МУ 1.2.2634-10. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 мая 2010 года

Дата введения:
с момента утверждения

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждением Российской академии медицинских наук "Научно-исследовательский институт питания" РАМН; ФГУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора; Учреждением Российской академии медицинских наук "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи" РАМН; Учреждением Российской академии наук "Центр "Биоинженерия" РАН; Учреждением Российской Академии наук "Институт биохимии им. А.Н. Баха" РАН; ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы"; ООО "Интерлаб".

2. Разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2010 годы".

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 мая 2010 г.

4. Введены в действие с 24 мая 2010 г.

5. Введены впервые.

I. Введение

В течение ближайших лет ожидается резкое увеличение объемов производства во всем мире, в т.ч. в Российской Федерации, искусственных наноматериалов, в частности таких, как наночастицы оксидов кремния, титана, цинка, железа, церия, алюминия, металлические наночастицы железа, меди, кобальта, никеля, алюминия, серебра, золота, углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы биополимеров и рекомбинантных вирусов. Это с неизбежностью приведет к поступлению значительных количеств наноматериалов в окружающую среду, их накоплению в компонентах биоты и абиотических средах с последующей возможной передачей человеку.

Создание комплексной системы безопасности в процессе исследований, освоения, производства, обращения и утилизации наноматериалов в Российской Федерации требует наличия методов, позволяющих всесторонне тестировать безопасность искусственных наноматериалов и нанотехнологической продукции для широкого спектра биологических объектов. В качестве важной "мишени" воздействия наночастиц, специфически обусловленного их малыми размерами и высокоразвитой межфазной поверхностью, в настоящее время рассматриваются компоненты микробиоценоза. Воздействие наноматериалов на отдельных представителей нормальной и патологической микрофлоры толстой кишки человека может проявляться в селективной ингибиции или, напротив, усилении роста отдельных ее представителей, что может вызвать дисбиотические нарушения, приводящие к развитию разнообразных негативных последствий для организма, включая угнетение функции иммунитета, патологию желудочно-кишечного тракта. Возможное мутагенное действие, которое наночастицы способны оказывать на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза, может приводить к появлению новых патогенных и условно-патогенных штаммов, обладающих потенциально непредсказуемыми свойствами и влиянием на макроорганизм хозяина.

Настоящие методические указания разработаны в целях внедрения единого, научно обоснованного, количественного подхода к оценке безопасности искусственных наноматериалов на основе изучения их воздействия на нормальные и транзиторные компоненты микробиоценоза толстой кишки лабораторных животных в условиях естественного (физиологического) перорального пути введения наноматериала, а также выявления у наноматериалов способности индуцировать мутагененез (в молекулярно-генетическом тесте на модельных штаммах микроорганизмов) и приобретать гены трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Результаты проводимых тестов должны входить как неотъемлемая часть в систему оценки безопасности новых наноматериалов в ходе их разработки, регистрации, производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации.

II. Область применения

2.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к проведению тестирования безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на компонентах нормального микробиоценоза толстой кишки с изучением их микробиологических и молекулярно-генетических показателей.

2.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе установления безопасности наноматериалов на стадиях их производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с данными процессами.

2.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов искусственного происхождения.

2.4. Методические указания предназначены для специалистов органов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, научно-исследовательских организаций гигиенического профиля и медицинских учебных заведений, а также иных организаций и учреждений, проводящих исследования по оценке рисков, связанных с нанотехнологиями и использованием наноматериалов.

III. Общие положения

3.1. Проведение исследований по микробиологической и молекулярно-генетической оценке воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза определяется правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями Приказа Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении правил лабораторной практики" (зарегистрирован Министерством юстиции Российской Федерации 25 июня 2003 г., регистрационный номер 4809).

3.2. Требования к стандартным наноматериалам.

3.2.1. Для верификации, стандартизации и калибровки методов, применяемых при определении безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах, используются стандартные образцы наноматериалов (стандарты).

3.2.2. Каждый стандарт наноматериала должен быть охарактеризован на соответствие по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Указанные характеристики определяются с использованием методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, трансмиссионной электронной микроскопии, определения изотерм адсорбции инертных газов, рентгенофазового (рентгенодифракционного) анализа. В случае стандартных образцов фуллеренов при проверке соответствия следует использовать метод обращеннофазовой ВЭЖХ.

3.2.3. Каждый стандартный образец наноматериала должен быть снабжен "Паспортом безопасности наноматериалов", составленным на основе ГОСТ 30333-2007 "Паспорт безопасности химической продукции. Общие требования".

3.2.4. Стандартные образцы наноматериалов должны быть упакованы для защиты при транспортировании от загрязнения или порчи.

3.2.5. Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных применяемых веществ с соблюдением условий хранения, указанных в "Паспорте безопасности наноматериалов", на протяжении всего срока годности образца.

3.2.6. Хранение и использование стандартных образцов наноматериалов осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом исследования.

3.3. Требования к используемому оборудованию.

3.3.1. Организации, проводящие определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника, должны быть оснащены необходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль и калибровку в установленном порядке.

3.3.2. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.4. Планирование и проведение исследований.

3.4.1. Определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника проводится по утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.4.2. Тесты по определению безопасности наноматериалов, требующие использования лабораторных животных, проводятся только на здоровых животных, прошедших карантин в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении Правил лабораторной практики" и Приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных".

3.4.3. Помещения для лабораторных животных должны обеспечивать изоляцию (карантин) поступающих животных для наблюдения и выбраковки больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций, позволять осуществлять раздельное содержание как различных видов животных, так и различных групп животных одного вида, соответствовать санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям.

3.4.4. Корма, оборудование и инвентарь для ухода за животными необходимо хранить в помещениях, изолированных от мест содержания животных. Помещения, корма и инвентарь должны соответствовать требованиям, установленным в Приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении Правил лабораторной практики", Приказе Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных" и СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

3.4.5. Исследования безопасности наноматериалов на животных проводятся в соответствии с установленными правилами. Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных в соответствии с утвержденным протоколом (п. 3.4.7).

3.4.6. Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты исследования.

3.4.7. Данные исследования безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника заносятся в протокол, в котором отражены цели работы и методы, используемые для достижения этих целей.

Протокол исследования утверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает: цель и задачи исследования, имеющиеся сведения о тестируемом наноматериале (физические, химические, биологические, токсикологические свойства), используемые стандарты, схему проведения тестирования и ее обоснование, методы введения наноматериала в биологический объект, применяемые дозы наноматериала, методы исследования, определяемые показатели, результаты исследований, метрологическую характеристику используемого метода анализа, статистическую обработку результатов исследования, заключение, список используемой литературы.

3.4.8. Вносимые изменения в протокол исследования утверждаются руководителем исследования, а отклонения от протокола (незапланированные события, непредвиденные обстоятельства и т.д.) записываются, пронумеровываются, подписываются руководителем исследования, датируются в приложении с указанием причин.

3.5. Требования к оформлению отчета.

3.5.1. По окончании проведенных исследований безопасности наноматериалов по влиянию на микробиологические и молекулярно-генетические показатели компонентов микробиоценоза оформляется отчет, в котором должны быть представлены: название, адрес организации, даты начала и завершения исследований, цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала, включая имеющиеся сведения о физических, химических, биологических, токсикологических свойствах; перечень протестированных образцов наноматериала и применяемых стандартов, метод введения наноматериала в организм животного, схема проведения исследования, описание методов статистической обработки результатов, результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой, и комментариев к ним, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы.

3.5.2. Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.6. Система обеспечения качества исследований по определению безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах.

3.6.1. Контроль за качеством проведения исследований по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника включает в себя оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.6.2. Для осуществления контроля качества руководитель организации, проводящей тестирование безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, назначает, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.7. Стандартные операционные процедуры.

3.7.1. Стандартные операционные процедуры разрабатываются организацией, проводящей исследования безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, на все производственные операции, включая: поступление, идентификацию, маркировку, отбор, обработку проб, использование и хранение исследуемых проб, хранение и аттестацию стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов и оборудования; ведение тест-систем и их поддержание в функциональном состоянии; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию наноматериалов, содержащих их образцов (если это необходимо) и использованных компонентов тест-систем, осуществление программы по обеспечению качества, и утверждаются руководителем организации.

3.7.2. Соблюдение стандартных операционных процедур осуществляется в целях обеспечения безопасности исследования, качества, достоверности и воспроизводимости его результатов.

3.7.3. Отклонения от стандартных операционных процедур должны быть документально оформлены и согласованы с руководителем исследования.

3.7.4. Организация, проводящая исследование по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязана:

- иметь утвержденный порядок приема и учета поступления анализируемых проб и стандартов наноматериалов;

- проводить учет анализируемых проб и стандартов наноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации;

- принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых веществ (указание на этикетке названия, химической формулы, номера серии, даты выпуска, условий хранения и сроков годности) и их стабильности на протяжении всего исследования. Для образцов наноматериалов на этикетке дополнительно должны указываться степень дисперсности, размер, форма частиц, при необходимости, удельная площадь поверхности и кристаллическая структура.

3.8. Меры конфиденциальности.

3.8.1. Сотрудники, принимающие участие в проведении исследований безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.8.2. Организация, проводящая исследования по определению безопасности наноматериалов, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

IV. Метод оценки безопасности наноматериалов на нормальной микрофлоре кишечника в условиях in vivo

4.1. Принцип метода

Оценку влияния наноматериалов на нормальную микрофлору кишечника в условиях in vivo проводят на основании изучения видового состава и количественных уровней основных микробных популяций микробиоценоза кишечника, их функциональной активности путем посевов фекальных масс или содержимого толстого кишечника лабораторных животных, которым внутрижелудочно вводят образцы наноматериалов, при сравнении с животными, которым вводят традиционный аналог наноматериала, и с контрольными животными. В качестве групп сравнения (контроль) используют животных, которым вводят дистиллированную воду или среду - носитель наноматериала.

Проводят изучение не менее 4-х групп и родов защитных популяций микрофлоры (лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды, лактозоферментирующие энтеробактерии) и 5-ти групп и родов транзиторных (условно-патогенных) представителей микробиоты (энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, дрожжевые и дрожжеподобные грибы, споровые анаэробы и др.) на соответствующих дифференциально-диагностических и селективных средах.

Количественный учет бифидобактерии проводят на тиогликолевой среде или среде Блаурокка; лактобацилл - на среде МРС; энтеробактерий - на среде Эндо и цитратном агаре. Содержание стафилококков определяют на желточно-солевом агаре и среде Байрд-Паркера; стрептококков - на кровяном агаре; энтерококков - на среде МИС; количество сульфитредуцирующих клостридий - на железосульфитной среде; дрожжей - на среде Сабуро; плесневых грибов - на среде Сабуро или Чапека.

У штаммов энтеробактерий, стафилококков проводят определение таксономической принадлежности до уровня вида с использованием системы мультимикротестов API для биохимической идентификации, производства фирмы "Bio Merieux" (Api 10S, Api 20E, Api Rapid 20E, Api Staph), и/или классических методов исследования.

Содержание определенных групп, родов, видов микроорганизмов (плотность популяций) выражают в десятичном логарифме числа колониеобразующих единиц на 1 г сырой массы фекалий или кишечного содержимого (lg КОЕ/г).

Помимо количественных характеристик определяют наличие факторов патогенности, таких как гемолитическая активность энтеробактерий, стафилококков, энтерококков, лецитиназная и коагулазная активность стафилококков, способность к образованию хламидоспор и псевдомицелия дрожжеподобными грибами.

Определение функциональных свойств (антагонистической активности) популяций бифидобактерий, выделенных из кишечника лабораторных животных, проводят по степени их кислотообразующей активности в среде культивирования.

Полученные значения подвергают статистической обработке с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Мана-Уитни. Различие между опытной и контрольными группами признаются достоверными на уровне значимости P < 0,05. Расчеты проводят с помощью пакетов программ EXCEL и SPSS.

