МУК 4.1.2673-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дитианона в ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
2 августа 2010 года

Дата введения:
1 октября 2010 года

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает метод измерения массовой концентрации дитианона в ботве и клубнях картофеля в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг.

Дитианон.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 5,10-дигидро-5,10-диоксо-нафто[2,3-b]-1,4-дитиин-2,3-дикарбонитрил.

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H N O S .
                           14 4 2 2 2

Молекулярная масса: 296,3.

Химически чистое вещество: коричневый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 225 °C.

                                     -6
    Давление пара при 25 °C: 2,7 x 10   мПа.
    K   log P = 3,2.
     ow
    Растворимость  в  воде  (20 °C, pH 7) - 0,14 мг/л; хлороформе - 12 г/л;
ацетоне - 10 г/л; бензоле - 8 г/л; ацетонитриле - 5 г/л. Умеренно растворим
в  метаноле  и  дихлорметане.  Разлагается  как в щелочной среде, так и под
действием концентрированных кислот, а также при длительном нагревании; ДТ
                                                                         50
12,2  часа (pH 7, 25 °C). Чувствителен к воздействию солнечного света. ДТ
                                                                         50
составляет 19 часов для водного раствора с концентрацией 0,1 мг/мл.
    Краткая  токсикологическая  характеристика. Острая оральная токсичность
ЛД    678  мг/кг  для  крыс и 115 мг/кг для морских свинок. Обладает слабым
  50
раздражающим  действием  на  глаза  и кожу. При подкожном введении ЛД   для
                                                                     50
крыс составляет > 2000 мг/кг. Ингаляционная токсичность для крыс - 2,1 мг/л
воздуха (период наблюдения 4 часа).

Гигиенические нормативы: МДУ для картофеля не установлен.

Область применения препарата: лиственный фунгицид защитного и отчасти целебного действия. Используется для контроля многих заболеваний листьев, включая паршу на фруктовых деревьях; ржавчину и скручивание листьев у абрикосов и персиков, образование пятен на листьях смородины и т.д. Эффективен против возбудителей болезней Stigmana carpophila, Coccomyces hiemalis, manlia, Didimella applanata, Mycosphaerella fragariae и др.

1. Методика определения дитианона в ботве и клубнях картофеля методом ВЭЖХ

1.1. Основные положения

1.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении дитианона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ботвы или клубней ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Учитывая чувствительность препарата к нагреванию и воздействию УФ-лучей для пробоподготовки выбран экспрессный метод, исключающий нагревание образца или его длительные экспозиции на свету.

1.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

----------+-------------+-------------+-------------+----------+-----------
¦ Объект  ¦  Диапазон   ¦ Показатель  ¦Стандартное  ¦Предел    ¦Предел    ¦
¦ анализа ¦определяемых ¦  точности   ¦отклонение   ¦повторяе- ¦воспроиз- ¦
¦         ¦концентраций,¦  (граница   ¦повторяемос- ¦мости, r, ¦водимости,¦
¦         ¦    мг/кг    ¦относительной¦ти, сигма , %¦%         ¦R, %      ¦
¦         ¦             ¦погрешности),¦         r   ¦          ¦          ¦
¦         ¦             ¦+/- дельта, %¦             ¦          ¦          ¦
+---------+-------------+-------------+-------------+----------+----------+
¦Клубни   ¦0,025 - 0,100¦50           ¦3,4          ¦9,5       ¦14,8      ¦
¦картофеля+-------------+-------------+-------------+----------+----------+
¦         ¦0,100 - 0,250¦25           ¦2,75         ¦7,7       ¦11,9      ¦
+---------+-------------+-------------+-------------+----------+----------+
¦Ботва    ¦0,025 - 0,100¦50           ¦5,1          ¦14,2      ¦22,0      ¦
¦картофеля+-------------+-------------+-------------+----------+----------+
¦         ¦0,100 - 0,250¦25           ¦2,5          ¦7,1       ¦11,0      ¦
----------+-------------+-------------+-------------+----------+-----------

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДИТИАНОНА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ, ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ n = 20, P = 0,95

-----------------+-------+-------------+--------+-----------+--------------
¦ Анализируемый  ¦Предел ¦  Диапазон   ¦Среднее ¦Стандартное¦Доверительный¦
¦     объект     ¦обнару-¦определяемых ¦значение¦отклонение,¦  интервал   ¦
¦                ¦жения, ¦концентраций,¦опреде- ¦   S, %    ¦  среднего   ¦
¦                ¦мг/кг  ¦    мг/кг    ¦ления, %¦           ¦ результата, ¦
¦                ¦       ¦             ¦        ¦           ¦   +/-, %    ¦
+----------------+-------+-------------+--------+-----------+-------------+
¦Клубни картофеля¦0,025  ¦0,025 - 0,250¦85,2    ¦4,9        ¦4,45         ¦
+----------------+-------+-------------+--------+-----------+-------------+
¦Ботва картофеля ¦0,025  ¦0,025 - 0,250¦89,5    ¦3,9        ¦3,55         ¦
-----------------+-------+-------------+--------+-----------+--------------

1.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения дитианона достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2.1. Реактивы и материалы

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-200нм", сорт 5 или х.ч.            ТУ 6-09-3534-87
Натрий уксуснокислый, ч.                                    ГОСТ 199-68
Уксусная кислота, ледяная                                   ГОСТ 61-69
Магний сернокислый 7-водный, х.ч.                           ГОСТ 4523-67
Силикагель, Merck 1.09385.1000
Бумажные фильтры "красная лента"                            ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная                   ГОСТ 6709-79
Дитианон, аналитический стандарт
с содержанием д.в. 98,6%, BAS 216F
Кислота ортофосфорная, 0,005 М
водный раствор, х.ч.                                        ГОСТ 6552-80
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила
и 0,005 М H PO  в соотношении 50:50
           3  4

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

2.2. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters"
с быстросканирующим УФ детектором, снабженным
дегазатором, автоматическим пробоотборником
и термостатом колонки или "Breeze"
фирмы "Waters" или аналогичный
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18
(100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные                 ГОСТ 24104-2001

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2                                     ТУ 5.375-4261-76
Бидистиллятор
Шприц медицинский с разъемом Льюера                        ГОСТ 22090
Воронки лабораторные В-75-110                              ГОСТ 25336-82
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см                 ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см                             ГОСТ 22292-74
Микродозаторы Ленпипет переменного объема
от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Аппарат для встряхивания (Chirana)

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2.3. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания". Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18 °C.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают в соответствии с типовыми методиками.

2.4.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 часа.

2.4.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Точную навеску дитианона (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,025, 0,050, 0,100, 0,200 и 0,250 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Основной и рабочие градуировочные растворы используют свежеприготовленными. При изучении полноты извлечения дитианона из картофеля используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.4.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дитианона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дитианона в градуировочном растворе.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

                      |C - C |
                            к
                      -------- x 100 <= лямбда      ,
                         C                    контр.

    где:
    C   -   аттестованное   значение  массовой  концентрации  бифентрина  в
градуировочном растворе;
    C   - результат контрольного измерения массовой концентрации бифентрина
     к
в градуировочном растворе;
    лямбда        -  норматив  контроля  градуировочного  коэффициента,  %.
          контр.
лямбда       = 10% при P = 0,95).
      контр.

2.4.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5. Проведение определения

2.5.1. Определение дитианона в клубнях картофеля

10 г измельченных клубней картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

2.5.2. Определение дитианона в ботве картофеля

10 г измельченной ботвы картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 10 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Дальнейшую обработку пробы производят по п. 2.5.1.

2.5.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 235 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм. Время удерживания дитианона составляет 6,3 +/- 0,1 мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание дитианона в образцах клубней и ботвы картофеля (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                                 S  x C x V
                                  2
                             X = ----------,
                                   S  x P
                                    1
    где:
    S  - площадь пика дитианона в стандартном растворе (мВ x сек.);
     1
    S  - площадь пика дитианона в анализируемой пробе (мВ x сек.);
     2

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация стандартного раствора дитианона, мкг/куб. см.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дитианона 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2
                       ------------------- <= r,                        (1)
                            (X  + X )
                              1    2

    где:
    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2
    r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
                                                     r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

               _
              (X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,

    где:
    _
    X   -   среднее   арифметическое  результатов  определений,  признанных
приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

    Величина добавки C  должна удовлетворять условию:
                      д

                       C  = ДЕЛЬТА    + ДЕЛЬТА    ,
                        д         л,X         л,X'

    где  +/-  ДЕЛЬТА     (+/-  ДЕЛЬТА    )  -  характеристика   погрешности
                    л,X              л,X'
(абсолютная     погрешность)     результатов    анализа,    соответствующая
содержанию  компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания
компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:

                        ДЕЛЬТА  = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
                              л

    где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

                        ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

    дельта   -   граница  относительной  погрешности  методики  (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
    Результат контроля процедуры K  рассчитывают по формуле:
                                  к

                             K  = X'- X - C ,
                              к            д

    где  X',  X,  C   -  среднее  арифметическое  результатов  параллельных
                   д
определений  (признанных  приемлемыми  по  п.  4)  содержания  компонента в
образце    с    добавкой,   испытуемом   образце,   концентрация   добавки,
соответственно, мг/кг.
    Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

                              _____________________
                             /     2            2
                       K = \/ДЕЛЬТА     + ДЕЛЬТА   .
                                   л,X'         л,X

    Проводят  сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
                                                            к
контроля (K).
    Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                              |K | <= K,                                (2)
                                к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2
                       ------------------- <= R,                        (3)
                            (X  + X )
                              1    2

    где:
    X , X  - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
     1   2

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9. Разработчики

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: