Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 30.11.2007 N 80
О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО
Я, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г. Онищенко, проанализировав материалы государственного надзора за выполнением обязательных требований при обороте пищевых продуктов, содержащих компоненты, полученные с применением генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО), отмечаю.
В Российской Федерации с 1996 года разработана и функционирует законодательная, нормативная и методическая база, позволяющая осуществлять оценку безопасности, и организован мониторинг за оборотом пищевой продукции, полученной из ГМО. Действующая система в значительной степени гармонизирована с требованиями международных организаций и Европейского союза.
За период с 1996 по 2007 год в мире площади посевов генетически модифицированных культур возросли в 60 раз, достигнув более 110 млн. га. В настоящее время разрешено к применению в разных странах более 120 видов трансгенных растений, в том числе 86 - в Европе.
В Российской Федерации за эти годы прошли полный цикл исследований 17 видов генетически модифицированных культур. На 30.11.2007 на территории Российской Федерации действуют санитарно-эпидемиологические заключения и свидетельства о государственной регистрации на 12 видов пищевой продукции растительного происхождения, полученных с применением трансгенных технологий: 6 сортов кукурузы, 4 сорта картофеля, 1 сорт риса и 1 сорт сахарной свеклы.
В мире существуют разные подходы к этикетированию пищевых продуктов, полученных из ГМО. В США, Канаде, Аргентине данные продукты не этикетируются, в странах ЕЭС принят 0,9% пороговый уровень, в странах Японии, Австралии - 5%. При этом введение порогового уровня содержания ГМО, при котором необходимо этикетировать пищевые продукты, не связано с вопросом их безопасности, а преследует цели информирования населения об использовании технологии получения пищевых продуктов.
С 12 декабря 2007 года вступает в силу Федеральный закон от 25.10.2007 N 234-ФЗ "О внесении изменений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" и часть вторую Гражданского кодекса Российской Федерации" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2007, N 44, ст. 5282), в котором подпунктом а) пункта 3 статьи 1 в абзац третий пункта 2 статьи 10 Закона Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 "О защите прав потребителей" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1996, N 3, ст. 140) внесено дополнение об обязательном наличии в отношении продуктов питания информации о наличии в них компонентов, полученных с ГМО, в случае, если содержание указанных организмов в таком компоненте составляет более 0,9%.
Таким образом, с учетом объективной необходимости определения порядка соответствующего этикетирования пищевых продуктов, полученных из ГМО, как формы реализации права потребителя на своевременное получение необходимой и достоверной информации о составе пищевых продуктов, обеспечивающей возможность их правильного выбора, Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 "О защите прав потребителей" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1996, N 3, ст. 140) был гармонизирован с требованиями Европейского союза по этикетированию пищевых продуктов, полученных из ГМО, установленными Директивой Европейского Парламента и Совета от 22.09.2003 N 1829/2003 о генетически модифицированной пище и кормах, которая с апреля 2004 г. ввела в странах Европейского союза 0,9% пороговый уровень для этикетирования пищевых продуктов, полученных из ГМО.
Ранее аналогичный показатель был закреплен санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.2227-07 "Дополнения и изменения N 5 к санитарно-эпидемиологическим правилам СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" (зарегистрированы в Минюсте России 16.06.2007, регистрационный номер 9852), установившими с 01.09.2007, что содержание в пищевых продуктах 0,9% и менее компонентов, полученных с применением ГМО, является случайной или технически неустранимой примесью и пищевые продукты, содержащие указанное количество таких компонентов, не относятся к категории пищевых продуктов, содержащих компоненты, полученные с применением ГМО.
Система оценки безопасности пищевых продуктов, полученных из ГМО, включает проведение пострегистрационного мониторинга за ее оборотом, для осуществления которого разработаны методы идентификации ГМО в пищевых продуктах.
В системе Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации имеется лабораторная база по исследованию пищевых продуктов на наличие ГМО. Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМО" (по заключению Минюста России от 18.02.2005 N 01/1203-ВЯ данное Постановление не нуждается в государственной регистрации) определены головные центры по количественному исследованию пищевых продуктов на наличие ГМО в каждом федеральном округе.
За 9 месяцев 2007 г. учреждениями Роспотребнадзора на наличие компонентов, полученных с применением ГМО, исследовано 29816 проб (2006 г. - 37879, 2005 г. - 18872, 2004 г. - 12956, 2003 г. - 4300) продовольственного сырья и пищевых продуктов. Из них компоненты ГМО содержали 652 пробы (2006 г. - 1452, 2005 г. - 1443, 2004 г. - 1552, 2003 г. - 511), что составило 2,2% (2006 г. - 2,7%, 2005 г. - 7,6%, 2004 г. - 12%, 2003 г. - 11,9%). Наиболее часто ГМО встречаются в мясных продуктах - 3,8% (2006 г. - 6,6%, 2005 г. - 15,8%, 2004 г. - 20,5%, 2003 г. - 14,8%), птицеводческих продуктах - 5,6% (2006 г. - 3,8%, 2005 г. - 9,1%, 2004 г. - 15,43%, 2003 г. - 29,5%), группе продуктов "прочие" (в основном растительные белки) - 3,3% (2006 г. - 3,9%, 2005 г. - 10,8%, 2004 г. - 16,7%, 2003 г. - 16,4%). В 2007 г. увеличилась доля содержания компонентов ГМО в молочных продуктах (9 месяцев 2007 г. - 5,1%, 2006 г. - 1,3%).
Учреждениями Роспотребнадзора при исследовании пищевых продуктов количественным методом определения ГМО по предварительным данным выявлено, что оборот пищевых продуктов, содержащих компоненты ГМО более 0,9%, составляет менее 1% от оборота всех пищевых продуктов, однако 90% из них не имеют обязательной информации о наличии ГМО.
В связи с вышеизложенным, с целью усиления госсанэпиднадзора за пищевыми продуктами и в соответствии с Федеральным законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, N 14, ст. 1650; 2002, N 1 (ч. I), ст. 1; 2003, N 2, ст. 167; N 27 (ч. I), ст. 2700; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752; 2006, N 1, ст. 10; 2006, N 52 (ч. I), ст. 5498; 2007, N 1 (ч. I), ст. 21; 2007, N 1 (ч. I), ст. 29; 2007, N 27, ст. 3213, 2007, N 46, ст. 5554) и Федеральным законом от 01.01.2000 N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, N 2, ст. 150; 2002, N 1 (ч. I), ст. 2; 2003, N 2, ст. 167, N 27 (ч. I), ст. 2700; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752, N 50, ст. 5242; 2006, N 1, ст. 10, N 14, ст. 1458) постановляю:
1. Организациям, осуществляющим ввоз, производство и оборот пищевых продуктов, принять меры по обязательному доведению до потребителя информации о наличии в продуктах питания компонентов, полученных с применением ГМО, в случае, если их содержание составляет более 0,9%.
2. Утвердить методические указания:
2.1. МУ 2.3.2.2306-07 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения" (приложение 1);
2.2. МУК 4.2.2304-07 "Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения" (приложение 2);
2.3. МУК 4.2.2305-07 "Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией" (приложение 3).
3. Управлениям Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации и по железнодорожному транспорту:
3.1. Считать осуществление надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМО, приоритетным направлением деятельности на 2008 год;
3.2. Усилить государственный надзор за производством и оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО;
3.3. Обеспечить выполнение необходимых лабораторных исследований по исследованию пищевых продуктов, содержащих ГМО;
3.4. Осуществлять в средствах массовой информации и среди населения разъяснительную работу по вопросам безопасности пищевых продуктов, полученных из ГМО, и прав потребителей на получение полной и достоверной информации;
3.5. Доложить о проделанной работе до 01.04.2008.
4. Управлениям Роспотребнадзора по г. Москве, г. Санкт-Петербургу, Ростовской области, Нижегородской области, Свердловской области, Новосибирской области, Хабаровскому краю активизировать работу головных центров по количественному исследованию пищевых продуктов на наличие ГМО в федеральных округах.
5. ФГУЗ Центры гигиены и эпидемиологии принять меры по дооснащению лабораторных подразделений аналитическим оборудованием по исследованию количественного состава ГМО.
6. ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора до 01.03.2008 представить в Роспотребнадзор информацию о наличии в ФГУЗ "Центры гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации аналитического оборудования по качественному и количественному методам определения ГМО в пищевых продуктах и подготовке врачей-лаборантов.
7. Просить научно-исследовательские учреждения РАМН, РАН, РАСХН совместно с научно-исследовательскими учреждениями Роспотребнадзора уделять приоритетное внимание совершенствованию методов оценки безопасности и контроля за пищевой продукцией, содержащей ГМО.
8. Контроль за исполнением настоящего Постановления возложить на заместителя Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Л.П. Гульченко.
Г.Г.ОНИЩЕНКО
Приложение 1
Утверждено
Постановлением
Главного государственного
санитарного врача
Российской Федерации
от 30.11.2007 N 80
23.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Методические указания МУ 2.3.2.2306-07
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО).
1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются на этапе государственной регистрации ГМО, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.
1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО и др.).
II. ЭКСПЕРТНЫЙ АНАЛИЗ И ОЦЕНКА ДАННЫХ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ ЗАЯВЛЕННЫЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общая характеристика ГМО включает анализ информации, представленной заявителем:
- информации, позволяющей идентифицировать ГМО (вид, сорт, трансформационное событие);
- информации об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);
- информации об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);
- информации о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки);
- информации о ГМО (описание свойств, приобретенных растением в результате модификации, описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения и др.), характеристику различий с родительским организмом (способ размножения, способность к перекрестному опылению, устойчивость к стрессовым воздействиям и др.), характеристику генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО), характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы).
2.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании сведений, представленных заявителем, о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога по следующим параметрам:
- содержание белка;
- аминокислотный состав;
- содержание жира;
- жирнокислотный состав;
- углеводный состав;
- содержание витаминов;
- содержание макро- и микроэлементов;
- содержание биологически активных веществ;
- содержание аллергенов;
- содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.);
- содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов данного вида.
Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма.
2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида.
2.4. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки безопасности одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.); изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белка в эксперименте на грызунах и др.);
- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), - в случае если такие исследования проводились;
- результаты других токсикологических исследований.
2.5. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в т.ч. in vivo);
- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.) должны быть проведены в случае, если имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора.
2.6. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты определения пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро- и микронутриентов и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта);
- результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.
2.7. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований, проводится на основании сведений, представленных заявителем.
III. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
3.1. Экспертная оценка методов идентификации ГМО направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО.
3.2. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий;
- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;
- протоколы проведения анализов;
- описание праймеров;
- стандартные образцы состава и свойств.
IV. МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
4.1. Медико-генетическая оценка ГМО включает проверку присутствия одной или нескольких синтетических генетических конструкций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
4.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- описание молекулярной структуры одной или нескольких синтетических генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);
- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;
- протокол проведения анализа;
- описание праймеров;
- стандартные образцы состава и свойств.
V. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
5.1. Перечень и объем исследований по разделу V определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.
5.2. Изучаемые функциональные свойства:
- pH водной суспензии;
- растворимость;
- реологические свойства водных дисперсий;
- водоудерживающая и жироудерживающая способность;
- критическая концентрация гелеобразования;
- эмульсионная стабильность и др.
VI. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.
6.2. Гигиенические исследования ГМО включают определение показателей качества и безопасности:
6.2.1. Перечень показателей безопасности определяется на основании требований СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" для соответствующей группы продуктов.
Изучаемые показатели:
- содержание токсичных элементов;
- содержание микотоксинов;
- содержание пестицидов;
- содержание радионуклидов;
- содержание вредных примесей;
- микробиологические показатели;
- другие показатели (в случае необходимости).
6.2.2. Перечень показателей качества определяется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон.
6.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения.
6.3. Токсикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных:
6.3.1. Схема проведения эксперимента
------------------------------+-------------------------------------------- ¦Вид животных ¦ крысы линии Вистар ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Пол ¦ самцы ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Возраст ¦ 40 - 50 дней ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Исходная масса тела ¦ 70 - 80 г ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Количество животных в группе ¦ не менее 50 особей в каждой группе ¦ ¦в начале эксперимента ¦ ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Распределение по группам ¦Животных делят на 2 группы: ¦ ¦ ¦ группа "контроль" получает рацион с ¦ ¦ ¦ включением традиционного аналога ¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО; ¦ ¦ ¦ группа "опыт" получает рацион с включением¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Рацион ¦Пищевая и биологическая ценность рациона ¦ ¦ ¦полностью удовлетворяет физиологические ¦ ¦ ¦потребности животных ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Карантин ¦не менее 7-ми дней ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Условия содержания ¦Животные получают свободный доступ к корму ¦ ¦ ¦и воде; содержатся в отапливаемом, ¦ ¦ ¦вентилируемом помещении ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Продолжительность ¦ 180 дней ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Забор материала для ¦ На 30-й и 180-й дни эксперимента ¦ ¦гематологических, ¦ ¦ ¦биохимических, ¦ ¦ ¦морфологических исследований ¦ ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Количество животных, взятых ¦ Не менее 10/группу ¦ ¦на исследование ¦ ¦ ------------------------------+--------------------------------------------
6.3.2. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.
Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в табл. 1 - 2.
Таблица 1
Состав базового полусинтетического казеинового рациона
---------------------------+--------+-----T-------+--------+--------------- ¦ Ингредиенты ¦ Кол-во ¦Белок¦ Жиры ¦Углеводы¦ Калорийность ¦ ¦ +--------+-----+-------+--------+--------+-----+ ¦ ¦ г ¦ г ¦ г ¦ г ¦ ккал ¦ % ¦ +--------------------------+--------+-----+-------+--------+--------+-----+ ¦Казеин ¦ 25,0 ¦20,20¦ 0,38 ¦ - ¦ 84,22 ¦22,1 ¦ ¦Крахмал маисовый ¦ 58,0 ¦0,58 ¦ - ¦ 50,2 ¦ 203,12 ¦53,3 ¦ ¦Масло подсолнечное ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нерафинированное ¦ 5,0 ¦ - ¦ 4,99 ¦ - ¦ 44,91 ¦11,8 ¦ ¦Лярд ¦ 5,0 ¦ - ¦ 4,98 ¦ - ¦ 44,82 ¦11,8 ¦ ¦Солевая смесь <*> ¦ 4,0 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦Смесь в/р витаминов <**> ¦ 1,0 ¦ - ¦ - ¦ 1,0 ¦ 4,00 ¦ 1,0 ¦ ¦Смесь ж/р витаминов <***> ¦ 0,1 ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦Микрокристаллическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦целлюлоза ¦ 2,0 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ +--------------------------+--------+-----+-------+--------+--------+-----+ ¦ИТОГО ¦ 100,1 ¦20,78¦ 10,45 ¦ 51,2 ¦ 381,07 ¦ 100 ¦ ---------------------------+--------+-----+-------+--------+--------+------
--------------------------------
<*> Состав солевой смеси представлен в табл. 2.
<**> 1 г содержит: тиамина (B1) - 0,4 мг, рибофлавина (B2) - 0,6 мг, пиридоксина (B6) - 0,4 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг, пантотената кальция - 1,5 мг, фолиевой кислоты - 0,2 мг, цианкобаламина (B12) - 0,003 мг, викасола - 0,1 мг, L-метионина - 50 мг, глюкозы - до 1 г.
<***> 0,1 мл содержит: ретинола ацетата 800 ME, эргокальциферола - 70 ME, альфа-токоферола ацетата - 5 мг, подсолнечного масла - до 0,1 мл.
Таблица 2
Состав солевой смеси
----+--------------------------+----------------------------+-------------- ¦ N ¦ Название соли ¦ Химическая формула ¦Количество, г¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 1 ¦ Хлористый натрий ¦ NaCl ¦ 139,3 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+
¦ 2 ¦ Калий фосфорнокислый ¦ KH2PO4 ¦ 388,8 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 3 ¦ Магний сернокислый ¦ MgSO4 ¦ 57,4 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 4 ¦ Кальций углекислый ¦ CaCO3 ¦ 380,4 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 5 ¦ Железо сернокислое ¦ FeSO4 x 7H2O ¦ 26,4 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 6 ¦ Калий йодистый ¦ KI ¦ 0,77 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 7 ¦ Марганец сернокислый ¦ MnSO4 x 7H2O ¦ 4,55 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 8 ¦ Цинк сернокислый ¦ ZnSO4 x 7H2O ¦ 0,53 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ 9 ¦ Медь сернокислая ¦ CuSO4 x 5H2O ¦ 0,48 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦10 ¦ Кобальт хлористый ¦ CoCl2 x 6H2O ¦ 0,024 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦11 ¦ Натрий фтористый ¦ NaF ¦ 0,50 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦12 ¦ Алюмокалиевые квасцы ¦ K2SO4Al2(SO4)3 x 24H2O ¦ 0,11 ¦ +---+--------------------------+----------------------------+-------------+ ¦ ¦ ИТОГО ¦ ¦ 1000 ¦ ----+--------------------------+----------------------------+--------------
6.3.3. Исследуемые показатели:
6.3.3.1. Интегральные показатели
----------------------------------------------+---------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦Периодичность сбора данных ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦Общее состояние животных (внешний вид, ¦ каждые 2 дня ¦ ¦двигательная активность, состояние шерстного ¦ ¦ ¦покрова) ¦ ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦Поедаемость корма ¦ ежедневно ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦Масса тела ¦ каждые 7 дней ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦Масса внутренних органов (головной мозг, ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, ¦ эксперимента ¦ ¦печень, почки, надпочечники, семенники) ¦ ¦ ----------------------------------------------+----------------------------
6.3.3.2. Гематологические показатели
----------------------------------------------+---------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦Периодичность сбора данных ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦- концентрация гемоглобина; ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦- гематокрит; ¦ эксперимента ¦ ¦- общее количество эритроцитов; ¦ ¦ ¦- средний объем эритроцита (СОЭ); ¦ ¦ ¦- среднее содержание гемоглобина в эритроците¦ ¦ ¦(ССЭ); ¦ ¦ ¦- средняя концентрация гемоглобина в ¦ ¦ ¦эритроците (СКЭ); ¦ ¦ ¦- общее количество тромбоцитов; ¦ ¦ ¦- общее количество лейкоцитов; ¦ ¦ ¦- дифференцированный подсчет лейкоцитов ¦ ¦ ¦(нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты,¦ ¦ ¦базофилы) ¦ ¦ ----------------------------------------------+----------------------------
6.3.3.3. Биохимические показатели
6.3.3.3.1. Общий биохимический анализ крови
Материал для исследований: сыворотка крови
----------------------------------------------+---------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦Периодичность сбора данных ¦ +---------------------------------------------+---------------------------+ ¦- аланинаминотрансфераза (АЛТ); ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦- аспартатаминотрансфераза (ACT); ¦ эксперимента ¦ ¦- желчные кислоты; ¦ ¦ ¦- фосфатаза щелочная; ¦ ¦ ¦- билирубин общий; ¦ ¦ ¦- билирубин прямой; ¦ ¦ ¦- белок общий; ¦ ¦ ¦- альбумин; ¦ ¦ ¦- глобулин; ¦ ¦ ¦- креатинин; ¦ ¦ ¦- глюкоза; ¦ ¦ ¦- альфа-амилаза; ¦ ¦ ¦- липаза; ¦ ¦ ¦- лактатдегидрогеназа; ¦ ¦ ¦- общие липиды; ¦ ¦ ¦- триглицериды; ¦ ¦ ¦- холестерин; ¦ ¦ ¦- холинэстераза; ¦ ¦ ¦- мочевина; ¦ ¦ ¦- хлориды; ¦ ¦ ¦- натрий; ¦ ¦ ¦- фосфор; ¦ ¦ ¦- калий ¦ ¦ ----------------------------------------------+----------------------------
6.3.3.3.2. Общий анализ мочи. Материал для исследований: моча
---------------------------------------------+----------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦ Периодичность сбора данных ¦
+--------------------------------------------+----------------------------+ ¦- суточный диурез; ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦- цвет и прозрачность; ¦ эксперимента ¦ ¦- относительная плотность; ¦ ¦ ¦- pH; ¦ ¦ ¦- белок; ¦ ¦ ¦- глюкоза; ¦ ¦ ¦- креатинин ¦ ¦ ---------------------------------------------+-----------------------------
6.3.3.3.3. Системные биомаркеры
6.3.3.3.3.1. Система антиоксидантной защиты
---------------------------------------------+----------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦ Периодичность сбора данных ¦ +--------------------------------------------+----------------------------+ ¦Активность ферментов антиоксидантной защиты.¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦Материал для исследований: эритроциты ¦ эксперимента ¦ ¦ - глутатионредуктаза; ¦ ¦ ¦ - глутатионпероксидаза; ¦ ¦ ¦ - супероксиддисмутаза; ¦ ¦ ¦ - каталаза; ¦ ¦ +--------------------------------------------+ ¦ ¦Содержание продуктов перекисного окисления ¦ ¦ ¦липидов. Материал для исследований: кровь, ¦ ¦ ¦печень ¦ ¦ ¦ - малоновый диальдегид ¦ ¦ ---------------------------------------------+-----------------------------
6.3.3.3.3.2. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------+----------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦ Периодичность сбора данных ¦ +--------------------------------------------+----------------------------+ ¦Активность ферментов 1-й и 2-й фазы ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦метаболизма ксенобиотиков ¦ эксперимента ¦ ¦ - общее содержание цитохрома Р-450; ¦ ¦ ¦ - 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; ¦ ¦ ¦ - 7-пентоксирезоруфнн-О-деэтилаза; ¦ ¦ ¦ - UDP-глюкуронозилтрансфераза; ¦ ¦ ¦ - глутатионтрансфераза ¦ ¦ ---------------------------------------------+-----------------------------
6.3.3.3.3.3. Система регуляции апоптоза
1) стабильность мембран лизосом
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------+----------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦ Периодичность сбора данных ¦ +--------------------------------------------+----------------------------+ ¦Общая и неседиментируемая активность ¦ На 30-й и 180-й дни ¦ ¦ферментов лизосом ¦ эксперимента ¦ ¦ - бета-галактозидаза; ¦ ¦ ¦ - бета-глюкуронидаза; ¦ ¦ ¦ - арилсульфатазы A и B ¦ ¦ ---------------------------------------------+-----------------------------
2) другие методы
6.3.3.4. Морфологические исследования
------------------------------+-------------------------------------------- ¦ Исследуемые органы ¦ Методы исследований ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦- кожа; ¦На 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый ¦ ¦- головной мозг; ¦ забор) ¦ ¦- сердце; ¦ ¦ ¦- аорта; ¦1. Макроскопические исследования ¦ ¦- селезенка; ¦2. Микроскопические исследования: ¦ ¦- легкие; ¦ а) обзорные гистологические исследования ¦ ¦ ¦3. Морфометрический анализ ¦ ¦ +-------------------------------------------+ ¦- лимфатические узлы; ¦ Вскрытие погибших в течение эксперимента ¦ ¦- тимус; ¦ животных (внеплановый забор) ¦ ¦- щитовидная железа; ¦ ¦ ¦- гипофиз; ¦1. Макроскопические исследования ¦ ¦- ЖКТ: желудок, тонкая и ¦2. Микроскопические исследования (перечень ¦ ¦ толстая кишки; ¦исследуемых органов может быть сокращен до ¦ ¦- печень; ¦минимально необходимого для установления ¦ ¦- поджелудочная железа; ¦причины смерти): ¦ ¦- почки; ¦ а) обзорные гистологические исследования ¦ ¦- семенники +-------------------------------------------+ ¦ ¦ Дополнительные исследования ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦1. Микроскопические исследования: ¦ ¦ ¦ а) гистохимические исследования; ¦ ¦ ¦ б) иммуногистохимические исследования ¦ ¦ ¦клеточных популяций и их производных. ¦ ¦ ¦2. Электронно-микроскопические ¦ ¦ ¦исследования ¦ ------------------------------+--------------------------------------------
6.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий СВА и С57В1/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:
1) действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;
2) действие на клеточное звено иммунитета - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;
3) действие как сенсибилизирующего агента - в тесте чувствительности к гистамину;
4) действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).
В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий СВА и С57В1/6.
Таблица 3
Характеристики мышей линий СВА и С57В1/6
-------------------------+------------------------------------------------- ¦ Действующий фактор ¦ Линия мышей ¦ ¦ +------------------------+-----------------------+ ¦ ¦ СВА ¦ С57В1/6 ¦ +------------------------+------------------------+-----------------------+ ¦Эритроциты барана ¦ высокочувствительны ¦ низкочувствительны ¦ +------------------------+------------------------+-----------------------+ ¦Гиотамин ¦ не чувствительны ¦ чувствительны ¦ +------------------------+------------------------+-----------------------+ ¦Salmonella typhimurium ¦ не чувствительны ¦ чувствительны ¦ -------------------------+------------------------+------------------------
6.4.1. Схема проведения эксперимента
------------------------+-------------------------------------------------- ¦Вид животных ¦ мыши линий СВА и С57В1/6 ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Пол ¦ самцы ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Возраст ¦ половозрелые ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Исходная масса тела ¦ 18 - 20 г ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Распределение по ¦Животных каждой линии делят на 2 группы: ¦ ¦группам ¦ группа "контроль" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ традиционного аналога исследуемого ГМО; ¦ ¦ ¦ группа "опыт" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Рацион <*> ¦Пищевая и биологическая ценность рациона ¦ ¦ ¦полностью удовлетворяет физиологические ¦ ¦ ¦потребности животных ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Карантин ¦не менее 7-ми дней ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Условия содержания ¦Животные получают свободный доступ к корму и ¦ ¦ ¦воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом ¦ ¦ ¦помещении ¦ ------------------------+--------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента ведутся наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.
6.4.2. Исследуемые показатели:
1) действие ГМО на гуморальное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 20 животных) и опытной (не менее 20 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн. клеток/мл). Забор крови для исследований проводится на 7-й, 14-й и 21-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют в реакции гемагглютинации общепринятым методом. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.
2) действие ГМО на клеточное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (2 млн. клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (1 млрд. клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-ного раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР).
3) действие ГМО как сенсибилизирующего агента к гистамину.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей.
4) действие ГМО на естественную резистентность мышей к S. typhimurium изучают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 30 животных) и опытной (не менее 30 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов.
6.5. Аллергологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка.
6.5.1. Схема проведения эксперимента
------------------------+-------------------------------------------------- ¦Вид животных ¦ Крысы линии Вистар ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Пол ¦ Самцы ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Возраст ¦ Половозрелые ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Исходная масса тела ¦ 150 - 180 г ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Количество животных в ¦ не менее 25 особей в каждой группе ¦ ¦группе в начале ¦ ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Распределение по ¦Животных делят на 2 группы: ¦ ¦группам ¦ группа "контроль" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ традиционного аналога исследуемого ГМО; ¦ ¦ ¦ группа "опыт" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Рацион (табл. 4) ¦Пищевая и биологическая ценность рациона ¦ ¦ ¦полностью удовлетворяет физиологические ¦ ¦ ¦потребности животных. Рацион не содержит яичного ¦ ¦ ¦белка ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Карантин ¦не менее 7-ми дней ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Условия содержания ¦Животные получают свободный доступ к корму и ¦ ¦ ¦воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом ¦ ¦ ¦помещении ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Продолжительность ¦ 29 дней ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Забор материала для ¦ На 29-й день эксперимента ¦ ¦исследований ¦ ¦ ------------------------+--------------------------------------------------
Таблица 4
Стандартный рацион вивария
-------------------------------+------------------------------------------- ¦ Ингредиент ¦ Масса, г на 1 крысу в день ¦ +------------------------------+------------------------------------------+
¦Крупа овсяная ¦ 2,5 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Зерновая смесь ¦ 14,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Хлеб 2 сорт ¦ 4,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Творог ¦ 2,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Рыбная мука ¦ 0,5 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Мясо 2 категория ¦ 4,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Морковь ¦ 8,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Зелень ¦ 8,0 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Рыбий жир ¦ 0,1 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦Дрожжи ¦ 0,1 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦NaCl ¦ 0,15 ¦ +------------------------------+------------------------------------------+ ¦ Основные нутриенты ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Белок ¦ 3,69 ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Жир ¦ 1,28 ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Углеводы ¦ 12,42 ¦ +-----------------------------+-------------------------------------------+ ¦Энергия, ккал ¦ 76,0 ¦ ------------------------------+--------------------------------------------
6.5.2. Исследуемые показатели:
На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.
Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием пакетов программ Excel и SPSS 11.5.
6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет).
6.6.1. Схема проведения эксперимента
------------------------+-------------------------------------------------- ¦Вид животных ¦ мыши линии С57В1/6 ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Пол ¦ самцы ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Возраст ¦ половозрелые ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Исходная масса тела ¦ 18 - 20 г ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Количество животных в ¦ не менее 15 особей в каждой группе ¦ ¦группе в начале ¦ ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Распределение по ¦Животных делят на 2 группы: ¦ ¦группам ¦ группа "контроль" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ традиционного аналога исследуемого ГМО; ¦ ¦ ¦ группа "опыт" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Рацион <*> ¦Пищевая и биологическая ценность рациона ¦ ¦ ¦полностью удовлетворяет физиологические ¦ ¦ ¦потребности животных ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Карантин ¦не менее 7-ми дней ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Условия содержания ¦Животные получают свободный доступ к корму и ¦ ¦ ¦воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом ¦ ¦ ¦помещении ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Продолжительность ¦ 30 дней ¦ ¦эксперимента ¦ ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Забор материала для ¦ На 30-й день эксперимента ¦ ¦исследований ¦ ¦ ------------------------+--------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.6.2. Исследуемые показатели:
1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах.
2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.
Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 "ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.
6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных и включают:
1) изучение влияния на генеративную функцию;
2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий, регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития.
6.7.1. Схема проведения эксперимента
------------------------+-------------------------------------------------- ¦Вид животных ¦ крысы линии Вистар ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Пол ¦ самцы, самки ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Возраст ¦ 40 - 50 дней ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Исходная масса тела ¦ 70 - 80 г ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Количество животных в ¦ не менее 50 особей в каждой группе ¦ ¦группе в начале ¦ /\ ¦ ¦эксперимента ¦ / ¦ ¦ ¦ 30 о, 20 о ¦ ¦ ¦ + ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Распределение по ¦Животных делят на 2 группы: ¦ ¦группам ¦ группа "контроль" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ традиционного аналога исследуемого ГМО; ¦ ¦ ¦ группа "опыт" получает рацион с включением ¦ ¦ ¦ исследуемого ГМО ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Рацион <*> ¦Пищевая и биологическая ценность рациона ¦ ¦ ¦полностью удовлетворяет физиологические ¦ ¦ ¦потребности животных ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Карантин ¦не менее 7-ми дней ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Начало опытного ¦за 45 - 50 дней перед первым спариванием ¦ ¦вскармливания ¦ ¦ +-----------------------+-------------------------------------------------+ ¦Условия содержания ¦Животные получают свободный доступ к корму и ¦ ¦ ¦воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом ¦ ¦ ¦помещении ¦ ------------------------+--------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.7.2. Исследуемые показатели:
6.7.2.1. Интегральные показатели
---------------------------------------------+----------------------------- ¦ Изучаемые показатели ¦ Периодичность сбора данных ¦ +--------------------------------------------+----------------------------+ ¦Общее состояние животных (внешний вид, ¦ каждые 2 дня ¦ ¦двигательная активность, состояние шерстного¦ ¦
Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:
Федеральное