4.2. Стандартные образцы наноматериалов

При калибровке метода используются стандартные образцы из банка стандартных образцов наноматериалов.

4.3. Лабораторные животные, их содержание и рацион

Тестирование выполняют на мышах-самцах инбредной линии Balb/C с исходной массой 20 - 22 г или крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 150 - 160 г, в соответствии со специально разработанным дизайном эксперимента. После семи (для мышей) или десяти (для крыс) дней адаптации на рационе вивария у животных контролируют массу тела и определяют динамику прироста массы тела. Особей, отстающих в приросте массы тела, удаляют.

Животных делят на группы, количество которых определяется количеством тестируемых видов и доз наноматериалов + 1 контрольная группа. Оптимальное число животных в каждой группе составляет 10 особей, но не менее 6. В зависимости от количества вводимых доз наноматериалов формируют следующие группы животных (по 6 - 10 особей в каждой): животных опытных групп подвергают воздействию тестируемого наноматериала, животных групп сравнения - воздействию его традиционного аналога, животные контрольной группы получают плацебо - среду, в которой был диспергирован наноматериал (в общем случае - дистиллированную воду).

В течение всего периода эксперимента животные получают стандартные рационы, согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Ежедневно контролируют состояние животных, поедаемость корма; еженедельно - поведение, состояние шерстного покрова, наличие/отсутствие диареи, прирост массы тела.

Для исключения влияния на микрофлору кишечника неспецифических факторов, связанных со стрессом животных, все животные подвергаются тем же манипуляциям, что и животные, получающие наноматериалы.

4.4. Методика введения тестируемого образца

Образцы наноматериалов вводят ежедневно однократно внутрижелудочно через зонд, снабженный гладкой оливой диаметром не более 2 мм, в виде дисперсии в дистиллированной воде. При приготовлении дисперсии тестируемых наноматериалов необходимо применять физические методы диспергирования (перемешивание, встряхивание, ультразвуковая обработка). Применение органических растворителей и детергентов не допускается. В порядке исключения допустимо введение наноматериалов на носителе, биологическая инертность которого подтверждена в дополнительных контрольных тестах.

Дистиллированную воду животным контрольной группы вводят внутрижелудочно в том же объеме, в котором вводятся наноматериалы опытным группам.

Тестируемые дозы вводимого наноматериала устанавливаются на основе сведений о возможности экспонирования человека данным наноматериалом с учетом 10-кратного коэффициента запаса.

Продолжительность введения наноматериалов составляет не менее 20 дней.

4.5. Отбор проб

По окончании введения тестируемых наноматериалов животных подвергают эвтаназии одним из разрешенных для этого способов (Приказ МЗ СССР N 755).

Мышей после усыпления эфиром подвергают вскрытию и проводят отбор фекальных масс из содержимого их толстого кишечника в стерильную одноразовую посуду.

Крыс после усыпления эфиром подвергают вскрытию, в процессе вскрытия выделяют слепую кишку, помещают в стерильную одноразовую посуду и в условиях асептики отбирают ее содержимое в бакпечатку для исследования микрофлоры.

Образцы хранят не более 3 ч при (4 +/- 2) °C.

4.6. Средства измерений и оборудование

Термостат, поддерживающий рабочую
температуру в интервале от (25 +/- 1)
до (45 +/- 1) °C                                  ТУ 64-1-1382-72
или других моделей, с аналогичными
характеристиками

Морозильная камера, обеспечивающая
температуру (-20) °C или ниже
Ламинарный шкаф марки ЛШ1 фирмы "Biokom"
или аналогичный
Центрифуги со скоростью вращения
ротора до 12000 об./мин. для пробирок
вместимостью 15 и 1,5 куб. см
Встряхиватель вибрационный типа "Вортекс"
со скоростью вращения до 3000 об./мин.
Холодильник бытовой электрический                 ГОСТ 26678-85
Весы лабораторные общего назначения
с наибольшим пределом взвешивания 200 г           ГОСТ 24104-2001

Мембранные установки для получения
деионизованной воды                               ОСТ 11-029.003-80
Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений pH +/- 0,01                 ГОСТ 27987-88
Дозаторы с переменным объемом
дозирования                                       ТУ 9452-002-33189998-2002
или аналогичные:
 0,2 - 2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
 с точностью +/- 1,2%;
 2,0 - 20,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
 с точностью +/- 0,8%;
 1,0 - 10,0 куб. см с шагом 0,10 куб. см,
 с точностью +/- 0,5%;
 0,5 - 10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
 с точностью +/- 0,8%;
 20,0 - 200,0 куб. мм с шагом 0,10 куб. мм,
 с точностью +/- 0,6%;
 100,0 - 1000,0 куб. мм с шагом 1,00 куб. мм,
 с точностью +/- 3,0%
Пробирки стерильные типа "Эппендорф",
объемом 1,5 куб. см или аналогичные
Пробирки стерильные с крышкой "Costar",
вместимостью 15 куб. см или аналогичные
Наконечники пластиковые,
объемом 1 - 200 куб. мм
Наконечники пластиковые,
объемом 200 - 1000 куб. мм
Ножницы медицинские                               ГОСТ 21239-89
Анаэробные контейнеры с оборудованием
для генерирования анаэробной атмосферы,
включая систему для проверки анаэробных условий
Дистиллятор                                       ГОСТ 6709-72
Микроскоп биологический, обеспечивающий
просмотр в проходящем свете, с увеличением
900 - 1000x с иммерсионной системой
или с приспособлением для фазово-контрастного
микроскопирования
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150        ТУ 16-535-8
или аналогичный
Стерилизатор суховоздушный
для температурного режима (160 +/- 0,5) °C
Стерилизатор паровой медицинский                  ГОСТ 19569-89
или аналогичный
Петля бактериологическая платино-иридиевая
или никель-хромовая, диаметром 3 мм
Петля бактериологическая полимерная,
объемом 1, 10 куб. мм
Пинцет медицинский                                ГОСТ 21241-89
Скальпель хирургический, 15 см                    ГОСТ 21240-89
Спиртовки лабораторные стеклянные                 ГОСТ 23932-90
Термоконтейнер (сумка-холодильник)
Отраслевой стандартный образец мутности
на 5 и 10 ЕД мутности или стандарт МакФарланда    ОСО 42-28-85-04П

4.7. Материалы, лабораторная посуда и реактивы

Бумага фильтровальная лабораторная                ГОСТ 12026-76
Вата медицинская гигроскопическая                 ГОСТ 5556-81
Марля медицинская                                 ГОСТ 9412-93
Индикаторы анаэробной атмосферы
Мешки полимерные для стерилизации
и деструкции лабораторных принадлежностей
Перчатки резиновые или пластиковые                ГОСТ 3-88
Колбы плоскодонные конические разной вместимости  ГОСТ 1770-74
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные,
вместимостью 25, 100, 1000 куб. см                ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные                                ГОСТ 25336-82
Флакон-диспенсер для дозирования жидкостей
Флаконы с резьбой и крышкой стерилизуемые,
объемом 500 - 1000 куб. см
Пипетки градуированные                            ГОСТ 29227-91
                                                  (ИСО 835-1-81)
Палочки стеклянные                                ГОСТ 21400-75
Стекла предметные для микропрепаратов             ГОСТ 9284-75
Стекла предметные для микропрепаратов             ГОСТ 6672-75
Стекла часовые
Шпатели бактериологические
Чашки Петри, диаметр 90 или 100 мм
Штативы для пробирок
Чашки биологические (Петри)                       ГОСТ 23932-90
Пробирки типов П1, П2                             ГОСТ 25336-82
Флаконы стерильные, объемом 100 и 200 куб. см
"Costar" или аналогичные
Бакпечатки стерильные однократного применения     ТУ 64-2-279-79
Питательная среда для контроля стерильности
(тиогликолевая)                                   ФСП 42-0010-4456-03
                                                  или
                                                  ТУ 9398-040-7895326-2007
Питательная среда для культивирования

и выделения бифидобактерий (Бифидум-среда)        ТУ 9398-041-7895326-2007
Среда МРС агаризованная, соответствующая
требованиям                                       ГОСТ 10444.11-89,
                                                  ГОСТ Р 51331-99,
                                                  РУ ФСЗ 2007/00435,
                                                  SMDP, APHA
Среда Эндо                                        ТУ 9229-072-00419785,
                                                  ТУ 9398-027-7895326-2007
Цитратный агар Симмонса,
питательная среда N 14 ГРМ                        ФС 42-3623-98,
                                                  ТУ 9398-014-7895326-2006,
                                                  ТУ 9229-072-00419785
Кровяной агар, трипказо-соевый агар
с 5%-й бараньей кровью
Трехсахарный железистый агар (TSI, среда N 13)    ТУ 9398-013-7895326-2006
Молочно-ингибиторная среда (МИС),
питательная среда для выделения энтерококков,
соответствующая требованиям                       ГОСТ 28566-90,
                                                  ФСП 42-0504-7787-06
Среда Сабуро агаризованная,
питательная среда N 2 ГРМ (Сабуро),
среда для определения дрожжей и плесеней          ФС 42-3729-99,
                                                  ФСП 42-0504-0813-04,
                                                  ТУ 9229-014-00419789-95,
                                                  ТУ 9398-098-7895326-2008
Среда Чапека, соответствующая требованиям         ГОСТ 10444.12-88
Агар Байрд-Паркера, соответствующая требованиям   ГОСТ 10444.2-94,
                                                  1676РУ МЗ РФ N 2003/1663,
                                                  ISO 6888-1983,
                                                  РУ ФС 6888-2-1999
Среда для определения S. aureus
(желточно-солевой агар)
Железосульфитная среда,
соответствующая требованиям                       ГОСТ 10444.11-89,
                                                  ТУ 9229-013-00419789-95,
                                                  РУ ФС N 2006/1176,
                                                  ISO 7937
Среда Клиглера                                    ТУ 9229-072-00419785-97
Кровяной агар
Фосфатно-тиогликолевый буфер
(калия дигидрофосфат 4,5 г, натрия
гидрофосфат 6,0 г, агар-агар 1,0 г,
тиогликолевая кислота 0,4 куб. см
на 1000 куб. см воды дистиллированной)
Красители для окрашивания по Грамму
Неомицин-агар (КАБ) для определения
бактероидов (10 г пептона,
3,0 г NaCl, 2,0 г Na HPO  x 2H O,
                    2   4     2
3,0 г мясо-пептонного бульона,
4,0 г дрожжевого экстракта, 6,0 г декстрозы,
1,0 куб. см твин-80, 20,0 г агар-агара,
доводят дистиллированной водой до 1000 куб. см,
затем добавляют 250 мг цистина, 80 мг неомицина,
200 мг дезоксихолата натрия, 30 куб. см крови,
pH готовой среды 7,2)
Биотест для контроля паровой стерилизации
Индикаторы термовременные для контроля паровой
и воздушной стерилизации
Биотест для контроля суховоздушной стерилизации
Агар микробиологический                           ГОСТ 17206-96
Ацетон                                            ГОСТ 2768-84
Бриллиантовый зеленый
Бромкрезол пурпурный
Бромтимоловый синий
Водорода перекись                                 ГОСТ 10929-76
Хлороформ                                         ТУ 2631-001-29483781-2004
Экстракт дрожжевой сухой
Яйца куриные пищевые                              ГОСТ Р 52121-2003

Натрий хлористый                                  ГОСТ 4233-77
Спирт этиловый ректификованный
Масло иммерсионное для микроскопии                ГОСТ 31739-78
Вода дистиллированная
Набор реактивов для окраски по Грамму
Тест-системы для биохимической идентификации
энтеробактерий API 10S, API 20E,API Rapid 20E,
Enterotube или аналогичные
Мультимикротесты для биохимической
идентификации стафилококков API Staph.,
производства фирмы "Biomerieux", Франция
Дезинфицирующий раствор типа "Жавель Солид",
"Виркон", "Самаровка" или аналогичные
Неомицина сульфат

Допускается использование других реактивов и материалов аналогичного назначения, разрешенных к применению в установленном порядке и с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данными методическими указаниями.

На питательные среды и биологические препараты импортного производства должен иметься сертификат системы качества изготовителя по ИСО 9000 или EN 29000.

Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4.8. Методика проведения анализа

4.8.1. Приготовление суспензии фекалий (содержимого слепой кишки) животных

    Исследуемый материал  (фекалии мышей или навеску из содержимого  слепой
кишки крыс)  в пределах 1 г  (взвешивают на электронных весах на стерильной
подложке)  вносят  в  предварительно  регенерированный агаризованный (0,1%)
тиогликолево-фосфатный    буфер,   обеспечивающий   выживание    анаэробных
микроорганизмов,  в  соотношении  1  к  10.   Из  этой  суспензии   готовят
последовательные  десятикратные разведения на фосфатно-тиогликолевом буфере
     -1      -10
от 10   до 10   .  Каждое  разведение,  начиная с исходного, гомогенизируют
методом,  имитирующим  центрифугирование  (круговыми  движениями  руки  при
согнутом локтевом суставе).

Подготовленные разведения используют для посева на дифференциально-диагностические и селективные среды для количественного учета девяти групп микроорганизмов - представителей защитной микрофлоры и представителей транзиторной (сопутствующей) микрофлоры.

4.8.2. Проведение количественного посева

Посев из соответствующих разведений суспензии производится строго количественно - по 0,05 куб. см на различные плотные питательные среды с последующим распределением материала с помощью шпателя или бактериологической петли по всей поверхности агаризованной среды в чашке Петри (допускается посев мерного количества на 1/2 или 1/4 часть чашки Петри). В жидкие и полужидкие питательные среды вносят по 1 куб. см суспензии. Схема первичного посева, питательные среды, сроки и условия инкубации приведены в табл. 1.

Таблица 1

СХЕМА ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА СУСПЕНЗИИ ФЕКАЛИЙ (СОДЕРЖИМОГО СЛЕПОЙ КИШКИ) ЖИВОТНЫХ

---------------------+----------------+------------+-----------------------
¦  Микроорганизмы:   ¦  Питательные   ¦ Разведения ¦    Сроки, условия    ¦
¦ группа, семейство, ¦     среды      ¦исследуемого¦      инкубации       ¦
¦      род, вид      ¦                ¦ материала  ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦         1          ¦       2        ¦     3      ¦          4           ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Общее число         ¦Кровяной агар,  ¦10  , 10  , ¦До 7 суток в анаэроб- ¦
¦анаэробных          ¦6 - 10%         ¦  -7   -9   ¦ных условиях при еже- ¦
¦микроорганизмов     ¦                ¦10 , 10     ¦дневном контроле роста¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Общее число аэробных¦Кровяной агар 3%¦10  , 10  , ¦48 ч в аэробных       ¦
¦микроорганизмов     ¦                ¦  -7        ¦условиях              ¦
¦                    ¦                ¦10          ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Лактобациллы        ¦Модифицированный¦10  , 10  , ¦3 суток в микро-      ¦
¦                    ¦агар Рогозы     ¦  -7        ¦аэрофильных условиях  ¦
¦                    ¦(МРС)           ¦10          ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Стрептококки        ¦Кровяной агар 3%¦10  , 10  , ¦48 ч в аэробных       ¦
¦                    ¦                ¦  -7        ¦условиях              ¦
¦                    ¦                ¦10          ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -5    -7  ¦                      ¦
¦Бактероиды          ¦Кровяной агар с ¦10  , 10  , ¦48 ч в анаэробных     ¦
¦                    ¦неомицином 6%   ¦  -9        ¦условиях или в аэроб- ¦
¦                    ¦                ¦10          ¦ных условиях с приме- ¦
¦                    ¦                ¦            ¦нением часовых стекол ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -6     -10¦                      ¦
¦Бифидобактерии      ¦Тиогликолевая   ¦10   - 10   ¦3 - 5 суток в анаэроб-¦
¦                    ¦среда или среда ¦            ¦ных или микроаэро-    ¦
¦                    ¦Блаурокка       ¦            ¦фильных условиях      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Энтеробактерии      ¦Эндо            ¦10  , 10  , ¦24 ч в аэробных       ¦
¦                    ¦                ¦  -7        ¦условиях              ¦
¦                    ¦                ¦10          ¦                      ¦
¦                    +----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦                    ¦Цитратный агар  ¦10  , 10  , ¦4 суток в аэробных    ¦
¦                    ¦                ¦  -7        ¦условиях              ¦
¦                    ¦                ¦10          ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Энтерококки         ¦Молочно-солевой ¦10  , 10  , ¦48 ч в аэробных       ¦
¦                    ¦агар с полимик- ¦  -7        ¦условиях              ¦
¦                    ¦сином (МИС)     ¦10          ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -1        ¦                      ¦
¦Патогенные          ¦Висмутсульфит-  ¦10          ¦24 - 48 ч в аэробных  ¦
¦микроорганизмы:     ¦агар, среда     ¦            ¦условиях              ¦
¦шигеллы, сальмонеллы¦Плоскирева      ¦            ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦Бактерии рода протея¦Эндо,           ¦            ¦24 ч,                 ¦
¦                    ¦Цитратный агар  ¦            ¦4 суток               ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -1    -3  ¦                      ¦
¦Стафилококки        ¦Желточно-       ¦10  , 10  , ¦48 ч в аэробных       ¦
¦                    ¦солевой агар    ¦  -5        ¦условиях              ¦
¦                    ¦Среда           ¦10          ¦                      ¦
¦                    ¦Байрд-Паркера   ¦            ¦                      ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -1     -5 ¦                      ¦
¦Сульфитредуцирующие ¦Железосульфитная¦10   - 10   ¦5 суток в анаэробных  ¦
¦клостридии <*>      ¦среда           ¦            ¦или микроаэрофильных  ¦
¦                    ¦                ¦            ¦условиях              ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦                    ¦                ¦  -3    -5  ¦                      ¦
¦Дрожжевые грибы,    ¦Среда Сабуро    ¦10  , 10    ¦3 - 5 суток в аэробных¦
¦плесени             ¦                ¦            ¦условиях              ¦
+--------------------+----------------+------------+----------------------+
¦    <*> При учете  клостридий следует иметь в виду,  что почернение среды¦
¦может быть связано с присутствием сульфитредуцирующих энтеробактерий.    ¦
---------------------------------------------------------------------------

Общее число анаэробных и аэробных микроорганизмов учитывают на 6 - 10%-м кровяном агаре, инкубируемом в анаэробных условиях (в атмосфере углекислого газа 5 - 10%) и в аэробных условиях для сопоставления выросших колоний. Инкубация при 37 °C 48 ч.

Количество бактероидов определяют с использованием часовых стекол. Из соответствующих разведений исследуемого материала наносят автоматической пипеткой по 0,05 куб. см на чашки Петри на кровяной агар с неомицином для бактероидов. После того, как капля "втягивается" в агар, на место посева накладывают часовые стекла с агаром, на который посеяна культура Serratia marcencens. Рост этого строго аэроба обеспечивает создание анаэробных условий, необходимых для культивирования бесспоровых анаэробных бактерий.

Подготовка часовых стекол.

В часовые стекла заливают 1,0 - 2,0 куб. см кровяного агара с неомицином, подсушивают в течение 20 мин. в термостате при температуре 37 °C. Суточную культуру Serratia marcescens, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают 10 куб. см стерильной дистиллированной воды, взбалтывают и выливают в чашку Петри. Затем стерильным ватным тампоном наносят суспензию на поверхность агара в часовых стеклах. После 4 ч инкубации при 37 °C обработанные таким образом часовые стекла накладывают на поверхность питательной среды, предназначенной для культивирования бактероидов. После инкубации в течение 48 ч выросшие колонии микроскопируют и подсчитывают. Колонии бактероидов - плоские голубоватого цвета с матовой поверхностью, с ровными или зазубренными краями, как правило, колонии мелкие.

Для остальных представителей микробиоценоза применяют следующие условия культивации:

- бифидобактерии определяют на тиогликолевой среде или на среде Блаурокка с последующим определением pH в среде культивирования;

- лактобациллы - на среде МРС;

- энтеробактерии - на среде Эндо и цитратном агаре;

- бактерии рода Proteus - на средах, используемых для учета энтеробактерий;

- содержание стафилококков определяют на желточно-солевом агаре и агаре типа Байрд-Паркер, с последующим определением плазмокоагулирующей активности;

- стрептококки - на кровяном агаре;

- энтерококки - на среде МИС;

- количество сульфитредуцирующих клостридий - на железосульфитной среде;

- количество дрожжеподобных грибов - на среде Сабуро с дальнейшим определением характера филаментации и наличия хламидоспор на рисовом агаре.

Гемолитические свойства энтеробактерий, стафилококков, энтерококков изучают на кровяном агаре.

Морфологию выделенных культур определяют микроскопированием окрашенных по Грамму мазков-препаратов.

У штаммов энтеробактерий проводят определение таксономической принадлежности до вида с использованием систем для биохимической идентификации энтеробактерий (Api 10S, Api 20E, Rapid 20E и др.) или посевом на диагностические среды для определения способности к ферментации углеводов (среды Гисса, трехсахарный агар) и аминокислот (фенилаланин-агар, среды с лизином, орнитином, аргинином).

4.8.3. Учет результатов количественного посева

Учет результатов проводят по истечении сроков инкубации по числу выросших колоний в посевах из 2-х последних разведений, с изучением культуральных, морфологических (микроскопия) и тинкториальных свойств (окраска по Грамму). При этом подсчет выросших типичных колоний проводится на чашках с числом от 5 до 30, с расчетом среднего арифметического показателя, а также с учетом сопоставимости количества колоний из предшествующих разведений. Число выросших колоний умножают на разведение исследуемого материала и выражают в КОЕ/г по формуле:

К = число выросших колоний на чашке (секторе) x 20 x n,

где:

К - количество микроорганизмов КОЕ в 1 г;

n - разведение суспензии;

20 - коэффициент пересчета на 1 куб. см суспензии при посеве 0,05 куб. см (0,05 куб. см составляет 1/20 куб. см).

                                       7
    Например, в посеве из разведения 10  выросло 10 колоний. 10 умножают на
                   7                                 9
20 и умножают на 10  (разведение) и получают 2,0 x 10  КОЕ/г.

Полученный результат переводят в десятичный логарифм числа.

4.9. Исследования функциональной активности популяций микрофлоры

4.9.1. Оценка функциональной активности популяции бифидобактерий, выделенных из фекалий мышей или содержимого слепой кишки крыс

Оценку показателя проводят по способности бифидобактерий закислять среду культивирования путем измерения активной кислотности (pH) среды культивирования I генерации (в пробирках с ростом бифидобактерий на 5 сутки выращивания). Величину pH измеряют потенциометрическим методом во всех пробирках с наличием признаков роста с помощью потенциометра со стеклянным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения, градуированным по стандартным буферным растворам pH 4, 7 и 9.

Контролем служит пробирка с исходной питательной средой. Полученные значения суммируют и усредняют.

Интенсивность кислотообразования у бифидобактерий коррелирует с антагонистической активностью. Критериями служат пределы pH: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6 - 5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности.

4.9.2. Дополнительные характеристики защитных представителей микрофлоры

При необходимости для подтверждения таксономической принадлежности микроорганизмов или расширенной оценки влияния наноматериалов на микрофлору кишечника могут быть проведены тесты, указанные в табл. 2.

Таблица 2

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗАЩИТНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА ЖИВОТНЫХ

---------------+----------------------------------+------------------------
¦Микроорганизмы¦       Биохимические тесты        ¦          АА           ¦
+--------------+----------------------------------+-----------------------+
¦Бифидобактерии¦Отсутствие каталазы               ¦-                      ¦
¦              ¦Определение родовой принадлежности¦                       ¦
¦              ¦на тест-системах фирмы Биомерье   ¦                       ¦
¦              ¦API 50CHE, Enterotube             ¦                       ¦
+--------------+----------------------------------+-----------------------+
¦Лактобациллы  ¦Отсутствие каталазы               ¦Метод диффузии в агар с¦
¦              ¦Определение родовой принадлежности¦газоном из патогенных и¦
¦              ¦на тест-системах фирмы Биомерье   ¦условно-патогенных     ¦
¦              ¦API 50CHE, Enterotube             ¦бактерий               ¦
+--------------+----------------------------------+-----------------------+
¦Энтеробактерии¦Отсутствие оксидазы               ¦Метод отсроченного     ¦
¦              ¦                                  ¦антагонизма            ¦
---------------+----------------------------------+------------------------

АА выделенных лактобактерий изучается по отношению не менее чем к 5-ти тест-штаммам грамотрицательных патогенных и условно-патогенных микробов (Salmonella typhimurium, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae и др.) методом диффузии в агар в тесте отсроченного антагонизма по Фредериксу. Критерии оценки приведены в табл. 3.

Таблица 3

СТЕПЕНЬ АА ЛАКТОБАЦИЛЛ

-------------------------------------+-------------------------------------
¦      Степень выраженности АА       ¦ Степень ингибиции тест-штаммов, %  ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Очень высокая (ОВ)                  ¦80 - 100                            ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Высокая (В)                         ¦60 - 79                             ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Умеренная (У)                       ¦40 - 59                             ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Слабая (С)                          ¦20 - 39                             ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Очень слабая (ОС)                   ¦До 20                               ¦
+------------------------------------+------------------------------------+
¦Отсутствие АА (-)                   ¦0                                   ¦
-------------------------------------+-------------------------------------

4.10. Обработка полученных данных

Индивидуальные результаты определений содержания отдельных представителей микрофлоры, выраженные в lg числа колонийобразующих единиц на 1 г фекалий, подвергают статистической обработке с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Мана-Уитни. Различие между опытной и контрольной группами признаются достоверными на уровне значимости P < 0,05. Расчеты проводят с помощью пакетов программ EXCEL и SPSS.

4.11. Оформление результата

Результаты проведения опытного и контрольного тестов оформляются в виде таблицы, пример которой представлен ниже (табл. 4). Наряду с количественными характеристиками основных изучаемых групп, родов и видов микроорганизмов, для которых в столбцах N 3 - 4 приводятся известные из литературы средние значения популяционных уровней для взрослых животных данного вида, в таблицу заносятся установленные значения lg КОЕ/г, свидетельствующие о наличии у животных дисбиотических отклонений в микрофлоре кишечника и факторов патогенности (число гемолитически активных энтеробактерий, стафилококков, энтерококков, стрептококков, плазмокоагулирующих и лецитиназноактивных стафилококков и т.п.). Для указанных видов микроорганизмов сведения о популяционных значениях в таблице не приведены, значения у опытных животных сопоставляются с контрольными.

Таблица 4

ПРИМЕР ОФОРМЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ НАНОМАТЕРИАЛОВ НА МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА В УСЛОВИЯХ IN VIVO

--T---------------+-------------------+------------------------------------
¦N¦ Представители ¦      Средний      ¦             Результат             ¦
¦ ¦микробиоценоза ¦   популяционный   +-----+------+-------+--------------+
¦ ¦               ¦уровень у взрослых ¦конт-¦опыт 1¦опыт 2 ¦      Р       ¦
¦ ¦               ¦ животных данного  ¦роль ¦(нано-¦(тради-+------+-------+
¦ ¦               ¦  вида, lg КОЕ/г   ¦     ¦мате- ¦ционный¦конт- ¦опыт 1/¦
¦ ¦               ¦(пределы колебаний)¦     ¦риал) ¦аналог)¦роль/ ¦опыт 2 ¦
¦ ¦               +---------+---------+     ¦      ¦       ¦опыт 1¦       ¦
¦ ¦               ¦  мыши   ¦  крысы  ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦1¦       2       ¦    3    ¦    4    ¦  5  ¦  6   ¦   7   ¦  8   ¦   9   ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦1¦Анаэробные     ¦10 - 11  ¦9 - 11   ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦микроорганизмы ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦2¦Аэробные       ¦5 - 8    ¦7 - 9    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦микроорганизмы ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Бактероиды     ¦8 - 10   ¦8 - 10   ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Бифидобактерии ¦7 - 9    ¦8 - 9    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Лактобациллы   ¦8 - 9    ¦8 - 9    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+

¦ ¦Энтеробактерии ¦4 - 6    ¦4 - 5    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч. лактозо-¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦негативные и   ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦замедленно     ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦ферментирующие ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦лактозу        ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦энтеробактерий ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч. цитрат- ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦ассимилирующие ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦энтеробактерии ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Бактерии рода  ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦Proteus        ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Патогенные     ¦0        ¦0        ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦микроорганизмы ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦(Salmonella    ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦spp.)          ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Стрептококки   ¦5 - 7    ¦7 - 9    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч.         ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦гемолитические ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦стрептококки   ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Энтерококки    ¦         ¦5 - 6    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч.         ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦энтерококки    ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦гемолитические ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Стафилококки   ¦4 - 5    ¦5 - 6    ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч.         ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦S. aureus      ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Клостридии     ¦8        ¦2        ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦В т.ч. лецити- ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦назоположитель-¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦ные клостридии ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Дрожжи и       ¦Не более ¦Не более ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦дрожжеподобные ¦5        ¦7        ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦грибы*         ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Плесневые грибы¦         ¦Не более ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦               ¦         ¦6        ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
+-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+-------+
¦ ¦Прочие         ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
¦ ¦микроорганизмы ¦         ¦         ¦     ¦      ¦       ¦      ¦       ¦
L-+---------------+---------+---------+-----+------+-------+------+--------

Показатели микробиоценоза, определенные для контрольной группы в течение эксперимента, должны находиться в пределах диапазона значений, указанных в колонках N 3 - 4 табл. 4. В противном случае, результаты тестирования влияния наноматериалов на микрофлору кишечника признаются некорректными.

4.12. Интерпретация результата

4.12.1. Для оценки воздействия наноматериалов на состояние кишечной микрофлоры используются следующие критерии:

1) ингибиция роста - снижение содержания представителей защитной резидентной микрофлоры на 1 lg КОЕ/г и более;

2) отсутствие ингибирующего эффекта - содержание микроорганизмов, относящихся к резидентной микрофлоре, находится в пределах одного порядка;

3) стимуляция роста потенциально-патогенных представителей кишечного микробиоценоза, обладающих факторами патогенности.

4.12.2. На основании проведенных исследований и при условии соответствия показателей микробиоценоза у контрольных животных тестируемый наноматериал признается безопасным, если:

а) не обнаружено достоверных различий между группой, получавшей наноматериалы (группы 1), и контрольной группой, а также группой, получавшей традиционный аналог наноматериала (группы 2);

б) результаты тестирования свидетельствуют о сохранении популяционных соотношений анаэробного и аэробного компонента микрофлоры; отсутствии ингибиции представителей защитной микрофлоры и стимуляции роста представителей кишечного микробиоценоза, обладающих факторами патогенности; отсутствии роста патогенных микроорганизмов; отсутствии снижения АА бифидобактерий.

4.12.3. Тестируемый наноматериал признается отрицательно воздействующим на состояние кишечного микробиоценоза, если обнаружены достоверные различия хотя бы по одному из перечисленных в п. 4.12.2, пп. "б" эффектов или эффектов, тестируемых дополнительно (АА лактобактерий, энтеробактерий).

V. Метод оценки безопасности наноматериалов по изменению активности фермента дегидрогеназы штамма бактерий E. coli

5.1. Принцип метода

Метод основан на подавлении окислительной активности фермента дегидрогеназы микроорганизмов E. coli под воздействием содержащихся в воде наноматериалов и оценке степени указанного воздействия путем сравнения времени обесцвечивания метиленового синего под воздействием фермента в испытываемой и контрольной пробах.

Дегидрогеназы относят к группе ферментов класса оксидоредуктаз, катализирующих отщепление водорода от органических веществ. Они встречаются во всех живых клетках, участвуя в реакциях углеводного и жирового обмена, а также биологического окисления. Дегидрогеназы весьма чувствительны к действию токсикантов различной природы, что дает основание по степени подавления их активности судить о биологической токсичности исследуемых наноматериалов, в частности, содержащихся в пробах воды.

5.2. Характеристика тест-объекта

Штамм E. coli с основными стандартными свойствами, присущими организмам данного вида, может быть получен из музея штаммов E. coli, имеющегося в каждой бактериологической лаборатории ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора.

5.3. Оборудование, средства измерения, материалы, реактивы, используемые при биотестировании

5.3.1. Оборудование и средства измерения

Термостат, поддерживающий рабочую
температуру 28 - 45 °C с отклонением
от заданной температуры +/- 1 °C                            ТУ 64-1-1382-72
Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений pH +/- 0,01                           ГОСТ 27987-88
Секундомер                                                  ГОСТ 8.423-81
Пробирки с притертыми пробками
(шлиф N 14) с рабочим объемом 23 куб. см                    ГОСТ 25336-82

5.3.2. Реактивы

- Раствор метиленового синего х.ч. 0,01% в стерильной деионизованной воде;

- раствор пептона свежеприготовленный 1%;

- раствор хлористого натрия 0,9% стерильный (физиологический раствор) по ГФ IX, N 506, с. 472;

- суточная культура E. coli АТСС (25922).

5.4. Условия и процедура биотестирования

Пробу воды, содержащей тестируемые наноматериалы, доводят до pH 7,0 +/- 0,2 и вносят в три пробирки по 20 куб. см в каждую.

В другие три пробирки вносят по 20 куб. см физиологического раствора (0,9% хлористый натрий) с pH 7,0 +/- 0,2.

В каждую пробирку добавляют по 1 куб. см растворов пептона, метиленового синего и 1 куб. см суточной культуры E. coli (из расчета получения в смеси плотности клеток - 10 КОЕ/куб. см).

Если предполагается, что в исследуемой воде могут содержаться наноматериалы, обладающие свойствами окислителей, что может проявляться в замедлении процесса обесцвечивания метиленового синего, дополнительно готовят контрольную группу из трех пробирок, в каждую из которых вносят по 20 мл исследуемой воды и по 1 мл растворов пептона и метиленового синего (по п. 5.3.2), но не вносят культуру E. coli.

Жидкость во всех пробирках по мере внесения препаратов аккуратно перемешивают, после чего закрывают пробками, вытесняя небольшой избыток жидкости, чтобы избежать образования воздушной прослойки над жидкостью.

Сразу после заполнения и герметизации все пробирки с растворами помещают в термостат с t = 37 °C и осуществляют наблюдение через стекло в дверце за процессом обесцвечивания метиленового синего в результате процесса окисления. Для улучшения условий наблюдения позади пробирок устанавливают экран белого цвета (лист белой бумаги).

Начало отсчета времени обесцвечивания жидкости в пробирках фиксируют с момента помещения их в термостат. В течение первых 20 - 25 мин. наблюдения ведут периодически, начиная с 25 мин., - непрерывно, отмечая время обесцвечивания раствора в каждой пробирке. В среднем время обесцвечивания для контрольных проб с физиологическим раствором и для проб воды, не содержащих токсикантов и окисляющихся компонентов, составляет 30 - 40 мин.

При наличии в воде токсикантов, подавляющих активность дегидрогеназы, время обесцвечивания может существенно увеличиваться.

В этом случае при отсутствии обесцвечивания жидкости в пробирках с испытываемой пробой воды опыт прекращают по истечении времени, на 30 - 40% превышающего время обесцвечивания смеси с контрольным физиологическим раствором.

5.5. Обработка и интерпретация результатов испытаний

Расчет относительного изменения активности фермента дегидрогеназы ДЕЛЬТА A под воздействием химических компонентов, содержащихся в испытываемой пробе, производят по формуле:

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: