МУК 4.1.2665-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имазамокса в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
2 августа 2010 года

Дата введения:
1 октября 2010 года

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены имени Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 02.08.2010.

4. Вводятся в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций имазамокса в семенах и масле рапса в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Имазамокс

(RS)-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метоксиметилникотиновая кислота (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

    C  H  N O .
     15 19 3 4
    Мол. масса 305,3.
    Кристаллическое   вещество   белого   цвета   без  запаха.  Температура
                                                                    -2
плавления:  166,0  -  166,7  °С. Давление паров при 20 °С < 1,3 х 10   мПа.
Растворимость  в органических растворителях при 20 °С (г/куб. дм): ацетон -
29,3;  ацетонитрил  -  19,0; гексан - 0,007; дихлорметан - 218,0; метанол -
67,5. Растворимость в воде при 20 °С - 4,16 г/куб. дм. Вещество стабильно к
гидролизу при рН 5, 7 и 9. Быстро подвергается фотолитическому разложению в
воде: DT   - 6,8 ч.
        50
    Краткая токсикологическая характеристика:
    Острая  пероральная  токсичность  (LD  )  для  крыс - более 5000 мг/кг;
                                         50
острая  дермальная  токсичность  (LD  )  для  кроликов > 4000 мг/кг, острая
                                    50
ингаляционная токсичность (LK  ) для крыс > 6300 мг/куб. м.
                             50

Область применения препарата:

Имазамокс рекомендуется в качестве гербицида для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорняками в посевах подсолнечника сои, рапса (опрыскивание в период вегетации).

Рекомендуемый МДУ имазамокса в семенах и масле рапса - 0,1 мг/кг.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

-------+-------------+------------------+------------+---------+-----------
¦Анали-¦  Диапазон   ¦    Показатель    ¦Стандартное ¦Предел   ¦Предел    ¦
¦зируе-¦определяемых ¦точности (граница ¦отклонение  ¦повторяе-¦воспроиз- ¦
¦мый   ¦концентраций,¦  относительной   ¦повторяемо- ¦мости, r,¦водимости,¦
¦объект¦    мг/кг    ¦   погрешности),  ¦сти, сигма ,¦%        ¦R, %      ¦
¦      ¦             ¦  +/- дельта, %,  ¦          r ¦         ¦          ¦
¦      ¦             ¦     P = 0,95     ¦%           ¦         ¦          ¦
+------+-------------+------------------+------------+---------+----------+
¦Семена¦от 0,1 до 1  ¦25                ¦4,6         ¦13       ¦15        ¦
¦рапса ¦             ¦                  ¦            ¦         ¦          ¦
+------+-------------+------------------+------------+---------+----------+
¦Масло ¦от 0,1 до 1  ¦25                ¦2,6         ¦7        ¦9         ¦
¦рапса ¦             ¦                  ¦            ¦         ¦          ¦
-------+-------------+------------------+------------+---------+-----------

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

-------+------------------------------------------------------------------
¦Анали-¦           Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20           ¦
¦зируе-+------------+-------------+-----------+-----------+--------------+
¦мый   ¦   Предел   ¦  Диапазон   ¦  Полнота  ¦Стандартное¦Доверительный ¦
¦объект¦обнаружения,¦определяемых ¦извлечения ¦отклонение,¦интервал сред-¦
¦      ¦   мг/кг    ¦концентраций,¦вещества, %¦   S, %    ¦него результа-¦
¦      ¦            ¦    мг/кг    ¦           ¦           ¦та, +/-, %    ¦
+------+------------+-------------+-----------+-----------+--------------+
¦Семена¦0,1         ¦0,1 - 1,0    ¦79,4       ¦4,1        ¦2,3           ¦
¦рапса ¦            ¦             ¦           ¦           ¦              ¦
+------+------------+-------------+-----------+-----------+--------------+
¦Масло ¦0,1         ¦0,1 - 1,0    ¦93,0       ¦2,5        ¦1,4           ¦
¦рапса ¦            ¦             ¦           ¦           ¦              ¦
-------+------------+-------------+-----------+-----------+---------------

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб семян смесью метанол - соляная кислота, масла - ацетонитрил - вода - уксусная кислота, последовательной очистки экстракта семян окислением, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, затем на патронах Sep Pak Silica, масла - 2-стадийной очистки на концентрирующих патронах С18 Sep Pak.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии имазапира и метазахлора.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором     Номера Госреестра
с переменной длиной волны фирмы "Agilent" или "Waters"   16193-06, 15311-08
Весы аналитические ВЛА-200                               ГОСТ 24104-2001

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим
пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой
погрешности +/- 0,038 г                                  ГОСТ 24104-2001

Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2     ГОСТ 1770-74
Меры массы                                               ГОСТ 7328-2001
Пипетки градуированные 2-го класса точности
вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см                   ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой
вместимостью 5 и 10 куб. см                              ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью
25, 50, 100, 250, 500 и 1000 куб. см                     ГОСТ 1770-74

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Имазамокс, аналитический стандарт с содержанием
действующего вещества 99,5% (CL-No 299263,
CAS No 114311-32-9), относительная погрешность
аттестованного значения +/- 1,0%
Аммоний уксуснокислый (ацетат аммония), хч               ГОСТ 3117-78
Ацетонитрил для хроматографии, хч                        ТУ 6-09-14-2167-84
Вода деионизованная                                      ГОСТ 6709-72
н-Гексан для ВЭЖХ                                        ТУ 6-09-06-657-84
Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч           ГОСТ 20490-75
Калий углекислый (карбонат калия, поташ)
прокаленный хч                                           ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый (хлорид кальция),
насыщенный водный раствор, хч                            ГОСТ 450-77
Кислота орто-фосфорная, 85%-ная, хч                      ГОСТ 6552-80
Кислота серная концентрированная, хч                     ГОСТ 4204-77
Кислота соляная, хч                                      ГОСТ 3118-77
Кислота уксусная ледяная, хч                             ГОСТ 61-75
Метилен хлористый (дихлорметан), хч                      ГОСТ 12794-80
Метиловый спирт (метанол), хч                            ГОСТ 6995-77
Натрий сернокислый (сульфат натрия) безводный, хч        ГОСТ 4166-78
Натрий углекислый (карбонат натрия), 5%-ный водный
раствор, хч                                              ГОСТ 83-79
Пропанол-2 (изопропиловый спирт, изопропанол)            ТУ 6-09-4522-77
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид
фосфора)                                                 ТУ 6-09-4173-85
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч          ГОСТ 22300-76

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума
(для работы с концентрирующими патронами)
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с              ТУ 64-1-2851-78
Бумажные фильтры "красная лента" обеззоленные
или фильтры из хроматографической бумаги
Ватман 3ММ                                        ТУ 2642-001-05015242-07
Воронка Бюхнера                                   ГОСТ 9147-80
Воронка делительная вместимостью
250 и 500 куб. см                                 ГОСТ 9737-93
Воронки конусные диаметром 30 - 37 и 60 мм        ГОСТ 25336-82
Груша резиновая                                   ТУ 9398-05-0576-9082-2003
Индикаторная бумага универсальная, рН 1 - 10      ТУ 6-09-1181-89
Колба Бунзена                                     ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные на шлифе вместимостью
1000 - 2000 куб. см                               ГОСТ 25336-82
Колбы конические (плоскодонные) вместимостью
100, 200 - 250, 400 - 500, 1000 - 2000 куб. см    ГОСТ 23932-90
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью
100 и 150 куб. см                                 ГОСТ 9737-93
Мельница лабораторная электрическая
Мембранные фильтры микропористые марки ММК,
капроновые диаметром 50 мм, размер пор
0,45 мкм                                          ТУ 9471-002-10471723-2003
Набор для фильтрации растворителей
через мембрану
Насос водоструйный вакуумный                      ГОСТ 25336-82
Стаканы химические вместимостью
100, 500 куб. см                                  ГОСТ 25336-82
Стекловата
Стеклянные палочки
Патроны для твердофазной экстракции
С18 Sep Pak, Classik (Waters, США),
масса сорбента 360 мг
Патроны для твердофазной экстракции
Sep Pak Silica (Waters, США), объем сорбента
2 куб. см
Ректификационная колонна с числом
теоретических тарелок 30
Ротационный вакуумный испаритель В-169
фирмы Buchi, Швейцария
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка стальная
длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм,
содержащая Eclipse XDB С18, зернение 5 мкм
Хроматографическая колонка стальная длиной
250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм,
содержащая Zorbax SB С8 зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного
хроматографа вместимостью 50 - 100 куб. мм
Шприцы медицинские с разъемом Льюера
вместимостью 5 и 10 куб. см
Центрифуга

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Приготовление растворов соляной кислоты

Для приготовления 1 N раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 300 - 400 куб. см деионизованной воды, помещают 83 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Для приготовления 0,05; 0,025 и 0,01 N растворов в мерные колбы вместимостью 1000 куб. см помещают соответственно 50, 25 и 10 куб. см 1 N раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление 4 N раствора серной кислоты

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 200 - 300 куб. см деионизованной воды, вносят 56 куб. см концентрированной серной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.4. Приготовление смеси для экстракции проб семян

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см метанола, вносят 400 куб. см 0,025 N раствора соляной кислоты, перемешивают.

7.5. Приготовление смеси для экстракции проб растительного масла

В колбу вместимостью 1000 - 2000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, вносят 500 куб. см деионизованной воды и 20 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

7.6. Приготовление 0,05 М раствора уксуснокислого аммония

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 3,85 г уксуснокислого аммония, доводят водой до метки, вносят 1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

7.7. Приготовление 25%-ного раствора метанола в 0,05 М растворе уксуснокислого аммония

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 25 куб. см метанола, доводят до метки 0,05 М раствором уксуснокислого аммония, перемешивают.

7.8. Приготовление 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, перемешивают.

7.9. Приготовление 0,1%-ного раствора марганцовокислого калия

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 0,5 г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают.

7.10. Приготовление 0,1%-ного раствора орто-фосфорной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 300 - 400 куб. см деионизованной воды, вносят 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.11. Подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>.

--------------------------------

<*> В отсутствие специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью поршня медицинского шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

Концентрирующие патроны промывают с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) последовательно метанолом, этилацетатом, хлористым метиленом порциями по 5 куб. см со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек. Патроны готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

7.12. Подготовка концентрирующих патронов С18 Sep Pak

7.12.1. Первая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек., затем 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты.

7.12.2. Вторая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, последовательно гексаном, хлористым метиленом, метанолом, водой, 0,05 N раствором соляной кислоты порциями по 3 куб. см.

Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.13. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

7.13.1. Измерение по п. 9.3.1.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, вносят 800 куб. см 0,1%-ного раствора орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.13.2. Измерение по п. 9.3.2.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 180 куб. см ацетонитрила, вносят 820 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.14. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2) при скорости подачи растворителя соответственно 0,8 или 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.15. Приготовление градуировочных растворов

7.15.1. Исходный раствор имазамокса для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса, растворяют в 50 - 70 куб. см метанола, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.15.2. Растворы N 1 имазамокса для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора имазамокса с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.15.1), доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

7.15.3. Рабочие растворы N 2 - 5 имазамокса для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 имазамокса с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.15.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией имазамокса 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 5-ти дней.

7.16. Приготовление растворов внесения для оценки полноты извлечения имазамокса из образцов

7.16.1. Исходный раствор (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса, растворяют в 50 - 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.16.2. Основной раствор имазамокса для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора имазамокса с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.16.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

7.17. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (mAU х сек.) от концентрации имазамокса в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", 10583-76 "Рапс. Требования при заготовках и поставках", 52062-2003 "Масло растительное. Правила приемки и методы отбора проб", 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в темноте.

Перед анализом образцы семян измельчают.

9. Выполнение определения

9.1. Семена рапса

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 400 куб. см на шлифе, добавляют 200 куб. см смеси для экстракции (метанол - 0,025 N раствор соляной кислоты, 60:40, по объему), приготовленной по п. 7.4, интенсивно перемешивают в течение 5 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 25 куб. см метанола. Отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г семян (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают окислением, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на концентрирующих патронах Sep Pak Silica по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1, с помощью 30 куб. см деионизованной воды переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см 4 N серной кислоты, доводя рН до 1 - 2 (контроль по индикаторной бумаге).

Добавляют в воронку 15 куб. см 0,1%-ного водного раствора марганцовокислого калия, встряхивают 1 мин. Затем в делительную воронку с водным раствором вносят 15 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой безводного (около 1 см) сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку. Экстракцию имазамокса повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 15, затем 10 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенный дихлорметановый экстракт, пропущенный через слой сульфата натрия, упаривают до объема 10 - 15 куб. см и дополнительно очищают на концентрирующем патроне Sep Pak Silica по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта семян рапса на концентрирующих патронах Sep Pak Silica

Полученный по п. 9.1.2 раствор вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.11) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. Колбу ополаскивают 2 куб. см хлористого метилена, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси хлористый метилен - этилацетат (1:1, по объему), затем 5 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 15 куб. см 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате, собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 40 °С досуха. Остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, и анализируют содержание имазамокса по п. 9.3.1 или 9.3.2.

9.2. Масло

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, растворяют в 100 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси для экстракции (смесь ацетонитрил - вода, 1:1, с добавлением 2% ледяной уксусной кислоты), приготовленной по п. 7.5. Воронку интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, доливают водой до 200 куб. см. Раствор перемешивают и помещают в холодильник (4 - 6 °С) на 20 - 30 мин. (раствор при этом мутнеет). Измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г масла (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают на концентрирующих патронах С18 Sep Pak по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах С18 Sep Pak

Раствор в колбе, полученный по п. 9.2.1, вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.12.1, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты, элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 9 куб. см 25%-ного раствора метанола в 0,05 М растворе уксуснокислого аммония (приготовленного по п. 7.7), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают его при температуре не выше 40 °С до объема около 3 куб. см.

Полученный раствор вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.12.2. Колбу ополаскивают дважды по 1 куб. см деионизованной воды, растворы также вносят на патрон. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

Промывают патрон 3 куб. см деионизованной воды, затем 3 куб. см гексана. Гексан продавливают до нижнего края сорбента. Элюаты отбрасывают. Имазамокс элюируют с патрона 15 куб. см хлористого метилена, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2), центрифугируют (фильтруют через слой стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку) и анализируют содержание имазамокса по п. 9.3.1 или 9.3.2.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Рабочая длина волны: 240 нм и 254 нм <*>.

--------------------------------

<*> Хроматографирование пробы при 2-х длинах волн увеличивает надежность идентификации вещества.

9.3.1. Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB С18, зернение 5 мкм

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-ная орто-фосфорная кислота (20:80, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода имазамокса: 7,0 - 7,2 мин.

9.3.2. Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С8 зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - орто-фосфорная кислота (18:72:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода имазамокса: 14,4 - 14,8 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в mAU х сек.), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию имазамокса в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.13.1 или 7.13.2, не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание имазамокса в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

                                  С х К х V
                              Х = ---------,
                                      m

С - концентрация имазамокса, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

К = 5 с учетом объема экстракта, взятого для анализа.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                         2 х |Х  - Х | х 100
                               1    2
                         ------------------- <= r,                      (1)
                              (Х  + Х )
                                1    2

    где:
    Х , Х  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2
    r - значение предела повторяемости (табл. 1), при  этом r = 2,8 сигма .
                                                                         r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

              _
             (Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,

    где:
    _
    Х   -   среднее   арифметическое  результатов  определений,  признанных
приемлемыми, мг/кг;
    ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

                        ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

    где дельта - граница  относительной  погрешности  методики  (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание имазамокса в пробе менее 0,1 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,1 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

    Величина добавки С  должна удовлетворять условию:
                      д

                       С  >= ДЕЛЬТА  _ + ДЕЛЬТА  _ ,
                        д          л,Х         л,Х'

    где    +/- ДЕЛЬТА  _ (+/- ДЕЛЬТА  _ )  -   характеристика   погрешности
                     л,Х            л,Х'
(абсолютная погрешность) результатов  анализа,  соответствующая  содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному  значению содержания компонента
в образце с добавкой), мг/кг, при этом:

                        ДЕЛЬТА  = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
                              л

    где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

                        ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

    где дельта - граница  относительной  погрешности  методики  (показатель
точности в соответствии с диапазоном определяемых  концентраций,  табл. 1),
%.
    Контрольный параметр процедуры (К ) рассчитывают по формуле:
                                     к

                                  _    _
                             К  = Х' - Х - С ,
                              к             д

          _    _
    где   Х',  Х,   С  - среднее  арифметическое  результатов  параллельных
                     д
определений  (признанных  приемлемыми   по   п. 11) содержания компонента в
образце    с    добавкой,    испытуемом   образце,   концентрация   добавки
соответственно, мг/кг.
    Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                              _____________________
                             /     2            2
                       К = \/ДЕЛЬТА  _  + ДЕЛЬТА  _.
                                   л,Х'         л,Х

    Проводят  сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
                                                            к
контроля (К).
    Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                                |К | <= К,                              (2)
                                  к

    процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                         2 х |Х  - Х | х 100
                               1    2
                         ------------------- <= R,                      (3)
                              (Х  + Х )
                                1    2

    где:
    Х , Х  - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
     1   2
    R - предел воспроизводимости (в соответствии с  диапазоном определяемых
концентраций, табл. 1), %.

14. Разработчики

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: