фирмы "Vestfrost", Дания, или аналогичная);

- льдогенератор (SD18 фирмы "Simag", Италия, или аналогичный);

- центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. и охлаждением для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 куб. см (5 415 R фирмы "Eppendorf", ФРГ, или аналогичная);

- встряхиватель вибрационный типа "Вортекс" со скоростью вращения до 3000 об./мин. (V3 фирмы "Elmi Ltd", Латвия, или аналогичный);

- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с погрешностью взвешивания не более 0,001 г по ГОСТ 24104-2001;

- твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 куб. см с диапазоном рабочих температур 25 - 100 °С (Термит, "ДНК-Технология", Россия, или аналогичный);

- пластина для манипуляций с мелкими грызунами (мышами) (из пробки или пенопласта);

- хирургический столик для мелких животных (крысы, морские свинки);

- булавки или иглы для фиксации животных на препаровальном столике;

- пинцет медицинский, ГОСТ 21241-89;

- ножницы медицинские по ГОСТ 21239-93;

- скальпель по ГОСТ 30393-95 (возможно использование скальпеля со съемными лезвиями);

- резиновые груши для пипетирования биологического материала;

- дозаторы с переменным объемом дозирования фирмы "Gilson", США:

0,2 - 2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 1,2%;

2 - 20 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%;

1 - 10 куб. см с шагом 0,1 куб. см, с точностью +/- 0,5%;

- дозаторы "Ленпипет" по ТУ 9452-002-33189998-2007:

0,5 - 10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%;

20 - 200 куб. мм с шагом 0,1 куб. мм, с точностью +/- 0,6%;

100 - 1000 куб. мм с шагом 1 куб. мм, с точностью +/- 3%;

- цилиндры стеклянные мерные лабораторные разной вместимости, колбы конические разной вместимости по ГОСТ 1770-74Е;

- сосуды Дьюара по ГОСТ 12.2.003-91, ГОСТ 12.2.052-81, ГОСТ 12.1.004-91, ТУ 26-04-622-88.

Примечание: Для вскрытия желательно использовать два набора инструментов - для разрезания кожи и для взятия кусочков органов.

4.5.2. При отборе проб следует применять следующие реактивы и расходуемые материалы:

- хлороформ по ГОСТ 20015-88;

- диэтиловый эфир (эфир для наркоза стабилизированный) по ТУ 2600-001-43852015-05;

- спирт этиловый ректификованный медицинский по ГОСТ Р 51652-2000;

- азот жидкий по ГОСТ 9293-74;

- изотонический раствор натрия хлорида (0,9 г/л хлористого натрия по ГОСТ 4233-77);

- дистиллированная вода по ОСТ 11-029.003-80;

- транспортная среда для биологических тканей (0,218 М сахароза по ГОСТ 5833-75, 0,0038 М калий фосфорно-кислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, 0,0072 М калий фосфорно-кислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75, 1% БСА по ТУ 6-09-10-342-90);

- глицериновая смесь (2 л изотонического раствора, 1 л глицерина по ГОСТ 6259-75 и 20%-ный раствор фосфорно-кислого натрия двузамещенного по ГОСТ 4172-76, pH довести до 7,8 - 8,0. Стерилизуют при давлении 0,5 атмосфер в течение 15 - 30 мин. После стерилизации pH должен быть 7,8);

- фосфатная буферная смесь: на 1 л дистиллированной воды берут 0,45 г калия фосфорно-кислого однозамещенного по ГОСТ 4198-75 и 5,34 г калия фосфорно-кислого двузамещенного по ГОСТ 2493-75. Стерилизуют при давлении 1 атмосфера в течение 30 мин.;

- транспортная среда ESP, содержащая: саркозил 1% (фирма "Amresco", США, или аналогичный); ЭДТА 0,05 М (фирма "Sigma", США, или аналогичная); свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/куб. см (фирма "Sigma", США, или аналогичная);

- пробирки для микропроб однократного применения типа "Эппендорф" вместимостью 0,5; 1,5 и 2,0 куб. см по ТУ 64-2-300-80;

- криопробирки вместимостью 2,0 куб. см;

- штативы для пробирок;

- наконечники пластиковые объемом 1 - 200 куб. мм и 200 - 1000 куб. мм с фильтром;

- бакпечатки однократного применения по ТУ 64-2-279-79;

- пастеровские пипетки, воронки стеклянные по ГОСТ 25336-82;

- перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3-88;

- термоконтейнеры различной вместимости или медицинская сумка-холодильник;

- сейф-пакеты одноразовые для хранения и транспортирования проб.

4.5.3. Кровь собирают асептически с использованием одноразовых инструментов, у крупных животных (кроликов, собак, птиц и т.д.) путем венопункции, у мелких животных (мышей, крыс) - из кончика хвоста или из сердца, в случае вскрытия животных, в стерильную пробирку (1,5 - 2 куб. см) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!). Плазму получают центрифугированием цельной крови в течение 20 мин. при 3000 об./мин.

Для выявления и идентификации наноматериалов в крови лабораторных животных методом ИФА приготавливают пробы сывороток: кровь отстаивают 0,5 - 1 ч в термостате при температуре 37 °С для формирования фибринового сгустка (не превратившийся в фибрин фибриноген может стать источником ложнопозитивных результатов), затем центрифугируют 10 мин. при 1200 g. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные чистые пробирки (1,5 - 2 куб. см).

Клетки крови (лейкоцитарную фракцию цельной крови, лейкоцитарную пленку) для выявления лейкотропных псевдовирусных наночастиц следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. Лейкоцитарную массу собирают с поверхности осадка клеток и переносят в стерильную пробирку объемом 1,5 - 2,0 куб. см.

4.5.4. Другие жидкости организма (лимфа, спинномозговая жидкость, желчь) отбирают при помощи пункции стерильными иглами либо пастеровскими пипетками в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 - 2,0 куб. см.

4.5.5. Соскобы осуществляют с помощью специальных стерильных одноразовых инструментов - зондов, цитощеток или тампонов, после чего рабочую часть зонда помещают в транспортную среду производителя набора для выделения нуклеиновых кислот. Согласно рекомендациям производителя рабочую часть зонда удаляют из пробирки либо обламывают и оставляют в транспортной среде, плотно закрыв крышку пробирки.

4.5.6. Смывы из носоглотки приготавливают путем введения с помощью одноразового шприца или зонда теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида в носовые ходы. Промывную жидкость собирают в стерильную пробирку.

4.5.7. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда) помещают в стерильную одноразовую пробирку со специальной транспортной средой и аккуратно обламывают, пробирку плотно закрывают крышкой.

4.5.8. Пробу фекалий отбирают отдельным наконечником с фильтром или одноразовыми лопатками, переносят в специальный стерильный флакон или бакпечатку. У мелких животных пробы фекалий отбирают при вскрытии в асептических условиях из толстого отдела кишечника. Из твердых фекалий готовят фекальную суспензию, смешивая 0,8 куб. см фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) с 0,1 г (0,1 куб. см) фекалий и тщательно ресуспендируя на вортексе до образования гомогенной суспензии. Для длительного хранения к суспензии добавляют глицерин до конечной концентрации 10 - 15%.

Для выделения ДНК или РНК используют осветленный экстракт фекалий, который приготавливают из фекалий водянистой консистенции, свежей суспензии фекалий или суспензии, подвергавшейся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе, осветляют путем центрифугирования при 10000 g в течение 5 мин. В стерильную пробирку отбирают супернатант.

4.5.9. Аутопсию лабораторных животных производят в специально оборудованном помещении, которое полностью соответствует санитарно-гигиеническим требованиям к помещениям данного назначения. Все инструменты должны пройти антисептическую обработку в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Стеклянную посуду, соприкасающуюся с пробами, предварительно тщательно моют и стерилизуют одним из следующих способов: насыщенным паром в автоклаве в течение 30 мин. при 120 °С; горячим воздухом в стерилизаторе (сухожаровом шкафу) 30 мин. при 100 °С. Допускается стерилизация инструментов погружением в этиловый спирт. Для обеззараживания рук и рабочих поверхностей необходимо использовать латексные перчатки и 70%-ный этиловый спирт - ректификат. Одноразовая пластиковая стерильная посуда в неповрежденной упаковке дополнительной стерилизации не требует.

Кусочки тканей или органов отбирают методом биопсии либо при вскрытии животных стерильными инструментами. Предпочтительно использование одноразовых инструментов; многоразовые хирургические инструменты освобождают от загрязнения следами нуклеиновых кислот путем обеззараживания автоклавированием (132 +/- 2 °С, 0,2 МПа, 60 мин.) или кипячением (100 °С, 30 мин.). Необходимость отбора проб каждого из органов определяют по предположительной локализации исследуемого наноматериала.

Отобранные образцы тканей и органов помещают в стерильные пробирки или флаконы с транспортной средой согласно рекомендациям фирм-изготовителей наборов для определения нуклеиновых кислот. Возможно также использование охлажденного изотонического раствора хлорида натрия либо замораживание проб в жидком азоте.

Отбор проб необходимо производить начиная с контрольной группы животных во избежание контаминации проб исследуемой ДНК (РНК) от опытной группы животных.

4.6. Методы препарирования биологического материала для определения наночастиц неорганического происхождения

4.6.1. При отборе проб следует использовать следующее основное и вспомогательное лабораторное оборудование:

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85;

- морозильная камера, обеспечивающая температуру -200 °С или ниже (фирма "Vestfrost", Дания, или аналогичная);

- льдогенератор (SD18, фирма "Simag", Италия, или аналогичный);

- центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. и охлаждением для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 куб. см (5 415 R, фирма "Eppendorf", ФРГ, или аналогичная);

- встряхиватель вибрационный типа "Вортекс" со скоростью вращения до 3000 об./мин. (V3, фирма "Elmi Ltd", Латвия, или аналогичный);

- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с погрешностью взвешивания не более 0,001 г по ГОСТ 24104-2001;

- твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 куб. см с диапазоном рабочих температур 25 - 100 °С (Термит, "ДНК-Технология", Россия, или аналогичный);

- pH-метр по ГОСТ 27987-88 или аналогичный;

- пластина для манипуляций с мелкими грызунами (мышами) (из пробки или пенопласта);

- хирургический столик для мелких животных (крысы, морские свинки);

- пинцет медицинский, ГОСТ 21241-89;

- ножницы медицинские по ГОСТ 21239-93;

- ножницы глазные по ГОСТ 21239-89;

- скальпель по ГОСТ 30393-95 (возможно использование скальпеля со съемными лезвиями);

- резиновые груши для пипетирования биологического материала;

- сосуды Дьюара по ГОСТ 12.2.003-91, ГОСТ 12.2.052-81, ГОСТ 12.1.004-91, ТУ 26-04-622-88;

- термоконтейнеры различной вместимости или медицинская сумка-холодильник по ГОСТ Р 50444-92, ГОСТ Р 51350-99;

- ультразвуковая ванна с выходной мощностью не менее 60 Вт и рабочей частотой не ниже 40 кГц.

4.6.2. При отборе проб следует применять следующие расходуемые материалы:

- булавки или иглы для фиксации животных на препаровальном столике;

- дозаторы с переменным объемом дозирования фирмы "Gilson", США:

0,2 - 2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 1,2%;

2 - 20 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%;

1 - 10 куб. см с шагом 0,1 куб. см, с точностью +/- 0,5%;

- или дозаторы "Ленпипет" по ТУ 9452-002-33189998-2007:

0,5 - 10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%;

20 - 200 куб. мм с шагом 0,1 куб. мм, с точностью +/- 0,6%;

100 - 1000 куб. мм с шагом 1 куб. мм, с точностью +/- 3%;

- пробирки для микропроб однократного применения типа "Эппендорф" вместимостью 0,5; 1,5 и 2,0 куб. см по ТУ 64-2-30-80;

- криопробирки вместимостью 2,0 куб. см;

- штативы для пробирок;

- наконечники пластиковые объемом 1 - 200 куб. мм и 200 - 1000 куб. мм;

- цилиндры стеклянные мерные лабораторные разной вместимости, колбы конические разной вместимости по ГОСТ 1770-74Е; колбы плоскодонные конические на 250 куб. см с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74; колбы мерные вместимостью 100, 500, 1000 куб. см, тип 2-100-2, 2-500-2 по ГОСТ 1770-74; воронки лабораторные по ГОСТ 25336, иная посуда мерная лабораторная по ГОСТ 1770-74 и посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336-82;

- перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3-88;

- бритва фирмы "Ted Pella, Inc." (США), кат. N 121-1, или аналогичная;

- чашки Петри по ГОСТ 25336-82;

- флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл) объемом 10 куб. см;

- термоконтейнеры различной вместимости или медицинские сумки-холодильники;

- сейф-пакеты одноразовые для хранения и транспортирования проб.

4.6.3. При отборе проб следует применять следующие реактивы:

- хлороформ по ГОСТ 20015-88;

- диэтиловый эфир (эфир для наркоза стабилизированный) по ТУ 2600-001-43852015-05;

- спирт этиловый ректифицированный 96%-ный по ГОСТ 51652-2000;

- азот жидкий по ГОСТ 9293-74;

- деионизованная вода по ГОСТ 6709-79;

- изотонический раствор натрия хлорида (0,9 г/л хлористого натрия по ГОСТ 4233-77);

- глутаровый альдегид по ТУ 6-02-1273-89;

- нейтральный формалин по ГОСТ 1625-75 или приготовленный в соответствии с ГОСТ 4517-87, п. 2.15;

    - раствор фосфорно-солевого буфера 0,04 М KH PO , 0,16 М K HPO , pH 7,2
                                                2  4          2   4
-  7,4, 1,76% KCl. Для приготовления раствора на лабораторных весах готовят
навески  6,2  г  KH PO  х H O (х.ч. по ГОСТ 4198-75), 33,65 г K HPO  х 3H O
                   2  4    2                                   2   4     2
(х.ч.  по  ГОСТ  2493-75)  и  17,4 г KCl (х.ч., ГОСТ 4568-95) и вносят их в
мерную  колбу объемом 1000 куб. см, содержащую 500 куб. см дистиллированной
воды.  Соли  растворяют  при  перемешивании, объем раствора доводят до 1000
куб. см;

- раствор для фиксации: 2,5%-ный раствор глутарового альдегида, 2%-ный раствор формалина на фосфатно-солевом буфере. Для приготовления 100 куб. см раствора в мерную колбу вносят 50 куб. см двухкратного раствора фосфатно-солевого буфера, 10 куб. см коммерческого препарата глутарового альдегида (25%-ный водный раствор) и 5 куб. см коммерческого препарата формалина (40%-ный водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl, далее объем раствора доводят до 100 куб. см.

4.6.4. Кровь собирают асептически с использованием одноразовых инструментов, у крупных животных (крупного рогатого скота, овец, свиней, кроликов, собак, птиц и т.д.) путем венопункции, у мелких животных (мышей, крыс) - из кончика хвоста или из сердца, в случае вскрытия животных, в стерильную пробирку (1,5 - 2 куб. см), куда предварительно внесен раствор гепарина (10 ед./куб. см) (для электронной микроскопии оптимально иметь не менее 30 куб. мм сыворотки крови). После забора крови пробирки закрывают крышками и центрифугируют на небольшой скорости (до 2000 g) в течение 10 с - 1 мин., чтобы сбросить капельки крови, осевшие на стенки пробирок, не дав им высохнуть.

4.6.5. Процедуру отбора сыворотки следует начинать не позднее чем через 1,5 ч после отбора крови, чтобы избежать гемолиза. Для получения сыворотки кровь помещают в термостат (37 °С) на 30 мин., после чего центрифугируют в течение 10 мин. на скорости 2000 g. Отбирают сыворотку, не задевая тромба, в отдельную новую пробирку, которую маркируют соответствующим образом (с добавлением буквы "С" - сыворотка). Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20 °С.

4.6.6. Процедуру отбора плазмы следует начинать непосредственно после отбора крови, чтобы избежать ее свертывания. Для получения плазмы в отобранную кровь добавляют гепарин (10 ед./куб. см). Пробирки с гепаринизированной кровью центрифугируют в течение 10 мин. при скорости 2000 g. Отбирают плазму, не задевая клеточный осадок, в отдельную пробирку, которую маркируют соответствующим образом (с добавлением буквы "П" - плазма). На пробирки с осадком клеток крови наносят маркировку "КК" - клетки крови. Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20 °С.

4.6.7. Другие жидкости организма (лимфа, спинномозговая жидкость, желчь и др.) отбирают при помощи пункции одноразовыми шприцами в одноразовые пробирки объемом 1,5 - 2,0 куб. см. Пробирки маркируют, замораживают и хранят при температуре -20 °С.

4.6.8. Соскобы осуществляют с помощью специальных одноразовых инструментов - зондов, цитощеток или тампонов, после чего рабочую часть зонда аккуратно обламывают и помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом).

4.6.9. Смывы из носоглотки приготавливают путем введения с помощью одноразового шприца или зонда теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида в носовые ходы. Промывную жидкость собирают в отдельную пробирку. Пробирки маркируют, замораживают и хранят при температуре -20 °С.

4.6.10. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда) и помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом).

4.6.11. Пробу фекалий отбирают отдельным наконечником или одноразовыми лопатками, переносят в специальный флакон. У мелких животных пробы фекалий отбирают при вскрытии в асептических условиях из толстого отдела кишечника. Из твердых фекалий готовят фекальную суспензию, смешивая при помощи вибрационного встряхивателя 0,8 куб. см фосфатно-солевого буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) с 0,1 г (0,1 куб. см) фекалий до образования гомогенной взвеси. Для длительного хранения к суспензии добавляют глицерин до конечной концентрации 10 - 15%.

4.6.12. Аутопсию лабораторных животных производят в специально оборудованном помещении, которое полностью соответствует санитарно-гигиеническим требованиям к помещениям данного назначения. Все инструменты должны пройти антисептическую обработку в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Стеклянную посуду, соприкасающуюся с пробами, предварительно тщательно моют и стерилизуют одним из следующих способов: насыщенным паром в автоклаве в течение 30 мин. при 120 °С; горячим воздухом в стерилизаторе (сухожаровом шкафу) 30 мин. при 100 °С. Допускается стерилизация инструментов погружением в этиловый спирт. Для обеззараживания рук и рабочих поверхностей необходимо использовать латексные перчатки и 70%-ный этиловый спирт - ректификат. Одноразовая пластиковая стерильная посуда в неповрежденной упаковке дополнительной стерилизации не требует. Инструменты (скальпель, ножницы и пинцет), применяемые при вскрытии, и посуду многоразового использования, предназначенную для фиксации и хранения проб, дополнительно обрабатывают в ультразвуковой ванне с целью исключить вероятность перекрестного загрязнения образцов наночастицами.

Кусочки тканей или органов отбирают методом биопсии либо при вскрытии животных с использованием хирургических инструментов. При вскрытии животных в первую очередь отбирают кровь, поступающую к сердцу через нижнюю полую вену, чтобы избежать излияния крови в полости тела и исключить загрязнение тканей наночастицами в случае высокой их концентрации в крови. Затем последовательно выделяют тонкий и толстый кишечник, желудок, почки, печень, селезенку, легкие, сердце, аорту, брыжеечные, подмышечные и другие лимфатические узлы, после вскрытия черепной коробки животного - головной мозг. Необходимость отбора проб каждого из органов определяют по предположительной локализации исследуемого наноматериала.

Выделенный орган с помощью пинцета немедленно помещают в чашку Петри с фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4 и промывают от крови. Желудок и кишечник освобождают от содержимого и тщательно промывают водой, а затем фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4. В зависимости от цели исследования органы переносят в соответствующие фиксирующие жидкости или замораживают в жидком азоте или с помощью сухого льда.

4.6.13. Для приготовления срезов тканей для электронной микроскопии орган разрезают острой бритвой на куски размером 1 х 1 х 1 мм (6 кусков от одного органа одного животного). Куски пинцетом переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором (2,5%-ный глутаровый альдегид на 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2 - 7,4 с добавлением 2%-ного нейтрального формалина) из расчета 4 куб. см на один флакон. Из разных отделов желудка и кишечника вырезают кусочки площадью 1 кв. мм (объемом не более 1 куб. мм), переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором. Органы желудочно-кишечного тракта и кожи требуют ориентации при фиксации. Для этого поперечные срезы кожи и определенных отделов желудочно-кишечного тракта прикладывают на небольшие кусочки бумаги и в таком виде помещают в фиксатор. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно быть не менее 10:1. Пробы из одного органа от одного животного помещают в один флакон. Каждый флакон маркируют специальным химически стойким маркером или восковым карандашом либо приклеивают бумажную этикетку, запись на которой делают карандашом. На этикетке необходимо указывать номер животного и название органа, а также вид анализа, для которого подготовлена проба. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °С. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани.

4.6.14. Для приготовления тканевых гомогенатов для электронной микроскопии из органов вырезаются фрагменты размером от 5 х 5 х 5 мм до 10 х 10 х 10 мм, фрагменты большего размера предпочтительнее, небольшие органы или органы мелких животных можно фиксировать целиком. Органы или их фрагменты помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом).

4.6.15. Отобранные пробы соскобов, мазков, фекалий, кусочков органов и тканей замораживают погружением в жидкий азот, заключенный в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Каждую пробу после замораживания быстро заворачивают в фольгу. Пробы от разных органов помещают раздельно и снабжают этикетками с названиями этих органов, пробы от одного животного помещают в общую упаковку и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для кратковременного хранения или транспортирования. Также можно использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например пенопластовой) емкости.

Для длительного хранения препараты извлекают из жидкого азота и помещают в низкотемпературный холодильник с температурой не выше -80 °С. В таких условиях пробы могут храниться в течение неограниченного времени.

4.7. Фиксация (консервация) биологических проб для определения наноматериалов

4.7.1. Пробы фекальных масс собирают в стерильную одноразовую посуду (бакпечатки) с консервантом или используют специальные транспортные системы, содержащие консерванты (транспортные среды). В качестве консервантов (транспортных сред) используют глицериновую смесь, фосфатно-солевой буфер.

    4.7.2.  Пробы тканей или органов помещаются в охлажденный изотонический
раствор  хлорида  натрия  или  в  специальную  транспортную  среду (0,218 М
сахароза,  0,0038 М  KH PO ,  0,0072 М  K HPO ,  1%  БСА)  либо  подвергают
                       2  4              2   4
глубокому замораживанию в жидком азоте (-180 °С).

4.7.3. Для фиксации (консервации) проб биологических тканей, органов и жидкостей, предназначенных для определения биогенных наноматериалов на основе нуклеиновых кислот, используют специальные транспортные среды, разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов для выделения ДНК (РНК). В случае необходимости длительного хранения и перевозки проб в отсутствие низкотемпературных холодильников следует использовать транспортную среду ESP.

4.7.4. В целях фиксации (консервации) пробы, предназначенные для определения неорганических наноматериалов методом электронной микроскопии в срезах органов и тканей животных, помещают в маркированные пенициллиновые флаконы с фиксатором (раствор 2,5%-го глутарового альдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2 - 7,4 с добавлением 2%-ного нейтрального формалина) из расчета 4 куб. см на один флакон. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно составлять не менее 10:1. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °С.

Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани!

4.7.5. В целях фиксации (консервации) пробы, предназначенные для определения неорганических наноматериалов методом электронной микроскопии в соскобах, мазках, фекалиях, гомогенатах органов и тканей, помещают в маркированные криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2 - 7,4. Пробы замораживают жидким азотом в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Замороженные пробы каждую в отдельности быстро заворачивают в фольгу и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для долговременного хранения. Во избежание взрыва емкость с азотом не должна быть герметически закрыта. Можно также использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например, пенопластовой) емкости. В целях уменьшения теплообмена емкость с сухим льдом должна быть закрыта. Для длительного хранения препараты извлекают из жидкого азота и помещают в низкотемпературный холодильник с температурой не выше -80 °С. В таких условиях пробы могут храниться в течение длительного времени.

4.8. Количества отбираемых проб биологического материала

4.8.1. Объем (масса, количество) отбираемой пробы (проб) различных видов определяется в зависимости от выявляемых наночастиц (абиогенных и биогенных) и применяемых методов выявления (ПЭМ, АСМ, элементный анализ, хроматография, ПНР, ИФА).

4.8.2. Количество отбираемых образцов должно быть достаточным для выделения контрольной и лабораторной проб, размерами, допускающими проведение всех предусмотренных планом исследования анализов.

4.8.3. Количество отобранного биологического материала не должно быть избыточным. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество проводимых анализов.

Для выделения ДНК (РНК) для одного анализа методом ПЦР (ОТ-ПЦР) достаточно 200 куб. мм плазмы крови, 100 мкг образцов тканей или органов, фекалий.

Для одного анализа сывороток крови методом ИФА объем образца может составлять 5 - 1000 куб. мм в зависимости от рекомендаций фирмы - изготовителя тест-систем.

Для одного анализа методами ПЭМ и АСМ достаточно 30 куб. мм плазмы крови, 200 мкг образцов тканей или органов, фекалий.

4.9. Порядок отбора точечной, объединенной, средней, лабораторной, контрольной проб биологического материала

4.9.1. Для выявления и идентификации наноматериалов у лабораторных животных отбирают точечные пробы биологических жидкостей, тканей и органов, как было описано в п. п. 4.5 и 4.6. При исследовании органов, тканей и биологических жидкостей организма на содержание наноматериалов объединенную пробу не формируют. Каждый параметр характеризуется в пробах от индивидуальных животных, после чего полученный результат усредняется (статистически обрабатывается).

4.9.2. Точечная проба, отобранная для выявления и идентификации определенного наноматериала в биологическом материале, является одновременно и средней пробой, из которой простым делением на две части формируют лабораторную и контрольную пробы. При необходимости контрольная проба выделяется в процессе отбора проб.

4.9.3. Контрольная проба выделяется при необходимости на месте в процессе отбора проб, ее масса должна быть не более массы лабораторной пробы. Как правило, контрольная проба выделяется от точечной пробы и составляет половину ее массы (объема).

4.9.4. Контрольная проба хранится в сейф-пакете или в опломбированном (опечатанном) виде в течение срока ее годности при регламентированных температурных и влажностных режимах.

4.10. Меры предосторожности при введении наноматериалов в животных, эвтаназии, препарировании биоматериала, отборе и консервации проб

4.10.1. Перед проведением исследований содержания каждого отдельного наноматериала в лабораторных животных должна быть выполнена предварительная оценка уровня их потенциальной опасности для здоровья человека согласно МР 1.2.2522-09.

4.10.2. Биологические образцы, предположительно содержащие наночастицы и наноматериалы, следует рассматривать как потенциально опасные и соблюдать в обращении с ними соответствующие меры предосторожности для потенциально опасного биологического материала согласно стандартным операционным процедурам (СОП), установленным в лаборатории, проводящей исследование.

4.10.3. Работы с биологическими материалами и жидкостями, содержащими наночастицы, следует проводить в резиновых перчатках. Работы с отобранными биологическими пробами, предположительно содержащими наноматериалы, выполняются в ламинаре или в отдельных боксовых помещениях, снабженных системой вентиляции. Отбор проб следует производить в одноразовую посуду. Не допускается проведение работ в помещениях с неисправной системой вентиляции и воздуховодов!

4.10.4. Проанализированные биологические материалы инактивируются автоклавированием в течение 1 ч при давлении в 1,5 атмосферы или кипячением при 100 °С в течение 30 мин. После этого биологические материалы, предположительно содержащие наночастицы, сдают в специализированные организации, осуществляющие утилизацию потенциально опасных биологических отходов. Запрещается: утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию.

4.10.5. В процессе выполнения работ с наноматериалами обязательным является ношение персоналом рабочей/защитной одежды (халат, шапочка, спецобувь, перчатки). При выполнении работ, при которых возможно образование аэрозолей наноматериалов, дополнительно используются средства индивидуальной защиты (защитные очки, респиратор). На рабочих местах запрещается принимать еду, пить, курить, употреблять жевательную резинку, наносить косметику, а также хранить продукты питания, напитки, табачные изделия, выращивать комнатные растения. После завершения работ с наноматериалами проводят влажную уборку на рабочем месте и в помещении.

4.10.6. Для предохранения от инфицирования персонала при отборе проб биоматериалов и их транспортировании необходимо:

- не загрязнять наружную поверхность посуды при отборе проб;

- не загрязнять сопроводительные документы;

- избегать контакта пробы биоматериала с не защищенными перчатками руками сотрудников, проводящих сбор и транспортирование проб;

- транспортировать пробы в переносках или укладках с раздельными гнездами.

4.10.7. После вскрытия животных инструменты, пластины для манипуляций, хирургические столики, банки, бачки, садки из-под животных, подстилочный материал и т.п. должны обеззараживаться путем замачивания в дезинфицирующем растворе с последующим автоклавированием. Для дезинфекции допускается использование только дезинфицирующих средств, разрешенных в установленном порядке к применению в Российской Федерации. Методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от характера исследуемого наноматериала (биогенного или абиогенного происхождения), характера обеззараживаемого материала и целевого назначения средства.

4.10.8. Для дезинфекции применяют средства, содержащие в качестве действующих веществ активный кислород (перекисные соединения и др.), катионные поверхностно-активные вещества, хлорактивные соединения, альдегиды, спирты (этанол, пропанол и др.), чаще всего в виде многокомпонентных рецептур, содержащих одно или несколько действующих веществ и функциональные добавки (антикоррозионные, дезодорирующие, моющие и др.). Режимы дезинфекции различных объектов дезинфицирующими средствами приведены в инструкциях по их применению.

Согласно СП 1.3.2322-08 для обработки поверхностей в помещениях, приборов и оборудования используют дезинфицирующие средства с моющим эффектом. Для дезинфекции выделений (фекалий и др.) и посуды из-под выделений используют хлорактивные средства. Для дезинфекции спецодежды используют средства, не содержащие альдегидов и спиртов. Для дезинфекции хирургических инструментов и лабораторной посуды применяются средства на основе альдегидов, катионных поверхностно-активных веществ, перекиси водорода, хлорсодержащие средства. Для дезинфекции банок, бачков, садков из-под животных используют дезинфицирующие средства на основе альдегидов, катионных поверхностно-активных веществ, перекиси водорода, спиртов, хлорсодержащие средства.

4.10.9. Твердые обеззараженные отходы и тушки животных сдают в специализированные организации, осуществляющие утилизацию потенциально опасных биологических отходов. Допускается промежуточное хранение до утилизации трупного материала в упакованном виде в специально выделенной для этих целей и размещенной в отдельном помещении морозильной камере при температуре не выше -18 °С. Запрещается: хранение трупного материала в бытовых и предназначенных для хранения химических реактивов холодильниках. Хранение и утилизация трупного материала и биологических отходов, получаемых в экспериментах с применением наночастиц, должны осуществляться отдельно от аналогичных материалов, получаемых в исследованиях, где наночастицы и наноматериалы не используются. На упаковочную тару для биологических отходов, предположительно содержащих наночастицы и наноматериалы, наносят предупредительные надписи ("наноопасность", "содержит наночастицы/наноматериалы" и т.д.).

4.10.10. Все рабочие подразделения должны быть обеспечены аварийными аптечками. В состав аварийной аптечки входят: спирт этиловый 70° (два флакона по 100 куб. см), 2 - 3 навески перманганата калия для приготовления 0,05%-го раствора (12,5 мг перманганата калия + 25 куб. см воды), вода для инъекций, одноразовые шприцы, глазные пипетки, 5%-ная настойка йода, 3%-ный раствор перекиси водорода, ножницы с закругленными браншами, перевязочные средства (вата, бинты и пр.), жгут и нашатырный спирт.

При работе с микроорганизмами, вирусами и наноматериалами, содержащими ДНК, РНК (псевдовирусными наночастицами), в аптечке также должен быть 1%-ный раствор борной кислоты или навески для приготовления раствора (0,25 г борной кислоты + 25 куб. см воды), специфические сыворотки, иммуноглобулины на 2 - 4 человек, интерферон или индуктор интерферона, антибиотики широкого спектра действия из тетрациклиновой группы (хлортетрациклин, окситетрациклин, тетрациклин или др.) и из группы аминогликозидов (стрептомицин, канамицин, мономицин или др.) по 1 флакону для приготовления растворов.

4.10.11. При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройствами. Жидкость из пипетки должна стекать по внутренней стенке сосуда. Не допускается переливание жидких образцов через край, продувание через них воздуха из пипеток.

4.10.12. По окончании работы биологические образцы должны переноситься в хранилища (сейфы, холодильники, термостаты и т.д.). Не допускается оставлять после окончания работы на открытых местах или в неопечатанных хранилищах биологические образцы, посуду с посевами микроорганизмов и вводимые животным наноматериалы.

Не допускается оставлять биологические материалы и препараты, содержащие наноматериалы и наночастицы, после окончания работы на открытых местах или в неопечатанных хранилищах!

4.10.13. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхность столов не должна иметь трещин и швов.

4.10.14. Комнаты, рабочие поверхности, штативы, оборудование, применяемые при работе с лабораторными животными, следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.

4.11. Возможные нештатные ситуации в ходе отбора проб биологических материалов и меры по их устранению

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: