- Законы
- Кодексы
- Форум
МУК 4.1.2764-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение метрибузина в биологических средах экспериментальных животных (почках, печени, головном мозге, семенниках, моче, кале) методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
17 ноября 2010 года
Дата введения:
17 декабря 2010 года
1. Методические указания разработаны ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора".
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).
3. Введены впервые.
Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций метрибузина в биологических средах экспериментальных животных в диапазонах 0,004 - 0,04 мг/кг (почки, печень, семенники, кал), 0,01 - 0,1 мг/кг (головной мозг) и 0,001 - 0,01 мг/куб. дм (моча).
Метрибузин
4-амино-6-трет-бутил-4,5-дигидро-3-метилтио-1,2,4-триазин-5-он (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H N OS.
8 14 4
Мол. масса 214,3.
Белое кристаллическое вещество со слабым характерным запахом.
Температура плавления 126,2 °С. Плотность 1,28 (20 °С). Давление паров:
0,058 мПа (при 20 °С). Коэффициент распределения н-октанол/вода (при pH 5,5
и 20 °С): K log P = 1,6. Растворимость в органических растворителях при
ow
20 °С (г/куб. дм): диметилформамид - 1780, циклогексанон - 1000, хлороформ
- 850, ацетон - 820, метанол - 450, дихлорметан - 340, бензол - 220,
н-бутанол - 150, этанол - 190, толуол - 87, ксилол - 90, изопропанол - 77,
гексан - 1,0. Растворимость в воде при 20 °С: 1,05 г/куб. дм.
Метрибузин при 20 °С стабилен в разбавленных кислотах и щелочах; DT
50
(37 °С) - 6,7 часа (pH 1,2); DT (70 °С) - 569 часов (pH 4); 47 дней (pH
50
7), 191 час (pH 9).
Подвержен быстрой деградации в воде на свету (DT - менее 1 дня). На
50
поверхности почвы при естественном облучении DT - 14 - 15 дней.
50
Область применения
Метрибузин - избирательный системный гербицид класса 1,2,4-триазинона, ингибирует фотосинтез. В растения проникает через корни и листья.
Препараты на основе метрибузина могут представлять собой стандартные суспензии (с размером частиц более 2 мкм), а также наноформы, образующие водные системы с размером частиц менее 0,1 мкм.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Таблица 1
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ
---------+--------------+---------------+-------------+--------+----------- ¦Анализи-¦ Диапазон ¦Показатель точ-¦Стандартное ¦Предел ¦Предел ¦ ¦руемый ¦ определяемых ¦ности (граница ¦отклонение ¦повторя-¦воспроиз- ¦ ¦объект ¦концентраций, ¦относительной ¦повторяемос- ¦емости, ¦водимости,¦ ¦ ¦ мг/кг ¦погрешности), ¦ти, сигма , %¦r, % ¦R, % ¦ ¦ ¦ (куб. дм) ¦+/- дельта, %, ¦ r ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦P = 0,95 ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Почки ¦от 0,004 до ¦100 ¦4,5 ¦13 ¦15 ¦ ¦ ¦0,008 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦ ¦свыше 0,008 до¦50 ¦4,9 ¦14 ¦17 ¦ ¦ ¦0,04 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Печень ¦от 0,004 до ¦100 ¦5,0 ¦14 ¦17 ¦ ¦ ¦0,008 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦ ¦свыше 0,008 до¦50 ¦5,2 ¦15 ¦19 ¦ ¦ ¦0,04 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Головной¦от 0,01 до ¦50 ¦4,5 ¦13 ¦15 ¦ ¦мозг ¦0,1 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Семенни-¦от 0,004 до ¦100 ¦4,9 ¦14 ¦17 ¦ ¦ки ¦0,008 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦ ¦свыше 0,008 до¦50 ¦4,8 ¦13 ¦15 ¦ ¦ ¦0,04 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Моча ¦от 0,001 до ¦100 ¦4,9 ¦14 ¦17 ¦ ¦ ¦0,01 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦Кал ¦от 0,004 до ¦100 ¦3,9 ¦11 ¦13 ¦ ¦ ¦0,008 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------+---------------+-------------+--------+----------+ ¦ ¦свыше 0,008 до¦50 ¦4,0 ¦11 ¦13 ¦ ¦ ¦0,04 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ---------+--------------+---------------+-------------+--------+-----------
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
Таблица 2
---------+----------------------------------------------------------------- ¦Анализи-¦ Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 ¦ ¦руемый +---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦объект ¦предел ¦ диапазон ¦ полнота ¦стандартное¦ доверительный ¦ ¦ ¦обнаруже-¦определяемых ¦извлечения¦отклонение,¦интервал среднего¦ ¦ ¦ния, ¦концентраций,¦ вещества,¦ S, % ¦результата, +/-, ¦ ¦ ¦мг/кг ¦ мг/кг ¦ % ¦ ¦ % ¦ ¦ ¦(куб. дм)¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Почки ¦0,004 ¦0,004 - 0,04 ¦79,8 ¦5,5 ¦2,9 ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Печень ¦0,004 ¦0,004 - 0,04 ¦81,3 ¦5,0 ¦2,7 ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Головной¦0,01 ¦0,01 - 0,1 ¦81,7 ¦4,2 ¦2,2 ¦ ¦мозг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Семенни-¦0,004 ¦0,004 - 0,04 ¦81,8 ¦4,5 ¦2,4 ¦ ¦ки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Моча ¦0,001 ¦0,001 - 0,01 ¦81,4 ¦4,9 ¦2,6 ¦ +--------+---------+-------------+----------+-----------+-----------------+ ¦Кал ¦0,004 ¦0,004 - 0,04 ¦83,1 ¦3,2 ¦1,7 ¦ ---------+---------+-------------+----------+-----------+------------------
2. Метод измерений
Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным (ТИД) и электронозахватным (ЭЗД) детекторами после экстракции из анализируемых проб биологических сред ацетонитрилом, последовательной очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, окислением марганцовокислым калием в щелочной среде, затем на концентрирующих патронах Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Газовый хроматограф "Кристалл-2000М",
снабженный электронозахватным и
термоионным детектором с пределом
детектирования соответственно по линдану
-14
3,5 - 10 г/с и азоту в азобензоле
-14
3,0 х 10 гР/с предназначенный для
работы с капиллярной колонкой Номер Госреестра 14516-08
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные общего назначения, с
наибольшим пределом взвешивания до 500 г и
пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные 2-100-2, 2-500-2 ГОСТ 1770-74
Меры массы ГОСТ 7328-2001
Микрошприц SGE-Cromatec вместимостью
10 куб. мм Номер Госреестра 39206-08
Пипетки градуированные 2-го класса
точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0;
10 куб. см ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности
вместимостью 25, 50, 100, 250 и 500 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Метрибузин, государственный стандартный образец с содержанием действующего вещества 99,7%, относительная погрешность аттестованного значения +/- 0,3% ГСО 7713-99 Азот газообразный нулевой, марка А (99,999%), в баллонах ТУ 6-21-39-96 Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ 6-09-3534-87 Вода деионизованная ГОСТ 6709-72 н-Гексан, для ВЭЖХ ТУ 6-09-06-657-84 Калий гидроокись (гидроксид калия), осч ГОСТ 24363-80 Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч ГОСТ 20490-75 Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч, прокаленный ГОСТ 4221-76 Кальций хлористый (хлорид кальция), хч, насыщенный водный раствор ГОСТ 450-77 Кислота серная концентрированная, хч ГОСТ 4204-77 Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794-80 Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995-77 Натрий сернокислый (сульфат натрия) безводный, хч ГОСТ 4166-76 Натрий углекислый (карбонат натрия), хч ГОСТ 83-79 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77 Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) ТУ 6-09-4173-85 Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч ГОСТ 22300-76
Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами) ГОСТ 25336-82 Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария) Бумажные фильтры "красная лента" обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ ТУ 2642-001-05015242-07 Воронки делительные вместимостью 250 и 1000 куб. см ГОСТ 9737-93 Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС и В-56-80 ХС ГОСТ 25336-82 Генератор водорода, исполнение 6.140 (СКБ "Хроматэк", Россия) Груша резиновая ТУ 9398-05-0576-9082-2003 Колбы конические (плоскодонные) вместимостью 100 - 150, 200 - 250 и 500 куб. см ГОСТ 23932-90 Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 150 и 250 куб. см ГОСТ 9737-93 Компрессор (СКБ "Хроматэк", Россия) Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82 Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82 Стекловата Стеклянные палочки Патроны для твердофазной экстракции С18 Sep Pak, Classik (Waters, США), масса сорбента 360 мг Патроны для твердофазной экстракции Sep Pak Silica (Waters, США), объем сорбента 2 куб. см Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок 30 Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария Сосуды для гомогенизации тканей стеклянные с плунжером вместимостью 15 куб. см типа BBI-8540802 (фирма "Sartorius AG", Германия) Стеклянные или полипропиленовые емкости вместимостью 100 куб. см с герметичной крышкой (для хранения биопроб) Установка для перегонки растворителей с дефлегматором ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75) Холодильник с морозильной камерой бытовой Хроматографическая колонка DB-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм Хроматографическая колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм Шприцы медицинские с разъемом Льюера вместимостью 5 и 10 куб. см
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на газовом хроматографе.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1. Ацетонитрил
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).
7.1.2. Гексан
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат
Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в деионизованной воде, доводят водой до метки, перемешивают.
Хлористый метилен (этилацетат) промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.2. Приготовление раствора калия гидроксида с молярной концентрацией 2 моль/куб. дм (2 М раствор)
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (56 +/- 0,1) г гидроксида калия, растворяют в 250 - 300 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, перемешивают.
7.3. Приготовление раствора марганцовокислого калия с массовой долей 0,1%
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (0,5 +/- 0,01) г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в темном месте.
7.4. Приготовление гексана, насыщенного ацетонитрилом
В коническую колбу вместимостью 500 куб. см с притертой пробкой помещают 250 куб. см гексана, вносят (10 +/- 1) куб. см ацетонитрила, перемешивают в течение 5 мин. Хранят в темном месте.
7.5. Приготовление смесей гексан - этилацетат для очистки экстракта на патроне Sep Pak Silica
7.5.1. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.5.2. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.5.3. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.6. Приготовление смеси ацетонитрил - вода (объемное соотношение 3:7) для очистки экстракта на патроне С18 Sep Pak
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 30 куб. см ацетонитрила и 70 куб. см деионизованной воды, перемешивают.
7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep Pak Silica
Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.
Концентрирующий патрон промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, последовательно 3 куб. см метанола, 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему), 5 куб. см гексана со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патрон готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.
7.8. Подготовка концентрирующего патрона С18 Sep Pak
Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду, затем 10 куб. см деионизованной воды.
Патрон готовят непосредственно перед использованием.
7.9. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения
7.9.1. Исходный раствор метрибузина для градуировки (массовая концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г метрибузина, растворяют в 50 - 70 куб. см этилацетата, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 2-х месяцев.
Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.
7.9.2. Раствор N 1 метрибузина для градуировки (массовая концентрация 10 мкг/куб. см).
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора метрибузина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике не более месяца.
7.9.3. Рабочие растворы N 2 - 5 метрибузина для градуировки и внесения (массовая концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 метрибузина с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят до метки этилацетатом, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией метрибузина 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.
Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".
7.10. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мВ х с) от концентрации метрибузина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5 (п. 7.9.3).
В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков (в мВ х с) метрибузина.
По полученным данным строят градуировочную характеристику.
Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
8. Отбор и хранение проб
Пробы органов, тканей, кала и мочи отбирают в лабораторных условиях, герметично упаковывают в полипропиленовые или стеклянные емкости с притертыми крышками, замораживают и хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °С.
Непосредственно перед анализом образцы органов, тканей, а также кала тщательно измельчают с использованием гомогенизатора.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция
9.1.1. Печень, почки, семенники, головной мозг, кал
Образец печени, почек, семенников и кала массой 5 г, головного мозга массой 2 г гомогенизируют в сосуде для гомогенизации с порцией ацетонитрила объемом 5 - 7 куб. см. Гомогенизированный образец с порциями ацетонитрила по 10 - 15 куб. см переносят в коническую колбу вместимостью 100 - 150 куб. см (общий объем ацетонитрила с учетом растворителя, взятого для гомогенизации и обмыва сосуда для гомогенизации, - 70 куб. см), дополнительно тщательно перемешивают и помещают на 1 ч в холодильник (4 - 6 °С). Затем надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила, предварительно ополоснув растворителем колбу, в которой находилась проба, объединяя фильтрат с основной порцией в делительной воронке. Затем в делительную воронку вносят 20 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 - 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитрилом, объемом 20 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 - 40 °С до объема около 20 куб. см, внимательно следя за процессом, не допуская переброса жидкости при вспенивании, и очищают по п. 9.2.
9.1.2. Моча
Пробу мочи объемом 20 куб. см помещают в коническую колбу вместимостью 100 - 150 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник (4 - 6 °С). Затем раствор осторожно переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, после полного расслаивания нижний водный слой отделяют и отбрасывают. В делительную воронку вносят 10 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 - 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитролом, объемом 10 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 - 40 °С до объема около 20 куб. см и очищают по п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта
9.2.1. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и окислением
Остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, с помощью 80 куб. см деионизованной воды переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см насыщенного раствора натрия хлористого, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник или на 15 мин. в морозильную камеру. Затем в воронку вносят 2 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 50 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Экстракцию метрибузина повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 20 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.
В делительную воронку, содержащую объединенные дихлорметановые экстракты, вносят 10 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 5 куб. см 0,1%-ного раствора марганцовокислого калия (при анализе печени объем раствора марганцовокислого калия увеличивают до 6 куб. см), интенсивно встряхивают в течение 3-х мин. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой (около 1 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусную воронку диаметром 56 мм. Сульфат натрия на фильтре промывают дополнительной порцией дихлорметана объемом 10 куб. см. Верхний водный слой отбрасывают.
Объединенные экстракт и промывку, пропущенные через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне Sep Pak Silica проводят по п. 9.2.2.
9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep Pak Silica
Остаток в колбе, полученный после упаривания по п. 9.2.1, растворяют в 5 куб. см гексана, помещая на 30 - 40 с на ультразвуковую баню, и вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.7) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. Колбу ополаскивают 5 куб. см гексана, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 10 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 35 °С досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, вносят 9 куб. см деионизованной воды, помещают на ультразвуковую баню на 45 - 60 с. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне С18 Sep Pak проводят по п. 9.2.3.
9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне С18 Sep Pak
Раствор в колбе, полученный по п. 9.2.2, вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Патрон дополнительно промывают (скорость 2 капли в секунду) 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 3:7 (по объему), также собирая элюат в круглодонную колбу. Объединенный элюат упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, для полного удаления следов влаги вносят в колбу порцию ацетонитрила (5 - 7 куб. см) и вновь упаривают.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата и анализируют содержание метрибузина по п. п. 9.3.1 или 9.3.2.
9.3. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
9.3.1. Хроматограф газовый, снабженный термоионным детектором.
Колонка капиллярная DB-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.
Температура детектора: 350 °С;
испарителя: 300 °С.
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 220 °С, выдержка 5 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 2 мин.).
Скорость воздуха 200 куб. см/мин.; водорода 10,5 куб. см/мин.; газа 3 (азот) 30 куб. см/мин.
Скорость газа 1 (азот): 35,544 см/с, давление 120 кПа, поток 1,393 куб. см/мин., деление потока 1:5.
Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.
Ориентировочное время удерживания метрибузина: ~ 12,5 мин.
9.3.2. Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором.
Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.
Температура детектора: 300 °С;
испарителя: 280 °С.
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 80 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 230 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 1 мин.).
Скорость газа 1 (азот): 35,971 куб. см/с, давление 70 кПа, поток 2,015 куб. см/мин.
Деление потока 1:2,9.
Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.
Ориентировочное время выхода метрибузина: ~ 16,9 мин.
Линейный диапазон детектирования: 0,01 - 0,1 нг.
Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мВ х с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию метрибузина в хроматографируемом растворе.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с массовой концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом не более чем в 50 раз. При расчете содержания метрибузина учитывают разбавление.
10. Обработка результатов анализа
Содержание метрибузина в пробе (X, мг/кг, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:
C х V
X = -----,
m
где:
C - концентрация метрибузина, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса (объем) анализируемого образца, г (куб. см).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг (куб. дм);
1 2
r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма .
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела
повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг (куб. дм) при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг (куб. дм);
ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта х X
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
"содержание метрибузина в пробе печени, почек, семенников, кала менее 0,004 мг/кг; головного мозга - менее 0,01 мг/кг; мочи - менее 0,001 мг/куб. дм" <*>.
--------------------------------
<*> 0,004 мг/кг - предел обнаружения в печени, почках, семенниках, кале; 0,01 мг/кг - головном мозге; 0,001 мг/куб. дм - моче.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию:
д
C >= ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ ,
д л,X л,X'
где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности
л,X л,X'
(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания
компонента в образце с добавкой), мг/кг (куб. дм), при этом:
ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
л
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта х X
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - граница относительной погрешности методики
(показатель точности в соответствии с диапазоном определяемых
концентраций, табл. 1), %.
Контрольный параметр процедуры (К ) рассчитывают по формуле:
к
_ _
К = X' - X - C ,
к д
_ _
где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в
образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки
соответственно, мг/кг (куб. дм);
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2
К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _.
л,X' л,X
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
|К | <= К, (2)
к
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг
1 2
(куб. дм);
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном определяемых
концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное