МУК 4.1.2689-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
2 августа 2010 года

Дата введения:
1 октября 2010 года

1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в ягодах и соке винограда массовой концентрации диметоморфа в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Действующее вещество: Диметоморф.

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса: 387,9.

    Брутто формула: C  H  ClNO .
                     21 22    4

(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC)

(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)-1-оксо-2-пропенил]морфолин (CAS).

    Смесь  изомеров  представляет собой бесцветные кристаллы с температурой
плавления  125,2  -  149,2  °C.   (E)-изомер  имеет  температуру  плавления
                                          -4
136,8 - 138,3 °C, давлением паров 9,7 x 10   мРа (25 °C). (Z)-изомер  имеет
                                                                     -3
температуру  плавления  166,3 - 168,5 °C,  давлением  паров  1,0 x 10   мРа
(25 °C).
    Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K   lg P = 2,63  для
                                                        ow
(E)-изомера;  2,73  для  (Z)-изомера  (20 °C).  Растворимость  в  воде 81,1
(pH 5), 49,2 (pH 7), 41,8 (pH 9) (мг/куб. дм, 20 °C).

Растворимость в органических растворителях (мг/куб. дм, 20 °C): н-гексан - 0,11; толуол - 49,5; дихлорметан - 461; метанол - 39; ацетон - 100; этилацетат - 48,3.

Гидролитически и термически стабилен в нормальных условиях. (E)- и (Z)-изомер переходят друг в друга на свету.

    Краткая токсикологическая характеристика: LD    для  крыс  3500 - 4300,
                                                50
мышей  3700  -  5000  мг/кг.  Острая  кожная  активность  для  крыс  LD   >
                                                                       50
5000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз (кролики). Ингаляционная активность
LC   > 4,2 мг/куб. дм. LD   для пчел > 100 мкг/особь.
  50                     50

Область применения: локальный системный фунгицид, ингибитор образования клеточной стенки грибного оомицета, ингибитор роста и спороношения грибов.

Гигиенические нормативы: ВМДУ диметоморфа в винограде 0,5 мг/кг.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

--------+-------------+--------------+-----------------+--------+----------
¦Объект ¦  Диапазон   ¦Норматив точ- ¦Показатель       ¦Предел  ¦Предел   ¦
¦анализа¦определяемых ¦ности (границы¦повторяемости    ¦повторя-¦воспроиз-¦
¦       ¦концентраций,¦относительной ¦(относительное   ¦емости, ¦водимос- ¦
¦       ¦    мг/кг    ¦погрешности), ¦среднеквадрати-  ¦r, %    ¦ти, R, % ¦
¦       ¦(мг/куб. дм) ¦+/- дельта, % ¦ческое отклонение¦        ¦         ¦
¦       ¦             ¦              ¦повторяемости,   ¦        ¦         ¦
¦       ¦             ¦              ¦сигма , %        ¦        ¦         ¦
¦       ¦             ¦              ¦     r           ¦        ¦         ¦
+-------+-------------+--------------+-----------------+--------+---------+
¦Ягоды  ¦0,01 - 0,10  ¦<= 50         ¦6                ¦16,6    ¦28       ¦
¦вино-  ¦             ¦              ¦                 ¦        ¦         ¦
¦града  ¦             ¦              ¦                 ¦        ¦         ¦
+-------+-------------+--------------+-----------------+--------+---------+
¦Вино-  ¦0,01 - 0,10  ¦<= 50         ¦7                ¦19,4    ¦28       ¦
¦градный¦             ¦              ¦                 ¦        ¦         ¦
¦сок    ¦             ¦              ¦                 ¦        ¦         ¦
--------+-------------+--------------+-----------------+--------+----------

Таблица 2

ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДИМЕТОМОРФА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ, ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ n = 20, P = 0,95

----------+-------+-------------+------------+-----------+-----------------
¦Анализи- ¦Предел ¦  Диапазон   ¦  Среднее   ¦Стандартное¦Доверительный   ¦
¦руемый   ¦обнару-¦определяемых ¦  значение  ¦отклонение,¦интервал сред-  ¦
¦объект   ¦жения, ¦концентраций,¦определения,¦   S, %    ¦него результата,¦
¦         ¦мг/кг  ¦    мг/кг    ¦     %      ¦           ¦+/-, %          ¦
+---------+-------+-------------+------------+-----------+----------------+
¦Ягоды    ¦0,01   ¦0,01 - 0,10  ¦88,7        ¦7,5        ¦15              ¦
¦винограда¦       ¦             ¦            ¦           ¦                ¦
+---------+-------+-------------+------------+-----------+----------------+
¦Виноград-¦0,01   ¦0,01 - 0,10  ¦84,8        ¦7,7        ¦15,5            ¦
¦ный сок  ¦       ¦             ¦            ¦           ¦                ¦
----------+-------+-------------+------------+-----------+-----------------

2. Метод измерения

Методика основана на определении диметоморфа методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз, и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Идентификация диметоморфа проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерения

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с
быстросканирующим УФ детектором, снабженным дегазатором,
автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200                                  ГОСТ 24104-2001

Весы технические ВЛКТ-500                                   ГОСТ 24104-80
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100 куб. см                     ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема
от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Пипетки градуированные                                      ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см                         ГОСТ 23932-90

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы и материалы

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч.                    ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная, деионизированная                   ГОСТ 6709-79
Диметоморф с содержанием основного компонента 99,7%
(Shell Research Limited)
Кислота ортофосфорная, х.ч.                                 ГОСТ 6552-80
Кислота уксусная, ледяная                                   ГОСТ 61-69
Магний сернокислый безводный, х.ч.                          ГОСТ 4523-67
Натрий уксуснокислый, ч.                                    ГОСТ 199-68
Силикагель, Merck 1.09385.1000
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М
H PO  в соотношении 50:50
 3  4

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18
(100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Аппарат для встряхивания
Воронки лабораторные В-75-110                              ГОСТ 25336-82
Бидистиллятор
Концентрирующие патроны Диапак C16 (БиоХимМак)
Пробирки с притертыми пробками на 10, 20 куб. см           ГОСТ 25336-82
Фильтры бумажные "красная лента"                           ТУ 6.091678-86
Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2                                     ТУ 5.375-4261-76
Шприц медицинский с разъемом Льюера                        ГОСТ 22090

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3. Приготовление основного и градуированных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску диметоморфа (50 +/- 0,5 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем ацетонитрилом до метки).

Градуировочные растворы с концентрациями 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см пипеткой вносят 1 куб. см основного раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (5 мкг/куб. см). Затем 10 куб. см полученного раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 100 куб. см и вновь доводят до метки раствором подвижной фазы (0,5 мкг/куб. см). После этого в мерную колбу на 100 куб. см вносят 20 куб. см полученного после второго разбавления раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (0,1 мгк/куб. см).

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 50 куб. см раствора N 1 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,02 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 40 куб. см раствора N 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,01 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 20 куб. см раствора N 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества. Например, раствор внесения с концентрацией диметоморфа 0,1 мкг/куб. см готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом аналогично п. 7.3.2.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация диметоморфа в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диметоморфа в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K x S,

где S - площадь пика градуировочного раствора. Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не хуже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

                      |C - C |
                            к
                      -------- x 100 <= лямбда      ,
                         C                    контр.

    где:
    C -  аттестованное  значение   массовой   концентрации  диметоморфа   в
градуировочном растворе;
    C    -   результат   контрольного   измерения   массовой   концентрации
     к
диметоморфа в градуировочном растворе;
    лямбда        -  норматив  контроля  градуировочного  коэффициента,  %.
          контр.
(лямбда       = 10% при P = 0,95).
       контр.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение недели.

9. Проведение определения

9.1. Определение диметоморфа в виноградном соке

Перед проведением анализа пробу отфильтрованного через бумажный фильтр виноградного сока объемом 10 +/- 0,05 куб. см пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16. Фильтрат отбрасывают. Диметоморф элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрила и воды в соотношении 4:1. Элюат собирают, переносят в тефлоновую центрифужную пробирку и дальнейшую обработку проводят по п. 9.2.

9.2 Определение диметоморфа в ягодах винограда

Гомогенизированные пробы ягод винограда массой 10 +/- 0,1 г помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания E-диметоморфа 3,2 +/- 0,1 мин.

Время удерживания Z-диметоморфа 4,5 +/- 0,1 мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,01 - 0,1 мкг/куб. см.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                               x    x
                             (S  + S ) x K x V
                               1    2
                         X = ----------------- x f,
                                     P

    где:
      x    x
    (S  + S ) - сумма площадей пиков изомеров диметоморфа  в  анализируемой
      1    2
пробе, кв. мм (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения градуировочной зависимости (мкг/куб. см : кв. мм);

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г, для виноградного сока - объем в куб. см;

f - коэффициент извлечения диметоморфа = 100 / полноту определения (приведенную в табл. 2, например, для ягод винограда 100 / 88,7 = 1,13).

Содержание остаточных количеств диметоморфа в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диметоморфа 0,1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Оценка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1).

                         2 x |X  - X | x 100
                               1    2
                         ------------------- <= r,
                              (X  + X )
                                1    2

    где:
    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2
    r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
                                                     r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

               _
              (X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,

    где:
    _
    X -  среднее   арифметическое   результатов   определений,   признанных
приемлемыми, мг/кг;
    ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения диметоморфа в винограде.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

    Величина добавки C  должна удовлетворять условию:
                      д

                       C  = ДЕЛЬТА    + ДЕЛЬТА    ,
                        д         л,X         л,X'

    где  +/- ДЕЛЬТА     (+/- ДЕЛЬТА    )   -   характеристика   погрешности
                   л,X             л,X'
(абсолютная погрешность)  результатов  анализа,  соответствующая содержанию
компонента  в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в  образце с добавкой), мг/кг, при этом:

                         ДЕЛЬТА  = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
                               л

    где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

                        ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

    дельта  -  граница  относительной   погрешности   методики  (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
    Результат контроля процедуры (К ) рассчитывают по формуле:
                                   к

                             К  = X' - X - C ,
                              к             д

    где X', X, C   -  среднее   арифметическое   результатов   параллельных
                д
определений  (признанных  приемлемыми  по п. 11)  содержания  компонента  в
образце    с    добавкой,   испытуемом   образце,   концентрация   добавки,
соответственно, мг/кг.
    Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                              _____________________
                             /     2            2
                       К = \/ДЕЛЬТА     + ДЕЛЬТА   .                    (1)
                                   л,X'         л,X

    Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К )  с нормативом
                                                           к
контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                                 |К | <= К,                             (2)
                                   к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                         2 x |X  - X | x 100
                               1    2
                         ------------------- <= R,                      (3)
                              (X  + X )
                                1    2

    где:
    X , X  - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
     1   2
    R   -   предел   воспроизводимости   (в   соответствии   с   диапазоном
концентраций), %.

14. Разработчики

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте: